混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术

2017；38:117-126；nat med 2003；9:118-122；anal chem 2019；91:8162-8169]，但混合物中组分数量越大则多数化合物丰度都越低，因此到目前为止发现痕量配体仍然是一个艰巨的技术挑战。
5.为可靠地识别混合物中痕量高价值配体，一个极其灵敏的检测方法和/或一个强效的选择性富集方法是必须的。到目前为止，在混合物中以超高灵敏度检测微量配体的唯一技术是dna编码技术[med res rev 2018；38:1255-1294；angew chem int ed engl 2015；54:7924-7928；at rev drug discov 2017；16:131-147；annu rev biochem 2018；87:479-502]，这本质上是一种使用可扩增dna片段作为标签的标记技术。即使不考虑标记过程中的人力和成本，小分子化合物dna标签比化合物本身大得多，这必然会改变小分子与蛋白质靶相互作用而导致高价值配体丢失。值得注意的是，dna编码方法不适用于未知化学结构但已知药理作用的天然产物粗提物，也不适用于任何不含链接dna标签所需官能团的活性化合物混合物[j am chem soc 2019；141:17057-17061；curr opin chem biol 2015；26:80-88]。混合物中亲和力较高但丰度极低的核酸适配子和多肽展示库，都可以通过选择性指数富集(selex)技术通过迭代竞争结合和扩增富集组分实现快速富集[angew chem int ed engl 2019；58:9254-9261；nature 1990；346:818-822；chem commun(cambridge,england)2019；55:13330-13341；biotechnol adv 2018；36:1847-1854；biotechnol adv 2019；37:28-50；mikrochim acta 2020；187:618]，但selex不适用于不能放大或复制的配体。
[0006]
发明人团队建立了一种简便方法来快速比较混合物中丰度相当配体的亲和力[bmc biotechnol 2011；11:44；microchimacta 2012；176:243-249]；其核心步骤包括配体x与参考配体a与磁珠固定化蛋白质靶竞争结合，磁分离靶蛋白-配体复合物，有机溶剂变性靶蛋白提取结合配体，以及混合样品和结合配体提取物hplc-ms分析。参考配体a及候选配体x回收率分别为rra及rrx；竞争结合体系配体a和配体x结合率足够低，如不超过10％，则有eq.(1)。基于此核心步骤，将固定化蛋白靶用量指数递减，将上一轮筛选所得结合配体用于下一轮竞争结合即迭代筛选且使可检测配体每轮平均结合率不超过10％，高亲和力配体在迭代筛选过程中实现亲和力驱动指数富集eq.(2)(adee，附图1)。
[0007][0008][0009]
本发明的核心创新点，是设置固定化靶蛋白磁珠用量的指数递减序列或指数递增序列，使得将当前轮竞争结合筛选所得结合配体混合物用于下轮竞争结合时可定量配体的平均结合率接近于满足eq.(1)有效所要求。理论上，设置固定化靶蛋白磁珠用量的指数递减序列或指数递增序列仅需三个参数：起始值(最大值或最小值)、衰减比例r或递增比例1/r、迭代筛选轮数。确定这三个参数就成为在实践中应用本发明所述adee技术的关键。实际上，确定压缩比例需知道可定量配体平均回收率rrx、使eq.(1)的可定量配体平均结合率上限tr；确定此序列的最小值需要优化hplc-ms系统以获得对常见配体的实际检测下限且越低越好。实施本发明的核心是，基于混合物样品中可定量组分(含外加参考配体)实测平均回收率rrx或其近似值(40％，对常见配体通用的近似回收率)，满足前述eq.(1)有效性对竞
争结合体系中配体平均结合率的上限tr，所设定迭代筛选轮数k(取决于意欲探索的高亲和力配体数量对参考配体的相对丰度及相对亲和力)，所用hplc-ms系统对常见配体的定量下限，设置磁珠固定化靶蛋白用量的指数递减序列或递增序列，及同等平行的竞争反应体系总体积指数递减序列，使上轮结合配体混合物用于本轮的迭代竞争结合时结合率也尽可能满足eq.(1)的要求，从而使初始混合物样品中高亲和力配体随着迭代筛选在结合配体混合物中实现亲和力驱动指数富集即adee。
[0010]
