N-羟基脒衍生物及制备方法和应用、肿瘤免疫治疗药物

n-羟基脒衍生物及制备方法和应用、肿瘤免疫治疗药物
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及n-羟基脒衍生物及制备方法和应用、肿瘤免疫治疗药物。


背景技术：

2.吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1, ido1）是一种含血红素的酶，在犬尿氨酸代谢途径中催化色氨酸的吲哚环裂解为n-甲酰犬尿氨酸，是介导此代谢途径的关键限速酶。近期研究发现ido1是治疗癌症和其他与犬尿氨酸代谢途径相关疾病的重要靶点。研发新型ido1抑制剂用于与免疫逃逸有关的肿瘤治疗具有重要的理论意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供n-羟基脒衍生物及制备方法和应用、肿瘤免疫治疗药物，本发明提供的n-羟基脒衍生物结构新颖，具有较好ido1抑制活性。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种n-羟基脒衍生物，具有式i、式ii、式iii、式iv-a、式iv-7或式iv-8所示结构：
6.式i；式ii；式iii；
7.式iv-a；式iv-7；
8.式iv-8；
9.式i中r1为、、、、、、、、、、、、
、、、、或；
10.式ii中r2为、、、、或；
11.式iii中r1为-cl或-br；
12.式iii和式iv-a中，r3为-h、-sch3或-och3，r4为-h或-och3，r5为-h或-och3，x为-o-或-nh-。
13.优选地，所述n-羟基脒衍生物为以下化合物中的任一种：
14.、、、
15.、、、
16.、、、
17.、、、
18.、、、
19.、、、
20.、、、
21.、、、、、、、、、、、、、、、、、、
22.。
23.本发明提供了上述技术方案所述n-羟基脒衍生物的制备方法，
24.（i）具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
25.将取代胺化合物、中间体6a与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体9；
26.将所述中间体9、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物；
27.所述取代胺化合物为n-苯基乙二胺、2-(吡啶-2-基)乙胺、4-氟苯乙胺、3,4,5-三氟苄胺、4-甲基苯乙胺、4-溴苯乙胺、2-(4-三氟甲基苯基)乙胺、4-羟基苯乙胺、3-氟苯乙胺、2-氟苯乙胺、4-甲硫基苄胺、4-甲氧基苄胺、3-氯苯乙胺、3-氯苄胺、4-哌嗪基苯腈、3-羟基苯基哌嗪、1-苯甲酰基哌嗪或1-乙酰基哌嗪；
28.所述中间体6a和中间体9的结构式依次如下所示：
29.；；
30.所述r1如式i所定义；
31.（ii）具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
32.（ii-1）将取代甲酸化合物、中间体8、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三唑、三乙胺与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到中间体10；
33.将所述中间体10、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物；
34.所述取代甲酸化合物为2-(4-吗啉基)-5-硝基苯甲酸、2-(4-硫代吗啉基)-5-硝基苯甲酸、2-(4-boc-哌嗪基)-5-硝基苯甲酸、6-三氟甲基烟酸或2,5-二氟苯甲酸；
35.所述中间体8和中间体10的结构式依次如下所示：
36.；；
37.所述r2如式ii中所定义；
38.（ii-2）将中间体10d与有机溶剂混合，在酸性条件下进行脱保护基反应，得到中间体10e；
39.将所述中间体10e、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物；
40.所述中间体10d与中间体10e的结构式依次如下所示：
41.；；
42.（iii）具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
43.将中间体6、中间体13、有机溶剂与氢氧化钠水溶液混合，进行取代-开环反应，得到具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物；
44.所述中间体6和所述中间体13的结构式依次如下所示：
45.；；
46.所述r1、r3、r4、r5与x如式iii中所定义；
47.（iv-1）具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
48.将中间体5a、中间体14、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体15；
49.将所述中间体15、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物；
50.所述中间体5a、中间体14与中间体15的结构式依次如下所示：
51.；；；
52.所述r3、r4、r5与x如式iv中所定义；所述r7为-cl或-br；
53.（iv-2）具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
54.将中间体8、中间体14a、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体15g；
55.将所述中间体15g、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物；
56.所述中间体14a和中间体15g的结构式依次如下所示：
57.；；
58.（iv-3）具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
59.将化合物ca-4、2-溴乙醇、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体16；
60.将所述中间体16、中间体8、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代-开环反应，得到具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物；
61.所述化合物ca-4与中间体16的结构式依次如下所示：
62.；。
63.本发明提供了上述技术方案所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐在制备ido1抑制剂中的应用。
64.本发明提供了上述技术方案所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
65.优选地，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌或恶性胶质瘤。
66.本发明提供了一种肿瘤免疫治疗药物，包括活性成分和药学上可接受的载体，所述活性成分为上述技术方案所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐。
67.优选地，所述药学上可接受的载体包括射用水、丙二醇、甘露醇、甘油、硬脂酸、氯化钠、糊精、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、羟甲基淀粉钠、聚乙二醇、海藻酸和聚山梨酯80中的一种或多种。
68.优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、气雾剂、注射剂或栓剂。
69.优选地，所述药物的给药方式包括静脉注射、口服、吸入或直肠给药。
70.有益效果：本发明以处于iii期临床试验的ido1抑制剂epacadostat为先导物，基于epacadostat与ido1酶的晶体复合物结构，保留其活性部位呋咱环、n-羟基脒基和苯环部分，对侧链氨基磺酰胺进行结构修饰，设计合成了具有较好ido1抑制活性的新型n-羟基脒衍生物。本发明测试例中分别测定所述n-羟基脒衍生物在酶活水平上和细胞水平上对ido1抑制活性，结果显示：化合物i-10（hido1 ic
