蒜头果ISSR-PCR反应体系及标记方法与应用

蒜头果issr-pcr反应体系及标记方法与应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种蒜头果issr-pcr反应体系及分子标记方法与应用。


背景技术：

2.蒜头果（malania oleifera chun et s. k lee）为铁青树科（olacaceae）蒜头果属（malania）常绿乔木，是我国特有的单属种植物。蒜头果分布范围极为狭窄，其自然分布范围仅限于中国云南省的富宁、广南等地及广西省的百色右江区、巴马、凤山等地区，且其分布区域有逐渐减少的趋势，如百色、田东、马山等地区现已无蒜头果分布。由于分布范围极为狭窄且资源数量锐减，目前，蒜头果已被列为国家二级保护植物、国家珍贵用材树种以及云南省极小种群重点拯救和保护对象。
3.蒜头果具有极高的研究及利用价值。主要体现在：（1）其形态解剖特征兼具原始特征和进化特征，对研究铁青树科的分类有所帮助；（2）袁燕等通过分离纯化过程，从蒜头果种仁中分离得到一种新的植物毒蛋白，该毒蛋白具有抑制肿瘤细胞体外生长的作用，具有良好的抗癌药用前景；（3）从蒜头果油中提取的神经酸是大脑发育、维持的必须营养，其具有促进脑部发育、提高记忆力、防止脑神经衰老等作用。神经酸来源渠道极为有限，而蒜头果也是迄今为止发现神经酸含量最高的木本植物；（4）蒜头果种子中富含油脂，可作为合成麝香酮的理想原料，是良好的木本油料植物。有人推算，一株蒜头果一年产油价值为1.5万元。因此，蒜头果是具有广阔应用前景及极高潜在利用价值的高价值资源植物。
4.蒜头果作为我国特有的单属种珍稀濒危物种，其野外种群数量正在急剧减少，且人工栽培的蒜头果往往不易存活，极大程度威胁到了蒜头果种群繁衍及产业化开发利用。因此，积极开展蒜头果种质资源多样性研究，建立和优化蒜头果分子标记体系将对辅助蒜头果良种选育及构建蒜头果核心种质资源起到关键作用。近年来，蒜头果的研究工作主要集中在形态学、生理生化、蒜头果相关微生物资源研究、神经酸检测、制备及功能研究等领域，鲜见针对蒜头果遗传多样性开展系统研究的报道，亦未发现与蒜头果分子标记体系优化及应用相关的研究报道。
5.简单序列重复间扩增技术（inter-simple sequence repeat, issr）是在简单重复序列（simple sequence repeat, ssr）基础上发展起来的一种分子标记技术，其具有操作简单、快速及高效的优点，因此，issr技术被广泛应用于不同类型植物的遗传多样性检测中。由于issr是一种基于pcr技术的分子标记方法，不同pcr反应体系组分配比对反应结果影响显著。此外，现有研究结果表明，不同物种的最佳issr-pcr反应体系差异显著。因此，针对蒜头果建立issr-pcr体系并进行优化是开展蒜头果种质资源利用的关键步骤，且该物种此前并无相关研究或方法被报道。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提供一种蒜头果issr-pcr反应体系及标记方法与应用，以蒜
头果为研究对象，通过单因素试验及正交试验相结合的方法，对蒜头果issr-pcr体系中的各关键因素进行综合分析，最终建立并优化蒜头果issr-pcr的反应体系，为蒜头果的遗传多样性研究及种质资源保护与利用提供参考依据。
7.为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：蒜头果issr-pcr反应体系，所述反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，所述引物为ubc825、ubc826、ubc827、ubc836、ubc844、ubc861、ubc834或ubc851中的任意一条；所述ubc825引物序列为：acacacacacacacact；ubc826引物序列为：acacacacacacacacc；ubc827引物序列为: acacacacacacacacg；ubc834引物序列为：agagagagagagagagyt；ubc836引物序列为: agagagagagagagagya；ubc844引物序列为：ctctctctctctctctrc；ubc851引物序列为: gtgtgtgtgtgtgtgtyg；ubc861引物序列为：accaccaccaccaccacc，其中，y代表c或t，r代表a或g。
8.进一步的，该反应体系形成的混合液按照如下程序进行扩增：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2-56.5 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