将靶蛋白固定在磁珠上表面后，磁珠质量和靶蛋白量间具有唯一关联。为方便，以下都用固定化靶蛋白磁珠用量代替磁珠固定化靶蛋白用量。固定化靶蛋白磁珠用量的指数递减序列最小值mmb，也就是最后轮所用固定化靶蛋白磁珠量易确定，其主要取决于最后轮结合配体混合物中预期发现的高亲和力配体的数量m、用hplc-ms检测的定量下限及经溶剂a提取和浓缩后回收率rrx三个参数。对未知高亲和力配体，适合假定其平均回收率为40％。用hplc-ms定量不同成分的下限有差异，为方便则假定预期的高亲和力配体的定量检测下限都为20pmole；这对于多数的hplc-ms检测系统能达到。为统一描述，设最后一轮迭代筛选所得结合配体混合物中共有可定量配体m个，则最后轮迭代筛选所得结合配体摩尔总量q≈m*20pmole。除非是优化先导配体结构的组合合成集中库，选定参考配体后很难在一个小规模混合物中发现超过5个更高亲和力配体。因此，q取100pmole已有冗余。再据固定化靶蛋白每个配体结合位点的平均分子量mw、磁珠固定化靶蛋白的容量im、固定化靶蛋白中结合配体位点活性的保留比例(通常假定为50％；链亲和素固定化能保留75％)。因此，实现adee所需的固定化靶蛋白磁珠用量的指数递减/递增序列的一个端点mmb＝q
÷
rrx
÷
0.5
×
mw
÷
im。
[0011]
确定固定化靶蛋白磁珠用量序列的递减或递增比例易于确定。此递增比例或递减比例取决于可定量配体经加热提取及浓缩后的回收率rrx、使eq.(1)有效对配体平均结合率上限tr的要求。据此前通过磁分离结合配体测定混合物中未知含量配体亲和力的方法[bmc biotechnol 2011；11:44；microchimacta 2012；176:243-249]，可将此结合率或混合物中配体平均结合率上限tr设在10％。当然，设在20％也是合适的；但tr设的过高，每轮竞争结合的富集效应减弱，最终的富集效应也会减小。tr过低则固定化靶蛋白磁珠用量序列的递减或递增比例非常大，完成相同轮数迭代筛选时固定化靶蛋白磁珠成本难承受。考虑混合物中配体的平均回收率rrx或通用近似回收率40％，则此递增比例r＝1/tr/rrx。因此，通用的近似递增比例是20～25倍，对应近似压缩比例是1/20～1/25。
[0012]
最后需要确定迭代筛选的轮数。理论上，实践中adee可用迭代筛选轮数可很大。但限于对固定化靶蛋白磁珠的消耗成本(来自重组表达靶蛋白及所用磁珠)随着迭代筛选轮数成指数增长，迭代筛选轮数过多则消耗成本难以承受，实际实施的迭代筛选轮数很难超过5轮。只有在确认混合物有明确生化药理活性，即存在未知的超高亲和力配体而已发现的配体均不满足预期时，才适宜进行接近5轮的迭代筛选探索是否新的痕量高亲和力配体，否则通常只进行不超3轮迭代筛选。据应用实施例所述，当混合物中有价值配体亲和力为参考配体的2倍而丰度仅有1％时，即使经过2轮迭代筛选也能实现有效富集而检出。所以，将有药理活性的天然产物混合物初步分级以减少其组分数量并相应增加高亲和力配体丰度、控制组合合成时各构建模块的投入量，可使混合物中组分的数量限制在1000种以内。这种情况下，所用参考配体在混合物中配体总摩尔量中含量达到0.1％，即使仅迭代竞争结合富集
3轮，也能显著提升发现含量只有参考配体1％左右而亲和力高1倍以上的痕量高亲和力配体。所以，进行迭代竞争结合筛选实现adee的轮数k一般不超过5轮，常规应用的迭代筛选轮数k不超3轮。
[0013]
药用候选配体须有适度脂溶性才能有更好的生物利用度及在体内的组织细胞快速分布，作为研究工具的配体也要有适度的脂溶性才能透过细胞膜。因此，高价值配体常有一定脂溶性。在迭代竞争结合筛选时，为了降低候选配体对磁珠的非特异吸附，就需要特殊的磁珠。另外，为可靠检出迭代筛选最后轮所得结合配体混合物中的潜在高亲和力配体，对最后轮所得结合配体混合物需要扫描所含成分的阳离子及阴离子，并通过选择性离子检测sim来高灵敏度定量。为了便于可靠鉴定结合配体混合物中的潜在高亲和力配体，就需要来自磁珠自身的用溶剂能提取的小分子物质尽量少。因此，需要特殊的磁珠才便于实现adee。发明人建立了微纳米颗粒表面兼性离子对高密度修饰专利技术(中国发明专利zl201610963764.x.授权日2017-10-17；美国发明专利us patent,10385013,授权日2019-08-20)；用此专利技术已量产表面用兼性离子对多层共价修饰且携带不短于6原子柔性有机连接臂羧基的亲水磁珠msp-cooh-z1及msp-cooh-f1；在这两种羧基磁珠表面饱和偶联链亲和素，量产对应的链亲和素磁珠msp-sav-z1及msp-sav-f1(http://www.fbdbio.com)。msp-cooh-z1表面为仲/叔胺与大量无连接臂脂肪族羧基构成的小体积兼性离子对，及少量带长直链柔性有机连接臂的脂肪族羧基；msp-cooh-f1表面为叔胺及季胺与丙基磺酸组成的小体积兼性离子对，及少量带柔性有机连接臂的脂肪族羧基；这两种羧基磁珠对水溶蛋白和小分子化合物的非特异吸附都很低(nanosci nanotech lett 2019；11,1547-1581)，其表面修饰过程在二甲基甲酰胺中进行，故所含常用有机溶剂能提取的小分子杂质很少。所以，这类亲水磁珠固定化靶蛋白有望用于实现混合物中高亲和力配体的adee。