50 = 0.1868
±
0.12 μm）和化合物ii-6（hido1 ic
50 = 0.08779
±
0.004 μm）的酶抑制活性与epacadostat（hido1 ic
50 = 0.1787
±
0.01 μm）相当；化合物i-1（hela ec
50 = 0.062
±
0.004 μm）在细胞水平上对ido1的抑制活性与epacadostat（hela ec
50 = 0.068
±
0.009 μm）相当；其中在细胞水平上对ido1抑制活性最强的为化合物iv-7（hela ec
50 = 0.00017
±
0.01 μm），优于epacadostat（hela ec
50 = 0.068
±
0.009 μm）。综合比较本发明中n-羟基脒衍生物在细胞水平和酶活水平上对ido1的抑制活性，化合物i-1、i-2、ii-5、ii-6、iv-3、iv-6和iv-7是具有更好体外抑制ido1活性潜力的衍生物。为了探究所述n-羟基脒衍生物的细胞活性是由ido1抑制引起的，还是仅仅由细胞毒性引起的，本发明测试例中还采用基于细胞的方法测定了活性较好化合物i-1、i-2、ii-5、ii-6、iv-3、iv-6和iv-7对hela细胞的cc
50
值，并计算得到选择指数si（cc
50
/ec
50
）为91.66~37423之间（一般认为选择指数si》30，表明细胞活性是由ido1抑制引起的）。总而言之，本发明提供的n-羟基脒衍生物结构新颖，具有较好ido1抑制活性，能够用于制备肿瘤免疫治疗药物。
附图说明
71.图1为epacadostat生化水平ido1酶抑制活性测定结果图；
72.图2为epacadostat细胞水平ido1酶抑制活性测定结果图；
73.图3为化合物i-1生化水平ido1酶抑制活性测定结果图；
74.图4为化合物i-1细胞水平ido1酶抑制活性测定结果图；
75.图5为化合物i-2生化水平ido1酶抑制活性测定结果图；
76.图6为化合物i-2细胞水平ido1酶抑制活性测定结果图；
77.图7为化合物iv-7生化水平ido1酶抑制活性测定结果图；
78.图8为化合物iv-7细胞水平ido1酶抑制活性测定结果图。
具体实施方式
79.本发明提供了一种n-羟基脒衍生物，具有式i、式ii、式iii、式iv-a、式iv-7或式iv-8所示结构：
80.式i；式ii；式iii；
81.式iv-a；式iv-7；
82.式iv-8；
83.式i中r1为、、、、、、、、、、、、、、、、或；
84.式ii中r2为、、、、或；
85.式iii中r1为-cl或-br；
86.式iii和式iv-a中，r3为-h、-sch3或-och3，r4为-h或-och3，r5为-h或-och3，x为-o-或-nh-。
87.在本发明中，所述n-羟基脒衍生物优选为以下化合物中的任一种：
88.；；；
89.；；；
90.；；；
91.；；；
92.；；；
93.；；；
94.；；；
95.；；；
96.；；；
97.；；；
98.；；；
99.；；；
100.；；；
101.。
102.本发明提供了上述技术方案所述n-羟基脒衍生物的制备方法，下面进行详细说明。在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。
103.在本发明中，具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
104.将取代胺化合物、中间体6a与有机溶剂混合，进行取代反应（记为第一取代反应），得到中间体9；
105.将所述中间体9、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应（记为第一开环反应），得到具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物；
106.所述取代胺化合物为n-苯基乙二胺、2-(吡啶-2-基)乙胺、4-氟苯乙胺、3,4,5-三氟苄胺、4-甲基苯乙胺、4-溴苯乙胺、2-(4-三氟甲基苯基)乙胺、4-羟基苯乙胺、3-氟苯乙胺、2-氟苯乙胺、4-甲硫基苄胺、4-甲氧基苄胺、3-氯苯乙胺、3-氯苄胺、4-哌嗪基苯腈、3-羟基苯基哌嗪、1-苯甲酰基哌嗪或1-乙酰基哌嗪；
107.所述中间体6a和中间体9的结构式依次如下所示：
108.；；
109.所述r1如式i所定义。
110.本发明将取代胺化合物、中间体6a与有机溶剂混合，进行第一取代反应，得到中间体9。在本发明中，所述取代胺化合物与中间体6a的摩尔比优选为（1.8~2.2）：1，更优选为2：1。在本发明中，所述有机溶剂优选包括四氢呋喃（thf），所述有机溶剂与所述取代胺化合物的用量比优选为（8~12）ml：（0.43~1.06）mmol，更优选为10 ml：（0.43~1.06）mmol。本发明对所述取代胺化合物、中间体6a与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够混合均匀即可。在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温（25℃）；时间优选为2.5~3.5 h，更优选为3 h。所述第一取代反应后，本发明优选将所得产物体系减压浓缩，得到中间体9，直接用于下一步反应。
111.得到中间体9后，本发明将所述中间体9、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行第一开环反应，得到具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物。在本发明中，所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为1.5~2.5 mol/l，更优选为2 mol/l；所述有机溶剂优选包括thf；以所述取代胺化合物的用量为基准，所述取代胺化合物、氢氧化钠水溶液与有机溶剂的用量比优选为（0.43~1.06）mmol：（1.5~2.5）ml：（8~12）ml，更优选为（0.43~1.06）mmol：2 ml：10 ml。本发明对所述中间体9、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够混合均匀即可。在本发明中，所述第一开环反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为3.5~4.5 h，更优选为4 h。所述第一开环反应后，本发明将所得产物体系用乙酸乙酯溶解，依次用水以及饱和氯化钠溶液洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层析纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=2：1），得到具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物。
112.在本发明中，具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法具体分两种情况，下面进行详细说明。
113.第一种情况：当具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物为化合物ii-1、ii-2、ii-3、ii-4和ii-6时，制备方法包括以下步骤：
114.将取代甲酸化合物、中间体8、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯（hatu）、1-羟基苯并三唑（hobt）、三乙胺与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到中间体10；
115.将所述中间体10、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应（记为第二开环反应），得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物；
116.所述取代甲酸化合物为2-(4-吗啉基)-5-硝基苯甲酸、2-(4-硫代吗啉基)-5-硝基苯甲酸、2-(4-boc-哌嗪基)-5-硝基苯甲酸、6-三氟甲基烟酸或2,5-二氟苯甲酸；