9.优选的，所述ubc825引物序列的退火温度为：50.2 ℃；ubc826引物序列的退火温度为：56.5 ℃；ubc827引物序列的退火温度为：50.2 ℃；ubc836引物序列的退火温度为：56.5 ℃；ubc844引物序列的退火温度为：50.2 ℃；ubc861引物序列的退火温度为：50.2 ℃；ubc834引物序列的退火温度为：50.2 ℃；ubc851序列的退火温度为：54.0 ℃。
10.进一步的，本发明提供一种蒜头果issr-pcr标记方法，包括以下步骤：（1）提取蒜头果基因组dna并进行质量检测；（2）利用所述的蒜头果issr-pcr反应体系对提取的基因组dna进行issr-pcr扩增。
11.本发明提供的蒜头果issr-pcr反应体系可应用在蒜头果遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种。
12.本发明达到的技术效果：本发明以优化后的扩增反应条件对不同引物进行退火温度筛选，探究引物的最佳退火温度，确定蒜头果issr-pcr最佳反应体系为（终浓度）：20 μl反应体系中，dna 30 ng, 引物 0.3 μmol/l，dntps 0.25 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u。issr最佳反应程序为30个循环，利用优化后的反应体系筛选出了8条引物（ubc825，ubc826，ubc827，ubc836，ubc844，ubc861, ubc834，ubc851）的最佳退火温度，依次分别为:50.2℃，56.5℃，50.2℃，56.5℃，50.2℃，50.2℃，50.2℃，54.0℃。采用优化后的反应体系及引物对3个野生分布点的10个蒜头果样品进行issr-pcr分子标记检测，结果表明上述反应体系稳定可靠，不同采样点的蒜头果在遗传上相对保守，遗传多样性水平低。通过建立及优化蒜头果issr-pcr体系，获得了可用于蒜头果issr-pcr分子标记用的稳定体系，为后续开展蒜头果种质资源保护与利用相关工作奠定了良好的前期基础。
附图说明
13.图 1 验证用样品野生分布点位置示意图；图 2 部分蒜头果叶片样品dna质量检测结果图；
图 3 不同dna模板浓度对蒜头果issr-pcr扩增结果的影响图；图 4 不同dntps浓度对蒜头果issr-pcr扩增结果的影响图；图 5 不同引物浓度对蒜头果issr-pcr扩增结果的影响图；图 6 不同taq酶量下蒜头果issr-pcr结果电泳图；图 7 不同反应循环数对蒜头果issr-pcr扩增结果的影响图；图 8 蒜头果issr-pcr l25（54）正交试验电泳结果图；图 9 ubc827引物在不同退火温度下的issr-pcr电泳结果图（三次重复结果）注：1-8泳道tm值分别为50.2℃,50.8℃,52.0℃,54.0℃,56.5℃,58.5℃,59.7℃,60.3℃；图 10蒜头果issr-pcr体系扩增效果验证结果图（ubc836引物）注：marker: dl2000 marker; s1-s10:用于验证的10个不同蒜头果样品扩增结果（含3个样点居群）；图 11 基于issr-pcr构建的云南省境内3个野生蒜头果分布点10个样品系统发育树。
具体实施方式
14.为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例和附图进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
15.实施例1蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc825：acacacacacacacact时，扩增条件为，94℃预变性5min，然后94℃变性30 sec， 50.2 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，4 ℃保存。文中所涉及加入量及浓度均为终浓度。
16.实施例2蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc826：acacacacacacacacc时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，56.5 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
17.实施例3蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc827：acacacacacacacacg时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，4 ℃保存。