[0014]
另外，有适度脂溶性配体非特异吸附严重依赖于其浓度。降低竞争结合体系中候选配体浓度，有利于降低候选配体的潜在非特异吸附，降低其对最后轮所得结合配体混合物中潜在高亲和力配体定性鉴定(找到其分子离子峰或次级峰用选择性离子监测sim进行定量)产生的干扰。实现adee的目标是发现高亲和力的配体，亲和力越低的配体其结合率对浓度越敏感。通常药用配体亲和力(解离常数)宜在10nmol/l及以下。将靶蛋白结合位点浓度设在20nmole/l附近实施迭代筛选。msp-cooh-z1及msp-cooh-f1固定化链亲和素(单个位点分子量mw～16kda)的容量接近20mg蛋白/g磁珠、固定化链亲和素对小分子生物素衍生物的结合容量保留近70％。假定常见酶、受体类可溶性靶蛋白单个配体结合位点mw接近50kda，在上述磁珠表面的固定化容量相当且固定化后保留50％的结合位点(固定化后结合位点比活性仅保留50％)，则靶蛋白结合位点浓度设在20nmole/l要求固定化靶蛋白的浓度接近1.0mg/l(这就是固定化靶蛋白的低浓度)，对应固定化靶蛋白磁珠的浓度应接近50mg/l。在此情况下，只要解离常数低于0.10μmol/l(即有适度亲和力)的各种候选配体的总摩尔浓度超过1.0μmol/l，则能实现的固定化靶蛋白接近饱和结合。假定混合物样品中含有近1000种候选配体，其中有适度亲和力配体仅有10种且丰度接近均值，将配体的总浓度设置在1.0mmol/l左右就属于很高的浓度且也能满足所设定的要求。理论上，只有要在最后所得结合配体混合物中鉴定结合配体时可靠，优化色谱条件采用sim检测模式能给出结合配体的可靠定量以监测其是否能实现adee，从而证明其亲和力高于参考配体。考虑到候选配体的非特异吸附及混合物中高亲和力配体数量少且亲和力有限，所用的固定化蛋白磁珠的浓
度就不宜超过100mg/l；这就是本发明所述固定化靶蛋白磁珠的低浓度。


技术实现要素：

[0015]
用磁珠固定化靶蛋白后磁力分离结合配体是常规技术，迭代筛选也是成熟思路。但是，对混合物中痕量高价值配体，如何实现高效选择性富集仍是技术挑战。本发明的核心，是设置磁珠固定化靶蛋白用量的指数递减序列及相应竞争结合反应体系体积的指数递减序列，通过迭代竞争结合实现混合物样品中靶蛋白高亲和力配体的指数富集，从而快速发现混合物中痕量高价值配体。发明内容如下：
[0016]
混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于：磁珠固定靶蛋白；首轮筛选，过量混合物样品竞争结合低浓度固定化靶蛋白、磁分离结合配体、溶剂a加热变性靶蛋白提取结合配体、浓缩；此后，以10除以混合物中可定量配体回收率均值为压缩比例指数递减固定化靶蛋白用量，将上轮筛选所得结合配体用于竞争结合、磁分离结合配体、溶剂a加热变性靶蛋白提取结合配体、浓缩，即实施迭代筛选；持续迭代筛选所得结合配体混合物中，高亲和力配体丰度随迭代筛选次数呈指数增长，即高亲和力配体实现指数数富集。
[0017]
进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于：每轮竞争结合反应体系中可定量配体平均结合率不超过设定界限tr，为此需将竞争结合体系中磁珠固定化靶蛋白用量成指数递减进行压缩，具体压缩比例用r表示并在上下20％范围内波动；r取决于所设定的tr及可定量配体经过溶剂a加热提取及浓缩后的平均回收率rrx，定量关系是r≈1/tr/rrx并上下波动20％；具有通用性的tr默认值设为10％，可定量配体的平均回收率rrx经过实验测定或将其默认值设为通用性的40％；tr及rrx都取默认值则r为25并上下波动20％，即在20～30之间。
[0018]