117.所述中间体8和中间体10的结构式依次如下所示：
118.；；
119.所述r2如式ii中所定义。
120.本发明将取代甲酸化合物、中间体8、hatu、hobt、三乙胺与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到中间体10。在本发明中，所述取代甲酸化合物、中间体8、hatu、hobt与三乙胺的摩尔比优选为（0.51~1.27）：（0.36~0.64）：（1.00~1.50）：（0.20~0.30）：（3.50~4.00），更优选为（0.51~1.27）：（0.36~0.64）：1.13：0.22：3.75。在本发明中，所述有机溶剂优选包括二氯甲烷（dcm）；所述有机溶剂与所述取代甲酸化合物的用量比优选为（35~45）ml：（0.51~1.27）mmol，更优选为40 ml：（0.51~1.27）mmol。本发明优选将取代甲酸化合物、hatu、hobt、三乙胺与有机溶剂混合进行活化反应，然后再将所得产物体系与所述中间体8混合进行缩合反应。在本发明中，所述活化反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为20~40 min，更优选为30 min。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为5~7 h，更优选为6 h。所述缩合反应后，本发明优选将所得产物体系依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩，得到中间体10a，直接用于下一步反应。
121.得到中间体10后，本发明将所述中间体10、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行第二开环反应，得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物。在本发明中，进行所述第二开环反应所需氢氧化钠水溶液与有机溶剂的种类、用量以及反应条件、后处理方法优选与所述第一开环反应相关操作条件一致，在此不再赘述。
122.第二种情况：当具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物为化合物ii-5时，制备方法包括以下步骤：
123.将中间体10d与有机溶剂混合，在酸性条件下进行脱保护基反应，得到中间体10e；
124.将所述中间体10e、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应（记为第三开环反应），得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物；
125.所述中间体10d与中间体10e的结构式依次如下所示：
126.；。
127.本发明将中间体10d与有机溶剂混合，在酸性条件下进行脱保护基反应，得到中间体10e。在本发明中，所述有机溶剂优选包括乙酸乙酯。本发明优选将中间体10d、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液混合，进行脱保护基反应；所述hcl的乙酸乙酯溶液中hcl的浓度优选为1.5~2.5 mol/l，更优选为2 mol/l；所述中间体10d、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液的用量比优选为0.25 mmol：（35~45）ml：（15~25）ml，更优选为0.25 mmol：40 ml：20 ml。在本发明中，所述脱保护基反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为3~5 h，更优选为4 h。所述脱保护基反应后，本发明优选将所得产物体系抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤后减
压干燥，得到中间体10e。
128.得到中间体10e后，本发明将所述中间体10e、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行第三开环反应，得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物。在本发明中，进行所述第三开环反应所需氢氧化钠水溶液与有机溶剂的种类、用量以及反应条件、后处理方法优选与所述第一开环反应相关操作条件一致，在此不再赘述。
129.在本发明中，具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
130.将中间体6、中间体13、有机溶剂与氢氧化钠水溶液混合，进行取代-开环反应（记为第一取代-开环反应），得到具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物；
131.所述中间体6和所述中间体13的结构式依次如下所示：
132.；；
133.所述r1、r3、r4、r5与x如式iii中所定义。
134.本发明将中间体6、中间体13、有机溶剂与氢氧化钠水溶液混合。在本发明中，所述中间体6与中间体13的摩尔比优选为1：（0.8~1.2），更优选为1：1。在本发明中，所述有机溶剂优选包括thf；所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为1.5~2.5 mol/l，更优选为2 mol/l；所述中间体6、氢氧化钠水溶液与有机溶剂的用量比优选为（0.40~0.61）mmol：（1.5~2.5）ml：（6~10）ml，更优选为（0.40~0.61）mmol：2 ml：8 ml。本发明对所述中间体6、中间体13、有机溶剂与氢氧化钠水溶液混合的方式没有特殊限定，能够混合均匀即可。在本发明中，所述第一取代-开环反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为3.5~4.5 h，更优选为4 h。所述第一取代-开环反应后，本发明优选将所得产物体系减压蒸干，向剩余物中加入乙酸乙酯溶解，有机相依次用水以及饱和氯化钠溶液洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层析纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=3：1），得到具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物。
135.在本发明中，具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
136.将中间体5a、中间体14、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代反应（记为第二取代反应），得到中间体15；
137.将所述中间体15、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应（记为第四开环反应），得到具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物；
138.所述中间体5a、中间体14与中间体15的结构式依次如下所示：
139.；；；
140.所述r3、r4、r5与x如式iv中所定义；所述r7为-cl或-br。
141.本发明将中间体5a、中间体14、碳酸钾与有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到
中间体15。在本发明中，所述中间体5a与中间体14的摩尔比优选为1：（0.8~1.2），更优选为1：1。在本发明中，所述有机溶剂优选包括乙腈；所述中间体5a、碳酸钾与有机溶剂的用量比优选为（0.58~0.67）mmol：（1.00~1.50）mmol：（25~30）ml，更优选为（0.58~0.67）mmol：1.18 mmol：30 ml。本发明对所述中间体5a、中间体14、碳酸钾与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，各组分能够混合均匀即可。在本发明中，所述第二取代反应优选在体系回流条件下进行，以所述有机溶剂为乙腈为例，所述第二取代反应的温度优选为60℃；所述第二取代反应的时间优选为15~20 h，更优选为18 h。所述第二取代反应后，本发明优选将所得产物体系过滤去除碳酸钾，滤液经减压浓缩，将剩余物用乙酸乙酯溶解，有机相依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，然后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层析纯化（按体积比计，所以洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=1：2），得到中间体15a，直接用于下一步反应。