18.实施例4蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc836：agagagaga gagagagya时，y=（c,t）时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，56.5 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，4 ℃保存。
19.实施例5
蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc844：ctctctctctctctctrc时，r=（a,g）时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
20.实施例6蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc861：accaccaccaccaccacc时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
21.实施例7蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc834：agagagagagagagagyt时，y=（c,t）时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
22.实施例8蒜头果issr-pcr反应体系，反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，当引物为ubc851：gtgtgtgtgtgtgtgtyg时，y=（c,t）时，扩增条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，54.0 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
23.试验验证1 材料与方法1.1 材料本研究体系建立所用蒜头果叶片样品采自西南林业大学蒜头果种植圃，叶片样品经清洁处理后直接用于dna提取。验证样品分别采自云南省富宁县者桑乡（zswy样品）、富宁县板仑乡（mdcwh样品）以及文山州广南县董堡乡（dbx样品）的野生蒜头果自然分布点（图1）。采集的样本经硅胶干燥后按居群分装进自封袋，存放于干燥罐中干燥并定期更换干燥硅胶待用。
24.1.2 方法1.2.1 基因组dna提取与检测采用植物基因组dna提取试剂盒（天根，dp305）提取蒜头果基因组dna后，以1.2 %琼脂糖凝胶（biowest, g-10）及denovix ds-11+微量紫外可见分光度计检测dna提取质量。
25.1.2.2 issr反应体系的设计与优化基于实验室现有成熟pcr反应体系（20 μl反应体系中，加入模板50 ng, 引物0.2 μm，1
×ꢀ
polymerase buffer, 0.2 mm dntps, taq dna 聚合酶1 u; 94 ℃ 5 min, （94 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min），反应30个循环后，72 ℃ 10 min, 4 ℃ 保存）及前期预试验结果，设计不同模板浓度、引物浓度、dntps浓度、taq酶量及不同循环数，以ubc860引物对上述5个因素开展单因素试验（表1），初步筛选出适宜进行issr分子标记试验的反应体系范围。
[0026][0027]
基于上述单因素试验结果，采用正交设计助手ii v3.1软件建立l
25
（54）正交试验（表2）。为保证结果的稳定性与可重复性，每个试验组设3个重复，根据issr-pcr反应的扩增效率、扩增特异性、条带清晰度、背景质量等扩增质量因素计分。计分范围1-25分，分数越高，表示扩增效果越好。经三次重复试验后分别对每个扩增条件进行计分并取平均值。对所得评分采用直观分析评价法、极差法及方差分析法进行分析，综合评估出最佳的issr-pcr扩增条件。
calculation）进行预测。以优化后的蒜头果issr-pcr体系对各引物在8个不同退火温度下（退火温度分别为50.2 ℃, 50.8 ℃, 52.0 ℃, 54.0 ℃, 56.5 ℃, 58.5 ℃, 59.7 ℃, 60.3 ℃）的扩增效果进行检测，确定各引物最佳退火温度。
[0029]
1.2.4 优化后的蒜头果issr-pcr体系验证为验证所建立及优化的蒜头果issr体系效果，采用优化后的issr-pcr体系对3个不同地理居群共计10个样品进行扩增并获得0，1矩阵，以popgen32分析计算nei’s基因多样性指数（h）、shannon’s信息多样性指数（i）、多态性百分率（ppb）、nei’s基因分化系数（g