进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，所用溶剂a，特征在于：易于溶解样品中成分、沸点不高于100摄氏度、在比其沸点低10摄氏度下靶蛋白快速变性，具体包括有机溶剂、缓冲液、及这二者的混合物；属于溶剂a的有机溶剂，指，1)与水不混用但水的溶解度不低于10％的有机溶剂，代表为正丁醇，及满足此要求有机溶剂的任意比例混合物，2)与水混溶有机溶剂，代表为乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃，及满足此要求有机溶剂的任意比例混合物，3)水的溶解度大于10％体积比有机溶剂同与水混溶有机溶剂的任意比例混合物；属于溶剂a的缓冲液，指易于溶解样品且维持样品成分稳定的缓冲液，缓冲介质可为有机成分或无机成分；所述有机溶剂与缓冲液的混合物中，有机溶剂的含量比例上限是混合物能形成均匀的溶液。
[0019]
进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，所用材料及试剂，特征在于：
[0020]
第一，固定化靶蛋白适用磁珠有两类：a)非蛋白亲水磁珠，用二甲基甲酰胺或二甲亚砜加热洗涤除去有机小分子杂质再固定活性靶蛋白、每g磁珠固定化靶蛋白容量im不小于10mg/g；2)蛋白磁珠，代表是表面固定亲和素、链亲和素或脱卤酶为工具蛋白的亲水磁珠；制备这类蛋白磁珠所用非蛋白磁珠也用二甲基甲酰胺或二甲亚砜加热洗涤除去所含有机小分子物质，再固定化工具蛋白；
[0021]
第二，竞争结合体系的结合缓冲液：ph在5.0到9.0间、含《2.0m的nacl或kcl、与固定化靶蛋白及磁珠都相容即不会造成靶蛋白失活也不造成磁珠消磁或结构破坏。
[0022]
进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于，平均回收率如下测定：
[0023]
第一，原始混合物样品为样品0，形态为固体或液体，此后实施本发明过程中其所含成分都不用或无法用现有方法复制或放大；hplc-ms定量下限不高于30pmol且按下述流程所测定的回收率不低于10％者为参考配体；样品0中无合适参考配体，则外加已知量及亲和力的参考配体得加工后样品0；
[0024]
第二，样品0，用溶剂a溶解并进一步稀释到总质量浓度～0.05g/l，得样品2；将样品2在不超过溶剂a沸点且低于90摄氏度下加热不超过3小时、减压浓缩去有机溶剂或冷冻干燥去水、固体残留物溶于不超过供测试样品2总体积5％的溶剂a中，得候选配体的浓缩结合物0；
[0025]
第三，hplc-ms测定浓缩结合物0及样品2中可定量成分；样品2及浓缩结合物0中，hplc-ms都可定量物质分别编号1，2，3...i，考虑浓缩效应计算这些成分经在溶剂a中加热及浓缩后回收率分别为rr1，rr2，rr3，
…
，rri；可定量成分回收率算术均值为实验测定的rrx。
[0026]
进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，实施所需参数，特征如下：
[0027]
第一，优化hplc-ms体系使各成分定量下限不高于20pmole；经最后轮迭代竞争结合所得结合配体的浓缩结合物中所含hplc-ms可定量成分共m个，可定量配体总摩尔量q≈m*20pmole；最后轮迭代竞争结合所得浓缩结合物中可定量配体总数默认不超过5，故q上限默认为100pmole，
[0028]
第二，最后轮迭代竞争结合所用固定化靶蛋白磁珠最小用量mmb：靶蛋白中每个配体结合位点平均分子量mw单位为μg/nmol、靶蛋白固定化后仅50％结合位点保留活性、磁珠对靶蛋白固定化容量im、可定量配体平均回收率为rrx，则mmb＝q
÷
rrx
÷
0.5
×
mw
÷
im，且单位换算成μg；
[0029]
第三，迭代竞争结合筛选所需轮数k：对亲和力为参考配体2倍的候选配体x，其在样品中相对参考配体的丰度接近1％则仅需富集2轮、丰度接近0.1％则需富集5轮；相对亲和力越高，从相同起始丰度混合物中富集到参考配体的相同丰度所需迭代筛选轮数越少；样品0或外加参考所得加工后样品0中，候选配体相对参考配体的丰度越高则富集高亲和力配体所需迭代筛选轮数越少；实践中，对未知药理活性混合物k默认取值为2，对已知药理活性混合物k默认取值为不超过5；
[0030]
第四，以最后轮固定化靶蛋白磁珠用量为mmb，据此计算固定化靶蛋白磁珠用量从首轮到最后一轮的指数递减序列为mmb*r
k-1
，mmb*r
k-2
，mmb*r
k-3
，
…
，mmb。
[0031]
进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，实施过程，特征如下：
[0032]
第一，样品0，用结合缓冲液溶解其全部成分且稀释到总质量浓度～1.0g/l，得样品1；样品0中成分在结合缓冲液中溶解性差，则加溶剂a助溶并稀释到总质量浓度～1.0g/l的溶液，得样品1；