142.得到中间体15后，本发明将所述中间体15、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行第四开环反应，得到具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物。在本发明中，进行所述第四开环反应所需氢氧化钠水溶液与有机溶剂的种类、用量以及反应条件、后处理方法优选与所述第一开环反应相关操作条件一致，在此不再赘述。
143.在本发明中，具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
144.将中间体8、中间体14a、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代反应（记为第三取代反应），得到中间体15g；
145.将所述中间体15g、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应（记为第五开环反应），得到具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物；
146.所述中间体14a和中间体15g的结构式依次如下所示：
147.；。
148.本发明将中间体8、中间体14a、碳酸钾与有机溶剂混合，进行第三取代反应，得到中间体15g。在本发明中，进行所述第三取代反应所需碳酸钾与有机溶剂的种类、用量以及反应条件、后处理方法优选与所述第二取代反应相关操作条件一致，在此不再赘述。
149.得到中间体15g后，本发明将所述中间体15g、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行第五开环反应，得到具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物。在本发明中，在本发明中，进行所述第五开环反应所需氢氧化钠水溶液与有机溶剂的种类、用量以及反应条件、后处理方法优选与所述第一开环反应相关操作条件一致，在此不再赘述。
150.在本发明中，具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：
151.将化合物ca-4、2-溴乙醇、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯与有机溶剂混合，进行取代反应（记为第四取代反应），得到中间体16；
152.将所述中间体16、中间体8、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代-开环反应（记为第二取代-开环反应），得到具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物；
153.所述化合物ca-4与中间体16的结构式依次如下所示：
154.；。
155.本发明将化合物ca-4、2-溴乙醇、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯与有机溶剂混合，进行第四取代反应，得到中间体16。在本发明中，所述化合物ca-4、2-溴乙醇、三苯基膦与偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比优选为0.95：（1.0~1.5）：（1.0~1.5）：（1.0~1.5），更优选为0.95：1.14：1.14：1.14。在本发明中，所述有机溶剂优选包括甲苯；所述有机溶剂与化合物ca-4的用量比优选为0.95 mmol：（8~12）ml，更优选为0.95 mmol：10 ml。本发明对所述化合物ca-4、2-溴乙醇、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够保证各组分混合均匀即可。在本发明中，所述第四取代反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为20~28 h，更优选为24 h。所述第四取代反应后，本发明优选减压蒸干所得产物体系中溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=4：1）。
156.得到中间体16后，本发明将所述中间体16、中间体8、碳酸钾与有机溶剂混合，进行第二取代-开环反应，得到具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物。在本发明中，所述第二取代-开环反应的温度优选为75~85℃，更优选为80℃；时间优选为15~24 h，更优选为20 h。所述第二取代-开环反应后，本发明优选将所得产物体系过滤去除碳酸钾，滤液减压蒸干后经硅胶柱层析分离纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为二氯甲烷：甲醇=30：1），得到具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物。
157.下面对本发明中制备n-羟基脒衍生物时所需反应物的制备方法进行说明。
158.在本发明中，制备所述中间体8的反应式如下所示：
159.。
160.在本发明中，中间体2的制备方法，优选包括以下步骤：
161.将丙二腈、亚硝酸钠、盐酸与水混合，进行亚硝化反应，得到亚硝化产物体系；
162.将所述亚硝化产物体系与盐酸羟胺水溶液混合，进行重排反应，得到重排产物体系；
163.将所述重排产物体系的ph值调节至9.5~10.5，进行脱水反应，得到中间体2。
164.本发明将丙二腈、亚硝酸钠、盐酸与水混合，进行亚硝化反应，得到亚硝化产物体系。在本发明中，所述盐酸的浓度优选为1.8~2.2 mol/l，更优选为2 mol/l；所述水优选为超纯水；所述丙二腈、亚硝酸钠、盐酸与水的用量比优选为0.15 mol：（0.28~0.32）mol：（140~160）ml：（35~45）ml，更优选为0.15 mol：0.3 mol：150 ml：40 ml。本发明优选将丙二腈与
盐酸混合，得到丙二腈的盐酸溶液；将亚硝酸钠与水混合，得到亚硝酸钠水溶液；将所述丙二腈的盐酸溶液滴加至所述亚硝酸钠水溶液中，进行亚硝化反应。在本发明中，所述亚硝化反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；所述亚硝化反应的时间优选为10~15 h，更优选为12 h；所述亚硝化反应的时间以所述丙二腈的盐酸溶液滴加完毕开始计。
165.所述亚硝化反应后，本发明优选将所得亚硝化产物体系冷却至0℃后与盐酸羟胺水溶液混合，进行重排反应，得到重排产物体系。在本发明中，以所述丙二腈的用量为基准，所述丙二腈与盐酸羟胺水溶液中盐酸羟胺的摩尔比优选为0.15：（0.30~0.40），更优选为0.15：0.34；所述盐酸羟胺水溶液的浓度优选为8~9 mmol/ml，更优选为8.5 mmol/ml。在本发明中，所述重排反应的温度优选为0℃；时间优选为20~40 min，更优选为30 min。
166.所述重排反应后，本发明将所得重排产物体系的ph值调节至9.5~10.5（优选为10），进行脱水反应，得到中间体2。在本发明中，调节所述重排产物体系ph值的试剂优选为氢氧化钠水溶液；所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为8~12 mol/l，更优选为10 mol/l。在本发明中，所述脱水反应优选包括依次进行第一阶段反应和第二阶段反应；所述第一阶段反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温，时间优选为1.5~2.5 h，更优选为2 h；所述第二阶段反应优选在体系回流（温度优选为100℃）条件下进行，时间优选为1.5~2.5 h，更优选为2 h。所述脱水反应后，本发明优选将所得产物体系在室温放置10~15 h（优选为12 h），过滤，滤饼用水洗净，减压干燥，得到中间体2。