st
）、基因流（nm）等指标，以ntsyspc version 2.10e计算遗传距离，并以upgma法构建系统发育树。
[0030]
2 结果与分析2.1 蒜头果dna提取质量检测蒜头果叶片dna提取后结果如图2所示。图中3个蒜头果叶片dna样品条带清晰且没有拖尾、弥散等现象，且od260/280均介于1.8-1.9之间，表明提取的蒜头果叶片dna质量较好，可用于后续试验。
[0031]
2.1 模板dna加入量对蒜头果issr-pcr扩增效果的影响模板dna加入量对issr-pcr的影响如图3所示。以6个不同浓度的dna为模板进行issr-pcr扩增，所获得的条带从数量、清晰度、明亮度及背景看均无显著区别。上述结果表明，在蒜头果issr-pcr体系中，模板dna加入量对扩增反应的影响相对较小。出于节约dna用量的目的，在20 μl反应体系中，以10-50 ng的dna加入量开展正交试验。
[0032]
2.2 dntps浓度对蒜头果issr-pcr扩增效果的影响不同dntps浓度对issr-pcr的影响如图4所示。从issr-pcr的电泳结果看，不同dntps浓度对反应的影响整体趋势呈现出低浓度（0.075-0.10 mm）下条带数量及清晰度较低、中等浓度范围（0.15-0.30 mm）区间内浓度越高，条带数越丰富且条带也越清晰的趋势。当dntps浓度增加到0.35 mm之后，尽管条带清晰度较好，但条带数量开始减少，当浓度达到0.50 mm之后，条带数及条带清晰度均大幅降低。总体而言，在dntps 浓度为0.15-0.40 mm范围中条带数量相对较多、且条带清晰度较高、背景质量较好。经综合评估，后续研究选取0.20-0.40 mm之间的5个浓度梯度开展正交试验。
[0033]
2.3 引物浓度对蒜头果issr-pcr扩增效果的影响引物浓度能够同时影响pcr扩增的特异性及扩增效率。从图5可以看出，不同浓度引物对issr-pcr的影响呈现出浓度越高，条带数量越多，条带清晰度越高的趋势。其中，在引物浓度为0.2 μm时，条带数量较少且清晰度较差。从0.3 μm浓度开始，条带清晰度显著提高。引物浓度达到0.5-0.7 μm时，条带数量及清晰度达到峰值。因此，综合评估条带数量、清晰度等因素后，选取0.3-0.7 μm之间的5个浓度梯度开展正交试验。
[0034]
2.4 taq dna聚合酶量对蒜头果issr-pcr扩增效果的影响taq dna聚合酶是issr-pcr反应中的关键因素。加入不同量的taq dna聚合酶后进行issr-pcr反应，结果如图6所示。当taq酶的加入量为0.1-0.25 u时，扩增获得的条带数量少且不清晰。随着taq聚合酶量的增加，扩增条带数量及亮度达到峰值，但同时抹带情况也较为突出。当taq dna聚合酶加入量达到1.5 u后，扩增条带情况差异不显著。综合考虑各因素，选取0.25-2 u之间的5个taq聚合酶量进行后续正交试验。
[0035]
2.5不同反应循环数对issr-pcr扩增效果的影响pcr反应循环数对pcr扩增特异性及扩增效率两个方面均有显著影响。对20个循环、25个循环、30个循环及35个循环共计4个循环数条件进行检测。结果表明（图7），循环数仅为20-25个循环时由于扩增效率过低，不能有效获得issr-pcr扩增条带。随着循环数增加，在30个循环时扩增条带最多也最清晰，但35个循环时条带数量明显减少。根据上述试验结果，后续所有扩增反应均采用30个循环进行。
[0036]
2.6 蒜头果issr-pcr单因素试验最佳条件分析根据单因素试验结果，初步确定正交试验的体系条件范围如表3所示。此外，基于单因素试验中循环数对蒜头果issr-pcr的影响程度，正交试验中所有issr-pcr反应均运行30 个循环。
[0037][0038]
2.7 蒜头果issr-pcr反应体系正交试验的直观分析结果采用l25（54）正交试验设计对25个正交组合进行issr-pcr及电泳检测（共计3次重复），获得的试验结果如图8所示。尽管选取的各因素/水平在单因素试验中结果多数在可接受范围内，但不同组合的正交试验组扩增效果却差异显著。组合6、组合7及组合25扩增效果最好，而组合1、组合9及组合12扩增效果最差。采用直观法对正交试验结果进行打分（表4）并计算出极差（表5）。极差反映了影响因素对反应体系的影响，r值越大，影响就越显著。因此，在蒜头果issr-pcr反应体系中，各因素对反应的影响从大到小排序结果依次为：酶》》dntps》dna》》引物。即在所有因素中，反应体系中的taq酶量对整个蒜头果issr-pcr反应体系影响最大，而引物浓度对整个反应体系的影响最小。正交试验中，最大k值对应的水平即为该因素在issr-pcr反应体系中的最佳浓度水平。从以上分析可以确定蒜头果issr-pcr的最佳反应条件为：a2b1（c2/c3）d3，该结果与试验得分最高的处理组合（组合6）基本一致。