[0033]
第二，设置首轮竞争结合体系：首轮竞争结合体系含固定化靶蛋白磁珠总量为计算所得指数递减序列的最大者，磁珠质量浓度不超过100mg/l，结合缓冲液总体积为v1，来自样品1的参考配体当量超过所用磁珠固定靶蛋白结合位点摩尔量的5倍；在竞争结合体
系，样品总质量浓度不超过其溶解度的30％，样品1中含有机溶剂时降低其在竞争结合体系的终浓度使来自样品的有机溶剂不超过0.5％；
[0034]
第三，基本筛选流程为：室温下温和混合结合反应10到60min；磁分离靶蛋白-配体复合物、用结合缓冲液温和洗涤磁珠、用溶剂a将洗涤后磁珠悬浮后在90摄氏度下且比溶剂a沸点低10度下加热变性蛋白提取结合配体；去磁珠，将结合配体液减压浓缩或冻干浓缩，得结合配体的浓缩结合物；
[0035]
第四，设置迭代竞争结合反应体系：本轮的竞争结合反应体系总体积vi，在上轮的竞争结合反应体系总体积v
i-1
基础上压缩r倍，即vi＝v
i-1
÷
r；在竞争结合反应体系，固定靶蛋白磁珠的质量浓度与上轮相当即波动小于20％，而固定化靶蛋白磁珠用量为上轮磁珠用量的1/r；将上轮所得结合配体的浓缩结合物用于竞争结合，按基本筛选流程实施，直到进行完所设定的迭代筛选轮数k；
[0036]
第五，对最后所得结合配体的浓缩结合物，用hplc-ms扫描确定可检测成分，用这些成分的hplc-ms特征定量跟踪其在迭代筛选所得结合配体浓缩结合物中的含量变化，确认其富集效应。
[0037]
再进一步，所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，适用的混合物对象，特征如下：
[0038]
第一，不能以现有方法进行放大或复制的小分子配体混合物、大分子配体的混合物、大分子配体与小分子配体的混合物；
[0039]
第二，未用任何方法进行放大或复制的小分子配体混合物、大分子配体的混合物、大分子配体与小分子配体的混合物。
[0040]
理论上，adee对混合物样品中的高丰度及低丰度配体都有效。因为对混合物中未知亲和力及丰度的混合配体，无法使得每个配体的结合率都低于满足eq.(1)所需上限，只能使用平均结合率满足eq.(1)的要求，从而使结合配体用于下轮迭代筛选时产生尽可能高选择性富集效应。候选配体及参考配体的结合率都低于10％能使eq.(1)有效。相应，磁珠固定化靶蛋白用量就需按照10除以平均结合率rrx为比例进行压缩；这就是本发明的核心创新点。
[0041]
本领域专业人员应该明白，如假定满足eq.(1)要求的候选配体及参考配体的结合率上限tr设在20％，则磁珠固定化靶蛋白用量的递减压缩比例r为5除以平均结合率rrx。实践中所用磁珠固定化靶蛋白用量可以合理波动。只要迭代筛选过程中固定化靶蛋白磁珠用量急剧递减以满足eq.(1)对候选配体结合率的要求，就在本发明的保护范围内，而不必要求固定化靶蛋白磁珠用量指数递减。
[0042]
本发明适用的对象，是无法用现有方法进行或没有进行复制或扩增放大的配体，并不限于小分子配体；也就是说，即使配体(如展示的蛋白配体/多肽)可复制或扩增放大而实施过程中没有进行复制或扩增放大，也可以用本发明所述的设计思路实现混合物中痕量高亲和力/高价值配体的指数富集。
附图说明
[0043]
图1.筛选过程示意图
[0044]
图2.生物素衍生物混合物的adee筛选
[0045]
图3.人工添加甲氨蝶呤衍生物混合物的adee筛选
[0046]
图4.组合合成甲氨蝶呤衍生物混合物的adee筛选
具体实施方式
[0047]
实施例1.生物素衍生物混合物的adee筛选
[0048]
n-采用链霉亲和素磁球
tm
顺磁性粒子(smpp、promega)，人工混合合成所得纯化生物素衍生物，包括n-生物素基环己胺(bcha)、n
’‑
生物素-n-(1-萘基)-乙二胺(bneda)、n-生物素基苄胺(bbza)和n
’‑
生物素-n-丹磺酰乙二胺(bdeda)。为制备天然产物粗提物，1g川芎汤片用50ml甲醇在500℃超声提取50min，提取液经0.22μm膜过滤，浓缩至5ml甲醇中。混合物a由bbza、bcha、bdeda和bneda以100：10：10：1的比例与天然产物甲醇提取物按质量比配制而成，使甲醇提取物各成分信号强度与生物素衍生物成分的hplc-ms信号相当。在第一轮中，在100ml的竞争结合体系中使用5.0ml的smpp(结合容量低于30nmol和来自混合物a的～300nmol生物素衍生物。结合配体用甲醇1ml提取浓缩后用于第二轮筛选，第二轮用0.20ml的smpp加入4.0ml的竞争结合体系中，结合配体用40μl甲醇提取。高效液相色谱-质谱联用跟踪各轮配体(附图2)，由(n