167.在本发明中，中间体3的制备方法，优选包括以下步骤：
168.将中间体2、亚硝酸钠、氯化钠、盐酸、乙酸与水混合，进行重氮化反应，得到中间体3。
169.在本发明中，所述盐酸的浓度优选为5.5~6.5 mol/l，更优选为6 mol/l；所述中间体2、亚硝酸钠、氯化钠、盐酸、乙酸与水的用量比优选为58.74 mmol：（55~60）mmol：（170~180）mmol：（25~30）ml：（130~140）ml，更优选为58.74 mmol：58.0 mmol：177.8 mmol：29 ml：132 ml。本发明优选将亚硝酸钠与部分水混合，得到亚硝酸钠水溶液；将中间体2与剩余水混合，向所得料液中加入氯化钠、盐酸和乙酸，在回流（温度优选为45℃）条件下加热至溶液变澄清透明状，然后冷却至-10~-5℃（优选为-8℃），向所得料液中滴加所述亚硝酸钠水溶液进行重氮化反应；所述亚硝酸钠水溶液的浓度优选为3.5~4.5 mmol/ml，更优选为4.1 mmol/ml。在本发明中，所述重氮化反应的温度优选为0℃；所述重氮化反应的时间优选为2.5~3.5h，更优选为3 h；所述重氮化反应的时间以所述亚硝酸钠水溶液滴加完毕开始计。所述重氮化反应后，本发明优选将所得产物体系升至室温放置2.5~3.5h（优选为3 h），过滤，滤饼用水洗净，减压干燥，得到中间体3。
170.在本发明中，中间体4（具体包括中间体4a和中间体4b）的制备方法，优选包括以下步骤：
171.将中间体3、卤代苯胺化合物、碳酸氢钠与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体4；所述卤代苯胺化合物为3-溴-4-氟苯胺或3-氯-4-氟苯胺。
172.在本发明中，所述有机溶剂优选包括四氢呋喃（thf）；所述中间体3、卤代苯胺化合物、碳酸氢钠与有机溶剂的用量比优选为25 mmol：（25~30）mmol：（45~55）mmol：（45~55）ml，更优选为25.00 mmol：26.95 mmol：50.00 mmol：50 ml。本发明优选将卤代苯胺化合物与部分有机溶剂混合，得到卤代苯胺化合物溶液；将中间体3、碳酸氢钠与剩余有机溶剂混合，加
热至回流（温度优选为45℃），然后滴加所述卤代苯胺化合物溶液进行取代反应；所述卤代苯胺化合物溶液的浓度优选为3.0~3.5 mmol/ml，更优选为3.4 mmol/ml。在本发明中，所述取代反应优选在体系回流（温度优选为45℃）条件下进行；所述取代反应的时间优选为2.5~3.5 h，更优选为3 h；所述取代反应的时间以所述卤代苯胺化合物溶液滴加完毕开始计。所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系趁热过滤，滤液减压浓缩后加入石油醚打浆（打浆时间优选为2 h），抽滤，滤饼减压干燥，得到中间体4。
173.在本发明中，中间体5（具体包括中间体5a和中间体5b）的制备方法，优选包括以下步骤：
174.将中间体4、n,n'-羰基二咪唑与有机溶剂混合，进行羟肟保护反应，得到中间体5。
175.在本发明中，所述有机溶剂优选包括乙酸乙酯；所述中间体4、n,n'-羰基二咪唑与有机溶剂的用量比优选为12.66 mmol：（23~27）mmol：（75~85）ml，更优选为12.66 mmol：25.32 mmol：80 ml。本发明对所述中间体4、n,n'-羰基二咪唑与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。在本发明中，所述羟肟保护反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为3.5~4.5 h，更优选为4 h。所述羟肟保护反应后，本发明优选将所得产物体系依次用盐酸（浓度优选为1 mol/l）、水与饱和氯化钠溶液各洗涤一次，之后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后加入无水乙醇打浆（打浆时间优选为3 h），过滤，滤饼减压干燥，得到中间体5。
176.在本发明中，中间体6（具体包括中间体6a和中间体6b）的制备方法，优选包括以下步骤：
177.将中间体5、三氟乙酸与过氧化氢水溶液混合，进行氧化反应，得到中间体6。
178.在本发明中，所述过氧化氢水溶液的浓度优选为28~30wt%；所述中间体5、三氟乙酸与过氧化氢水溶液的用量比优选为12.35 mmol：（85~95）ml：（25~35）ml，更优选为12.35 mmol：90 ml：30 ml。本发明对所述中间体5、三氟乙酸与过氧化氢水溶液混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。在本发明中，所述氧化反应的温度优选为45~55℃，更优选为45~50℃；时间优选为15~20 h，更优选为18 h。所述氧化反应后，本发明优选将所得产物体系置于冰浴中，滴加饱和na2so3水溶液，直至出现大量沉淀，过滤，滤饼用水洗净后减压干燥，得到中间体6。
179.在本发明中，中间体7的制备方法，优选包括以下步骤：
180.将中间体6a、n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体7。
181.在本发明中，所述有机溶剂优选包括四氢呋喃；所述中间体6a、n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺与有机溶剂的用量比优选为6.05 mmol：（11.70~12.30）mmol：（35~45）ml，更优选为6.05 mmol：12.10 mmol：40 ml。本发明对所述中间体6a、n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。在本发明中，所述取代反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为1.5~2.5 h，更优选为2 h。所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系减压浓缩，得到中间体7。
182.在本发明中，中间体8的制备方法，优选包括以下步骤：
183.将中间体7、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液混合，进行脱保护基反应，得到中间体8。
184.在本发明中，所述hcl的乙酸乙酯溶液的浓度优选为1.5~2.5 mol/l，更优选为2 mol/l；所述中间体7、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液的用量比优选为3.76 mmol：（35~45）ml：（18~22）ml，更优选为3.76 mmol：40 ml：20 ml。本发明对所述中间体7、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。在本发明中，所述脱保护基反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为3.5~4.5 h，更优选为4 h。所述脱保护基反应后，本发明优选将所得产物体系抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤后减压干燥，得到中间体8。
185.在本发明中，制备所述中间体14的反应式如下所示：
186.；；。
187.所述r3、r4、r5与x如式iii中所定义；所述r6为、或。
188.在本发明中，所述中间体14的制备方法，优选包括以下步骤：
189.将中间体12、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液混合，进行脱保护基反应，得到中间体13；
190.将所述中间体13、三乙胺、酰化试剂与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体14；所述酰化试剂为溴乙酰溴或氯乙酰氯。