[0039]
注：试验组中得分最大值均以粗体标出。
[0040][0041]
注：最大均值k中最大值均以粗体标出。
[0042]
2.8 蒜头果issr-pcr反应体系正交试验的方差分析及多重比较结果
采用方差分析法（表6）及duncan法对正交试验结果进行分析。结果表明，除引物外，其他各因素对蒜头果issr-pcr反应影响均极为显著。从f值可知，各因素对反应的影响大小顺序为：酶》》dntps》dna》》引物，与极差分析结果一致。以duncan法对不同组合进行多重比较可知，a2b1c2d3（组合6），a2b2c3d4（组合7）及a5b5c4d3（组合25）结果最好且无显著性差异（p》0.05）。综合考虑直观分析、方差分析及琼脂糖凝胶电泳结果，后续研究选取组合6（a2b1c2d3）作为优化后的蒜头果issr-pcr反应体系，即在20 μl pcr反应体系中加入30 ng dna模板, 0.3 μm 引物（f/r），0.25 mm dntps, 1 u taq dna 聚合酶。
[0043][0044]
r方= .953（调整后 r方= .940）2.9 退火温度对issr-pcr扩增效果的影响基于优化后的蒜头果issr-pcr体系，对初步筛选出的8条issr-pcr分子标记引物的最佳退火温度进行检测（图9）。结果表明，不同退火温度对issr-pcr的扩增效果影响显著，且部分引物（如ubc861等）实际最佳退火温度与软件预测退火温度差异显著（最大差值δt
max
= 8.9 ℃, 表7）。引物总体最适退火温度介于50.2-56.5℃间，且随退火温度增加扩增条带数量呈逐渐降低趋势。
[0045][0046]
注：简并引物中字母y=（c,t）;r=（a,g）。
[0047]
3 蒜头果issr-pcr扩增体系效果的初步验证分析采用优化后的体系，以ubc836引物对野外采集的3个野生居群10株蒜头果叶片样品进行issr-pcr检测。结果表明（图10），各样品所获得的条带清晰，背景干净，不同样品条带数介于7-9条之间，扩增效果理想。
[0048]
以筛选的5条引物（ubc825，ubc826，ubc827，ubc834，ubc844）对采集自云南省3个蒜头果自然分布点的10个样品进行issr-pcr验证，将获得的issr-pcr条带转化为0，1矩阵后计算相似性系数（表8）、遗传多样性指标（表9）并构建系统发育树分析（图11）。结果表明：以5条引物验证10个蒜头果样品的遗传多样性时，蒜头果遗传多样性指标均显著低于其他物种，基因分化系数（g
st
）为0.7352，表明其73.52%的遗传多样性存在于居群间，居群间分化程度高，且基因流（nm=0.1801）远小于1，说明发生遗传漂变的概率大，易发生遗传多样性降低及居群分化。upgma聚类分析结果表明，在相似性系数为0.93附近时，所有样品被分为两个大簇。其中，板仑乡样品与董堡乡样品亲缘关系较近被划分为一个大簇，者桑乡样品被划分为另一个大簇。上述结果表明建立的蒜头果issr-pcr体系可以较好的区分不同自然分布点的蒜头果样品。
[0049][0050][0051]
4 讨论与结论issr分子标记技术因兼具ssr、rapd、rflp及aflp等分子标记的优点而被广泛应用于植物遗传多样性评价、种质资源鉴定、功能基因挖掘及定位等领域。issr-pcr体系中，酶、引物、模板等各组分差异均会影响其反应稳定性，且不同物种的最佳反应体系也存在显著差异。因此，需针对特定物种建立及优化物种特异的issr-pcr反应体系。目前，已有诸多研究报道建立了不同资源植物的issr-pcr反应体系，为植物种质资源鉴定、保护与利用工作的开展奠定了良好的基础。
[0052]
单因素试验及正交试验是确定试验中各因素影响大小及相互作用的常见方法。单因素试验虽然具有结果直观的优点，但忽视了各因素间的互作关系，也难以分析各因素水平对issr-pcr反应的影响程度。因此，两种方法之间存在一定的互补关系。本研究以高价值珍稀濒危物种—蒜头果为研究材料，先以单因素试验确定各影响因子的适宜浓度范围，在此基础上设计l25（54）正交试验，通过结合直观分析法、方差分析法等方法分别对蒜头果issr-pcr反应中影响扩增效果的dna加入量、引物浓度、dntps浓度、taq聚合酶加入量及不同反应循环数等5个因素进行评估优化，并对优化后的体系进行了初步验证。结果表明：与现有issr-pcr体系优化相关文献报道相似，反应中各组分对蒜头果issr-pcr反应的影响程度因物种不同而存在差异。在本研究中，各因素对issr-pcr反应的影响从大到小排序结果依次为：酶量》》dntps浓度》dna模板量》》引物浓度。最优反应方案为：在20 μl pcr反应液中