bxn
/n
ban
)/(n
bx0
/n
ba0
)确定各提取物中mtx相对于est的累积富集程率(附表1)。
[0049]
实施例2、人工添加甲氨蝶呤衍生物混合物的adee筛选
[0050]
合成即表征mtx(甲氨蝶呤，候选配体)和est(甲氨蝶呤双乙酯，参考配体)、met(甲氨蝶呤双甲酯)和eta(甲氨蝶呤二乙醇胺)：est(c
24h30
n8o5):1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ:8.58(s,1h),8.30(s,1h),7.72(m,4h),6.83(m,4h),4.78(s,2h),4.30(m,1h),4.08(m,4h),3.20(s,3h),2.0-2.51(m,4h),1.17(m,6h)；met(c
22h26
n8o5):1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ:8.57(s,1h),8.48(m,1h),7.73(m,3h),7.48(m,1h),6.6.-6.83(m,3h),5.60(m,2h),4.78(s,2h),3.33(s,6h).294(s,3h),2.0-2.42(m,4h).eta(c
24h32n10
o5):1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ＝8.52(s,1h),8.03(d,j＝7.7hz,1h),7.76(q,j＝5.1hz,2h),7.69(d,j＝8.8hz,2h),7.61(br s,1h),7.39(br s,1h),6.78(d,j＝9.0hz,2h),6.56(br s,2h),4.75(s,2h),4.61(td,j＝5.4,8.5hz,2h),4.28(dt,j＝5.2,8.3hz,1h),4.08(q,j＝5.3hz,1h),3.17(s,3h),3.13(d,j＝5.3hz,2h),3.11-2.98(m,5h),2.15-2.04(m,2h),1.99-1.88(m,1h),1.87-1.72(m,1h)。hplc-uv分析纯度》85％。
[0051]
将mtx(甲氨蝶呤，候选配体)和est(甲氨蝶呤双乙酯，参考配体)、met(甲氨蝶呤双甲酯)和eta(甲氨蝶呤二乙醇胺)按1：10：15：15共计约210nmol混合在0.5ml缓冲液中制备混合物，其中mtx约为5nmol，est、met和eta分别约为50nmol、75nmol和75nmol。在第一轮筛选，总共40ml的反应缓冲液中含有磁珠固定mtdhfr 0.5nmol，最终配体的总浓度约为5μmol l-1
。在0℃结合反应30min后，用磁力回收复合物，用反应缓冲液洗涤3次。磁珠上的结合物加入0.5ml甲醇制成悬浮液，在50℃加热40min，温和摇晃。上清液(2
×
100μl)，在50℃氮气流量下干燥。运行第二筛选，将第一轮提取液溶于20μl甲醇中，加入含有0.02nmol固定化酶的反应缓冲液0.4ml中，反应条件与第一轮相同，结合配体用0.2ml甲醇提取。高效液相色谱-质谱联用跟踪各轮配体(附图3)。由(n
bxn
/n
ban
)/(n
bx0
/n
ba0
)确定各提取物中mtx相对于est的累积富集程率(附表2)。
[0052]
实施例3、组合合成甲氨蝶呤衍生物混合物的adee筛选
[0053]
将甲氨蝶呤90mg(0.2mmol)、苯甲酸38mg(0.2mmol)、甲醇10mg(0.4mmol)、丙胺12mg(0.2mmol)、n，n-二甲基乙二胺72mg(0.8mmol)、二环己基碳二亚胺206mg(1mmol)、4-二甲氨基吡啶24mg(0.2mmol)在烧瓶中混合，然后加入10ml二氯甲烷进行反应。将12.0mg的组合合成混合物溶解在0.5ml甲醇中，稀释10倍(估计平均分子量约为400g mol-1
，浓度约为5μmol l-1
)。用高效液相色谱-质谱联用系统对稀释后的100μl样品中预计500nmol的配体进行分析，以估算残留甲氨蝶呤的含量，约为5nmol。取100μl的稀释样品，加入50nmol的est(甲氨蝶呤双乙酯，参考配体)，加上0.50nmol的固定化mtdhfr，结合缓冲液补充至100ml，总配体终浓度约为5μmol l-1
，在0℃连续振荡30min后，磁珠结合物完全回收，并用反应缓冲液洗涤3次。加入0.5ml甲醇提取第一轮运行的结合配体，用于第二轮(同实施例2)(附图4)和(附表3)。
[0054]
表1.人工添加甲氨蝶呤衍生物混合物的adee筛选
[0055][0056]