191.本发明将中间体12、乙酸乙酯与hcl的乙酸乙酯溶液混合，进行脱保护基反应，得到中间体13。在本发明中，制备所述中间体14时所用试剂、物料配比、脱保护基反应的条件以及后处理方法优选与制备中间体8一致，在此不再赘述。
192.得到中间体13后，本发明将所述中间体13、酰化试剂、三乙胺与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体14；所述酰化试剂为溴乙酰溴或氯乙酰氯。在本发明中，所述中间体13、酰化试剂与三乙胺的摩尔比优选为（6.96~8.11）：（10.44~12.22）：（35~40），更优选为（6.96~8.11）：（10.44~12.22）：38.76。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷，所述中间体13与有机溶剂的用量比优选为（6.96~8.11）mmol：（45~55）ml，更优选为（6.96~8.11）mmol：50 ml。本发明优选将中间体13与有机溶剂混合，0℃条件下加入三乙胺并在0℃条件
下反应30~40 min，然后加入酰化试剂进行取代反应。在本发明中，所述取代反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为5~7 h，更优选为6 h。所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系减压蒸干，剩余物加入乙酸乙酯溶解，有机相依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，然后再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层析纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=1：1），得到中间体14。
193.本发明优选根据中间体12中x基团种类不同采用不同的方法制备，具体的，所述中间体12包括中间体12-1（即x=-o-）和中间体12-2（即x=-nh-），下面对所述中间体12-1和中间体12-2的制备方法分别进行详细说明。
194.在本发明中，所述中间体12-1的制备方法优选包括以下步骤：
195.将2-氟-5-硝基苯甲酸、醇化合物、三乙胺、hatu与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到中间体11-1；所述醇化合物的结构式如下所示：
196.；
197.所述r3、r4与r5如式iii中所定义；
198.将所述中间体11-1、碳酸钾、1-(叔丁氧羰基)哌嗪与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体12-1。
199.本发明将2-氟-5-硝基苯甲酸、醇化合物、三乙胺、hatu与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到中间体11-1。在本发明中，所述2-氟-5-硝基苯甲酸与醇化合物的摩尔比优选为1：（0.8~1.2），更优选为1：1；所述2-氟-5-硝基苯甲酸、三乙胺与hatu的摩尔比优选为（16.22~20.00）：（90~110）：（25~35），更优选为（16.22~20.00）：100：30。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷；所述二氯甲烷与所述2-氟-5-硝基苯甲酸的用量比优选为（45~55）ml：（16.22~20.00）mmol，更优选为50ml：（16.22~20.00）mmol。本发明优选2-氟-5-硝基苯甲酸、三乙胺、hatu与有机溶剂混合，充分溶解后加入醇化合物进行缩合反应。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为2.5~3.5 h，更优选为3 h。所述缩合反应后，本发明优选将所得产物体系减压浓缩去除溶剂，用乙酸乙酯溶解剩余物，有机相依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，然后再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层析纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=3：1），得到中间体11-1。
200.中间体11-1后，本发明将所述中间体11-1、碳酸钾、1-(叔丁氧羰基)哌嗪与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体12-1。在本发明中，所述中间体11-1、1-(叔丁氧羰基)哌嗪与碳酸钾的摩尔比优选为（5.48~6.56）：（8.22~9.84）：（12~13），更优选为（5.48~6.56）：（8.22~9.84）：12.46。在本发明中，所述有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺，所述有机溶剂与中间体11-1的用量比优选为（5.48~6.56）mmol：（10~20）ml，更优选为（5.48~6.56）mmol：15 ml。本发明对所述中间体11-1、碳酸钾、1-(叔丁氧羰基)哌嗪与有机溶剂混合方式没有特殊限定，能够实现均匀混合即可。在本发明中，所述取代反应优选在体系回流（温度优选为80℃）条件下进行；所述取代反应的时间优选为4~6 h，更优选为5 h。所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系过滤除去碳酸钾，向滤液中加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层
析纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=4：1），得到中间体12-1。
201.在本发明中，所述中间体12-2的制备方法优选包括以下步骤：
202.将2-氟-5-硝基苯甲酸、碳酸钾、r
6-h与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体11-2；
203.将所述中间体11-2、hobt、hatu、三乙胺与有机溶剂混合，进行活化反应，得到活化产物体系；
204.将所述活化产物体系与胺化合物混合，进行缩合反应，得到中间体12-2；
205.所述胺化合物的结构式如下所示：
206.；
207.所述r3、r4与r5如式iii中所定义；所述r6为、或。
208.本发明将2-氟-5-硝基苯甲酸、碳酸钾、f试剂与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体11-2。在本发明中，所述2-氟-5-硝基苯甲酸、f试剂与碳酸钾的摩尔比优选为（16.22~20）：（30~48.66）：（35~45），更优选为（16.22~20）：（30~48.66）：40。在本发明中，所述有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺，所述有机溶剂与所述2-氟-5-硝基苯甲酸的用量比优选为（10~20）ml：（16.22~20）mmol，更优选为15 ml：（16.22~20）mmol。本发明对所述2-氟-5-硝基苯甲酸、碳酸钾、f试剂与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够实现均匀混合即可。在本发明中，所述取代反应优选在体系回流（温度优选为80℃）条件下进行；所述取代反应的时间优选为4~6 h，更优选为5 h。所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系过滤除去碳酸钾，向滤液中加入水，用1 mol/l盐酸调节ph值至4，然后用乙酸乙酯萃取，有机相依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后进行硅胶柱层析纯化（按体积比计，所用洗脱液优选为石油醚：乙酸乙酯=1：1），得到中间体11-2。