加入30 ng dna模板, 0.3 μm引物，0.25 mm dntps, 1 u taq dna聚合酶，反应进行30个循环。在pcr反应中，常以软件预测或经验公式计算引物退火温度。本研究对所筛选引物退火温度的分析结果表明，实际最佳退火温度与软件预测温度存在较大差异（最大退火温度差值δt
max
= 8.9 ℃），且部分引物退火温度仅相差2.0 ℃即可显著影响issr-pcr扩增条带的数量及质量。上述结果表明，以退火温度梯度试验确定引物最佳退火温度是issr-pcr反应体系建立中的关键环节。
[0053]
蒜头果issr-pcr反应体系验证结果表明，采用本研究建立及优化的蒜头果issr-pcr体系可获得清晰、稳定的issr条带。此外，初步分析表明，所采集蒜头果样品的遗传多样性较低，居群分化程度高且遗传漂变可能性大。地理位置相近的富宁县板仑乡样品（mdcwh）与云南文山州广南县董河堡乡样品（dbx）亲缘关系也较近。
[0054]
综上所述，本研究建立并优化了中国特有二级珍稀濒危树种—蒜头果的issr-pcr反应体系，该体系可有效应用到蒜头果种质资源鉴定与遗传多样性研究中，为蒜头果种质资源的保护与利用奠定了良好的前期基础。
[0055]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.蒜头果issr-pcr反应体系，其特征在于，所述反应体系每20 μl反应体系中含有模板dna 30 ng、引物 0.3 μmol/l、dntps 0.25 mmol/l、taq dna聚合酶 1 u，所述引物为ubc825、ubc826、ubc827、ubc836、ubc844、ubc861、ubc834或ubc851中的任意一条；所述ubc825引物序列为：acacacacacacacact；ubc826引物序列为：acacac acacacacacc；ubc827引物序列为：acacacacacacacacg；ubc834引物序列为: aga gagagagagagagyt；ubc836引物序列为：agagagagagagagagya；ubc844引物序列为：ctctctctctctctctrc;ubc851引物序列为: gtgtgtgtgtgtgtgtyg；ubc861引物序列为：accaccaccaccaccacc，其中，y代表c或t，r代表a或g。2.根据权利要求1所述的蒜头果issr-pcr反应体系，其特征在于，该反应体系形成的混合液按照如下程序进行扩增：94℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2～56.5 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。3.根据权利要求2所述的蒜头果issr-pcr反应体系，其特征在于，所述ubc825引物序列的退火温度为：50.2℃；ubc826引物序列的退火温度为：56.5℃；ubc827引物序列的退火温度为：50.2℃；ubc836引物序列的退火温度为：56.5℃；ubc844引物序列的退火温度为：50.2℃；ubc861引物序列的退火温度为：50.2℃；ubc834引物序列的退火温度为：50.2℃；ubc851序列的退火温度为：54.0℃。4.一种蒜头果issr-pcr标记方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以试剂盒法提取蒜头果基因组dna并进行质量检测；（2）利用权利要求1-3任一所述的蒜头果issr-pcr反应体系对提取的基因组dna进行issr-pcr扩增。5.如权利要求1-3任一所述的反应体系或权利要求4所述的标记方法在蒜头果遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种中的应用。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开一种蒜头果ISSR-PCR反应体系及标记方法与应用，蒜头果ISSR-PCR最佳反应体系为：每20μL反应体系中含有模板DNA 30 ng、引物0.3μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U，所述引物为UBC825、UBC826、UBC827、UBC836、UBC844、UBC861、UBC834或UBC851中的任一一条，采用优化后的反应体系及引物对3个采样点的10个蒜头果样品进行ISSR-PCR分子标记检测，结果表明上述反应体系稳定可靠。述反应体系稳定可靠。述反应体系稳定可靠。


技术研发人员：张鹏远 王娟 童海珍 黄久妍 潘悦 朱俊琳
受保护的技术使用者：西南林业大学
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/7/21