根据(n
bx,n
/n
ba,n
)/(n
tx,n
/n
ta,n
)≈[(k
x
/ka)
×
(rr
x
/rra)]n[0057][0058]
表2.组合合成甲氨蝶呤衍生物混合物的adee筛选
[0059][0060]
根据:(n
bx,n
/n
ba,n
)/(n
tx,n
/n
ta,n
)≈[(k
x
/ka)
×
(rr
x
/rra)]n[0061]

技术特征：
1.混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于：磁珠固定靶蛋白；首轮筛选，过量混合物样品竞争结合低浓度固定化靶蛋白、磁分离结合配体、溶剂a加热变性靶蛋白提取结合配体、浓缩；此后，以10除以混合物中可定量配体回收率均值为压缩比例指数递减固定化靶蛋白用量，将上轮筛选所得结合配体用于竞争结合、磁分离结合配体、溶剂a加热变性靶蛋白提取结合配体、浓缩，即实施迭代筛选；持续迭代筛选所得结合配体混合物中，高亲和力配体丰度随迭代筛选次数呈指数增长，即高亲和力配体实现指数数富集。2.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于：每轮竞争结合反应体系中可定量配体平均结合率不超过设定界限tr，为此需将竞争结合体系中磁珠固定化靶蛋白用量成指数递减进行压缩，具体压缩比例用r表示并在上下20％范围内波动；r取决于所设定的tr及可定量配体经过溶剂a加热提取及浓缩后的平均回收率rrx，定量关系是r≈1/tr/rrx并上下波动20％；具有通用性的tr默认值设为10％，可定量配体的平均回收率rrx经过实验测定或将其默认值设为通用性的40％；tr及rrx都取默认值则r为25并上下波动20％，即在20～30之间。3.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，所用溶剂a，特征在于：易于溶解样品中成分、沸点不高于100摄氏度、在比其沸点低10摄氏度下靶蛋白快速变性，具体包括有机溶剂、缓冲液、及这二者的混合物；属于溶剂a的有机溶剂，指，1)与水不混用但水的溶解度不低于10％的有机溶剂，代表为正丁醇，及满足此要求有机溶剂的任意比例混合物，2)与水混溶有机溶剂，代表为乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃，及满足此要求有机溶剂的任意比例混合物，3)水的溶解度大于10％体积比有机溶剂同与水混溶有机溶剂的任意比例混合物；属于溶剂a的缓冲液，指易于溶解样品且维持样品成分稳定的缓冲液，缓冲介质可为有机成分或无机成分；所述有机溶剂与缓冲液的混合物中，有机溶剂的含量比例上限是混合物能形成均匀的溶液。4.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，所用材料及试剂，特征在于：第一，固定化靶蛋白适用磁珠有两类：a)非蛋白亲水磁珠，用二甲基甲酰胺或二甲亚砜加热洗涤除去有机小分子杂质再固定活性靶蛋白、每g磁珠固定化靶蛋白容量im不小于10mg/g；2)蛋白磁珠，代表是表面固定亲和素、链亲和素或脱卤酶为工具蛋白的亲水磁珠；制备这类蛋白磁珠所用非蛋白磁珠也用二甲基甲酰胺或二甲亚砜加热洗涤除去所含有机小分子物质，再固定化工具蛋白；第二，竞争结合体系的结合缓冲液：ph在5.0到9.0间、含<2.0m的nacl或kcl、与固定化靶蛋白及磁珠都相容即不会造成靶蛋白失活也不造成磁珠消磁或结构破坏。5.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于，平均回收率如下测定：第一，原始混合物样品为样品0，形态为固体或液体，此后实施本发明过程中其所含成分都不用或无法用现有方法复制或放大；hplc-ms定量下限不高于30pmol且按下述流程所测定的回收率不低于10％者为参考配体；样品0中无合适参考配体，则外加已知量及亲和力的参考配体得加工后样品0；第二，样品0，用溶剂a溶解并进一步稀释到总质量浓度～0.05g/l，得样品2；将样品2在不超过溶剂a沸点且低于90摄氏度下加热不超过3小时、减压浓缩去有机溶剂或冷冻干燥去
水、固体残留物溶于不超过供测试样品2总体积5％的溶剂a中，得候选配体的浓缩结合物0；第三，hplc-ms测定浓缩结合物0及样品2中可定量成分；样品2及浓缩结合物0中，hplc-ms都可定量物质分别编号1，2，3...i，考虑浓缩效应计算这些成分经在溶剂a中加热及浓缩后回收率分别为rr1，rr2，rr3，
…