209.得到中间体11-2后，本发明将所述中间体11-2、hobt、hatu、三乙胺与有机溶剂混合，进行活化反应，得到活化产物体系。在本发明中，所述中间体11-2、hobt、hatu与三乙胺的摩尔比优选为8.5：（2~3）：（12~13）：（40~45），更优选为8.5：2.55：12.75：42.5。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷，所述有机溶剂与所述中间体11-2的用量比优选为8.50 mmol：（35~45）ml，更优选为8.50 mmol：40 ml。本发明对所述中间体11-2、hobt、hatu、三乙胺与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够实现均匀混合即可。在本发明中，所述活化反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为25~35 min，更优选为30 min。所述活化反应后，本发明无需进行后处理，直接将所得活化产物体系进行后续反应。
210.得到活化产物体系后，本发明将所述活化产物体系与胺化合物混合，进行缩合反应，得到中间体12-2。在本发明中，所述胺化合物与中间体11-2的摩尔比优选为1：（0.8~1.2），更优选为1：1。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为5~7 h，更优选为6 h。所述缩合反应后，本发明优选将所得产物体系依次用水与饱和氯化钠溶液洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩，得到中间体12-2。
211.本发明提供了上述技术方案所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐在制备
ido1抑制剂中的应用。
212.本发明提供了上述技术方案所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
213.在本发明中，所述肿瘤优选包括非小细胞肺癌、乳腺癌或恶性胶质瘤。
214.本发明提供了一种肿瘤免疫治疗药物，包括活性成分和药学上可接受的载体，所述活性成分为上述技术方案所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐。在本发明中，所述药物中活性成分的含量优选为0.1~99wt%，更优选为1~99wt%，进一步优选为10~90wt%，更进一步优选为30~85wt%。在本发明中，所述药学上可接受的载体优选包括注射用水、丙二醇、甘露醇、甘油、硬脂酸、氯化钠、糊精、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、羟甲基淀粉钠、聚乙二醇、海藻酸和聚山梨酯80中的一种或多种。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、气雾剂、注射剂或栓剂。在本发明中，所述药物的给药方式优选包括静脉注射、口服、吸入或直肠给药。
215.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
216.制备例1
217.中间体2的合成步骤如下：
218.将亚硝酸钠（20.70 g, 0.3 mol）和超纯水（40 ml）室温搅拌混合，得到呈无色透明状的亚硝酸钠水溶液；将丙二腈（9.90 g, 0.15 mol）预溶于150 ml浓度为2 mol/l的盐酸中，然后滴加到所述亚硝酸钠水溶液中，于室温条件下搅拌反应12 h，然后将所得产物体系冷却至0℃，加入盐酸羟胺（23.00 g, 340.00 mmol）水溶液（40 ml），0℃条件下反应30 min后用浓度为10 mol/l的氢氧化钠水溶液调节ph值至10，移至室温条件下反应2 h，再加热至回流（100℃）反应2 h；反应结束后，将所得产物体系在室温放置12 h，过滤，滤饼用水洗净，减压干燥，得到白色固体14.1 g，为中间体2，收率65.7%。
219.制备例2
220.中间体3的合成步骤如下：
221.将中间体2（8.40 g, 58.74 mmol）与水（118 ml）室温搅拌混合，得到呈白色混浊状的料液，然后加入氯化钠（10.40 g, 177.8 mmol）、29 ml浓度为6 mol/l盐酸和60 ml乙酸，于45℃油浴中回流至溶液变澄清透明状，然后冷却至-8℃，将亚硝酸钠（4.00 g, 58.0 mmol）预溶于14 ml水中，滴加到上述冷却至-8℃的反应液中，0℃反应3 h；反应结束后，将所得产物体系升至室温放置3 h，过滤，滤饼用水洗净，减压干燥，得到白色固体4.64 g，为中间体3，收率48.7%。
222.制备例3
223.中间体4a的合成步骤如下：
224.将中间体3（4.05 g, 25.00 mmol）、四氢呋喃（thf, 50 ml）和碳酸氢钠（4.20 g, 50.00 mmol）在45℃油浴中搅拌混合，将3-溴-4-氟苯胺（5.121 g, 26.95 mmol）预溶于8 ml的四氢呋喃中，滴加到上述45℃的反应液中，回流（45℃）反应3 h，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1，紫外显色）；将所得产物体系趁热过滤，滤液减
压浓缩后加入50 ml石油醚打浆2 h，抽滤，滤饼减压干燥，得白色固体6.23 g，为中间体4a，收率80%。
225.按照中间体4a的合成步骤操作，不同之处在于利用3-氯-4-氟苯胺制备得到中间体4b，收率78%。
226.制备例4
227.中间体5a的合成步骤如下：
228.将80 ml乙酸乙酯和中间体4a（4.00 g, 12.66 mmol）室温搅拌混合，然后加入n,n'-羰基二咪唑（4.10 g, 25.32 mmol），室温反应4 h，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=2：1，紫外显色）；将所得产物体系依次用60 ml浓度为1 mol/l的盐酸、60 ml水与60 ml饱和氯化钠溶液各洗涤一次，之后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后加入60 ml无水乙醇打浆3 h，过滤，滤饼减压干燥，得到3.67 g灰白色固体，为中间体5a，收率84.8%。
229.按照中间体5a的合成步骤操作，不同之处在于利用中间体4b制备得到中间体5b，收率76%。
230.制备例5
231.中间体6a的合成步骤如下：
232.将90 ml三氟乙酸、中间体5a（4.20 g, 12.35 mmol）和30 ml浓度为30wt%的过氧化氢溶液混合，于45℃油浴反应18 h，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，紫外显色）；将所得产物体系置于冰浴中，滴加饱和na2so3水溶液，直至出现大量沉淀，过滤，滤饼用水洗净后减压干燥，得2.28 g黄色固体，为中间体6a，收率49.7%。
233.按照中间体6a的合成步骤操作，不同之处在于利用中间体5b制备得到中间体6b，收率51%。
234.制备例6
235.中间体7的合成步骤如下：
236.将40 ml thf、中间体6a（2.24 g, 6.05 mmol）和n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺（1.94 g, 12.10 mmol）混合，室温条件下搅拌反应2 h，出现大量灰白色固体，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，紫外显色）；将所得产物体系减压浓缩，得到2.34 g灰白色固体，为中间体7，收率79.9%。
237.制备例7
238.中间体8的合成步骤如下：
239.将40 ml乙酸乙酯、中间体7（1.82 g, 3.76 mmol）和20 ml hcl的乙酸乙酯溶液（hcl浓度为2 mol/l）混合，室温条件下搅拌反应4h，出现大量灰白色固体，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，紫外显色）；将所得产物体系抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤后减压干燥，得到1.30 g灰白色固体，为中间体8，收率89.7%。
240.制备例8
241.中间体11a的合成步骤如下：