，rri；可定量成分回收率算术均值为实验测定的rrx。6.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，实施所需参数，特征如下：第一，优化hplc-ms体系使各成分定量下限不高于20pmole；经最后轮迭代竞争结合所得结合配体的浓缩结合物中所含hplc-ms可定量成分共m个，可定量配体总摩尔量q≈m*20pmole；最后轮迭代竞争结合所得浓缩结合物中可定量配体总数默认不超过5，故q上限默认为100pmole，第二，最后轮迭代竞争结合所用固定化靶蛋白磁珠最小用量mmb：靶蛋白中每个配体结合位点平均分子量mw单位为μg/nmol、靶蛋白固定化后仅50％结合位点保留活性、磁珠对靶蛋白固定化容量im、可定量配体平均回收率为rrx，则mmb＝q
÷
rrx
÷
0.5
×
mw
÷
im，且单位换算成μg；第三，迭代竞争结合筛选所需轮数k：对亲和力为参考配体2倍的候选配体x，其在样品中相对参考配体的丰度接近1％则仅需富集2轮、丰度接近0.1％则需富集5轮；相对亲和力越高，从相同起始丰度混合物中富集到参考配体的相同丰度所需迭代筛选轮数越少；样品0或外加参考所得加工后样品0中，候选配体相对参考配体的丰度越高则富集高亲和力配体所需迭代筛选轮数越少；实践中，对未知药理活性混合物k默认取值为2，对已知药理活性混合物k默认取值为不超过5；第四，以最后轮固定化靶蛋白磁珠用量为mmb，据此计算固定化靶蛋白磁珠用量从首轮到最后一轮的指数递减序列为mmb*r
k-1
，mmb*r
k-2
，mmb*r
k-3
，
…
，mmb。7.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，实施过程，特征如下：第一，样品0，用结合缓冲液溶解其全部成分且稀释到总质量浓度～1.0g/l，得样品1；样品0中成分在结合缓冲液中溶解性差，则加溶剂a助溶并稀释到总质量浓度～1.0g/l的溶液，得样品1；第二，设置首轮竞争结合体系：首轮竞争结合体系含固定化靶蛋白磁珠总量为计算所得指数递减序列的最大者，磁珠质量浓度不超过100mg/l，结合缓冲液总体积为v1，来自样品1的参考配体当量超过所用磁珠固定靶蛋白结合位点摩尔量的5倍；在竞争结合体系，样品总质量浓度不超过其溶解度的30％，样品1中含有机溶剂时降低其在竞争结合体系的终浓度使来自样品的有机溶剂不超过0.5％；第三，基本筛选流程为：室温下温和混合结合反应10到60min；磁分离靶蛋白-配体复合物、用结合缓冲液温和洗涤磁珠、用溶剂a将洗涤后磁珠悬浮后在90摄氏度下且比溶剂a沸点低10度下加热变性蛋白提取结合配体；去磁珠，将结合配体液减压浓缩或冻干浓缩，得结合配体的浓缩结合物；第四，设置迭代竞争结合反应体系：本轮的竞争结合反应体系总体积v
i
，在上轮的竞争结合反应体系总体积v
i-1
基础上压缩r倍，即v
i
＝v
i-1
÷
r；在竞争结合反应体系，固定靶蛋白磁珠的质量浓度与上轮相当即波动小于20％，而固定化靶蛋白磁珠用量为上轮磁珠用量的
1/r；将上轮所得结合配体的浓缩结合物用于竞争结合，按基本筛选流程实施，直到进行完所设定的迭代筛选轮数k；第五，对最后所得结合配体的浓缩结合物，用hplc-ms扫描确定可检测成分，用这些成分的hplc-ms特征定量跟踪其在迭代筛选所得结合配体浓缩结合物中的含量变化，确认其富集效应。8.据权利要求1所述混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，适用的混合物对象，特征如下：第一，不能以现有方法进行放大或复制的小分子配体混合物、大分子配体的混合物、大分子配体与小分子配体的混合物；第二，未用任何方法进行放大或复制的小分子配体混合物、大分子配体的混合物、大分子配体与小分子配体的混合物。

技术总结
混合物中靶蛋白高亲和力配体指数富集技术，特征在于：磁珠固定靶蛋白；首轮筛选，过量混合物样品竞争结合低浓度的固定化靶蛋白、磁分离结合配体、溶剂A加热变性靶蛋白提取结合配体、浓缩；此后，以10除以可定量配体回收率均值为比例指数递减固定化靶蛋白用量，将上轮筛选所得结合配体用于竞争结合、磁分离结合配体、溶剂A加热变性靶蛋白提取结合配体、浓缩，即迭代筛选；持续实施迭代筛选过程中，结合配体混合物中高亲和力配体丰度随迭代筛选次数呈指数增长即指数富集。此指数富集技术适合不能或未进行复制的配体混合物中低丰度很低高亲和力配体的快速发现。亲和力配体的快速发现。亲和力配体的快速发现。


技术研发人员：廖飞 杨晓兰
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2022.01.07
技术公布日：2023/7/21