242.将50 ml dcm、2-氟-5-硝基苯甲酸（3.70 g, 20.00 mmol）、三乙胺（10.10 g，100.00 mmol）与hatu（11.40 g，30.00 mmol）在室温条件下搅拌10 min至全溶，再加入4-甲硫基苯甲醇（3.08 g，20.00 mmol），室温条件下反应3 h，tlc检测反应完毕（按体积比计，展
氟苯乙胺（147.34 mg, 1.06 mmol）制备得到中间体9j；然后利用所述中间体9j制备得到127.00 mg化合物i-10，为白色固体，收率54.8%。m.p. 148.6~149.2℃。1h nmr (600 mhz, methanol-d4) δ 7.32
ꢀ–ꢀ
7.22 (m, 2h), 7.17
ꢀ–ꢀ
7.11 (m, 2h), 7.11
ꢀ–ꢀ
7.04 (m, 2h), 6.84 (ddd, j = 8.8, 4.1, 2.7 hz, 1h), 3.56 (t, j = 7.1 hz, 2h), 3.02 (t, j = 7.0 hz, 2h). 13
c nmr (151 mhz, methanol-d4) δ 161.35, 155.43, 155.25, 140.63, 139.35, 137.65, 130.95, 128.10, 126.36, 125.81, 123.98, 122.41, 115.33, 114.78, 107.41, 44.03, 27.86. hr-ms (esi): calcd. for c
17h15
o2n5brf2，[m+h]
+ 438.03717; found: 438.03677。
[0296]
实施例11
[0297]
按照实施例1中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（0.20 g, 0.53 mmol）与4-甲硫基苄胺（162.18 mg, 1.06 mmol）制备得到中间体9k；然后利用所述中间体9k制备得到120.00 mg化合物i-11，为白色固体，收率50.2%。m.p. 100.4~100.8℃。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 7.52 (s, 1h), 7.26 (d, j = 8.2 hz, 2h), 7.25
ꢀ–ꢀ
7.18 (m, 3h), 7.00 (t, j = 8.4 hz, 1h), 6.94
ꢀ–ꢀ
6.86 (m, 2h), 5.96 (t, j = 5.7 hz, 1h), 4.41 (d, j = 5.8 hz, 2h), 2.46 (s, 3h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 157.45, 155.82, 155.33, 142.36, 138.31, 138.03, 135.69, 134.52, 128.68, 128.42, 126.88, 124.38, 116.16, 108.71, 48.07, 15.85. hr-ms (esi): calcd. for c
17h15
o2n
581
brfnas，[m+na]
+ 475.99856; found: 475.99719。
[0298]
实施例12
[0299]
按照实施例1中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（0.20 g, 0.53 mmol）与4-甲氧基苄胺（145.22 mg, 1.06 mmol）制备得到中间体9l；然后利用所述中间体9l制备得到138.00 mg化合物i-12，为白色固体，收率59.9%。m.p. 130.1~130.7℃。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 7.32 (s, 1h), 7.29 (d, j = 8.3 hz, 2h), 7.22 (dd, j = 5.6, 2.3 hz, 1h), 7.02 (t, j = 8.4 hz, 1h), 6.95
ꢀ–ꢀ
6.82 (m, 4h), 5.86 (t, j = 5.1 hz, 1h), 4.41 (d, j = 5.6 hz, 2h), 3.80 (s, 3h). 13
c nmr (151mhz, chloroform-d) δ 159.21, 157.45, 155.82, 155.32, 142.43, 138.26, 135.73, 129.91, 129.30, 128.66, 124.34, 116.15, 114.15, 108.71, 55.36, 48.01. hr-ms (esi): calcd. for c
17h15
o3n5brfna，[m+na]
+ 458.02345; found: 458.02313。
[0300]
实施例13
[0301]
按照实施例1中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（0.20 g, 0.53 mmol）与3-氯苯乙胺（164.30 mg, 1.06 mmol）制备得到中间体9m；然后利用所述中间体9m制备得到144.00 mg化合物i-13，为黄色油状物，收率59.7%。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 7.72 (s, 1h), 7.25
ꢀ–ꢀ
7.18 (m, 4h), 7.10
ꢀ–ꢀ
7.07 (m, 1h), 6.99 (t, j = 8.4 hz, 1h), 6.91 (s, 1h), 6.88 (ddd, j = 8.8, 4.1, 2.7 hz, 1h), 5.80 (t, j = 5.9 hz, 1h), 3.53 (td, j = 7.0, 5.9 hz, 2h), 2.91 (t, j = 7.0 hz, 2h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 157.42, 155.79, 155.26, 142.29, 140.80, 138.40, 135.73, 134.16, 130.03, 129.04, 128.65, 126.97, 124.36, 116.16, 108.69, 45.32, 34.67. hr-ms (esi): calcd. for c
17h15
o2n
581
brclf，[m+h]
+ 456.00557; found: 456.00467。
[0302]
实施例14
122.70, 121.54, 121.46, 121.41, 117.87, 117.03, 67.11, 50.50, 47.90, 15.48. hr-ms (apci): calcd. for c
28h26
o6n7clfs，[m+h]
+ 642.13323; found: 642.13336。
[0331]
实施例27
[0332]
按照实施例25中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（200.00 mg, 0.54 mmol）与中间体13b（232.74 mg，0.54 mmol）制备得到200.00 mg化合物iii-3，为黄色油状物，收率50.7%。1h nmr (600 mhz, cdcl3) δ 8.62 (d, j = 2.8 hz, 1h), 8.31 (s, 1h), 8.24 (dd, j = 9.1, 2.8 hz, 1h), 7.31 (s, 1h), 7.08 (dd, j = 5.8, 2.7 hz, 1h), 6.99
ꢀ–ꢀ
6.90 (m, 2h), 6.74 (s, 2h), 6.69 (ddd, j = 8.8, 3.9, 2.9 hz, 1h), 5.30 (s, 2h), 3.88 (s, 9h), 3.40
ꢀ–ꢀ
3.30 (m, 4h), 3.17
ꢀ–ꢀ
3.06 (m, 4h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 165.86, 158.32, 157.21, 155.58, 155.48, 153.33, 140.93, 140.54, 140.05, 137.86, 135.01, 131.41, 128.02, 127.59, 123.13, 121.25, 117.64, 116.76, 116.61, 109.20, 109.05, 106.36, 67.60, 61.10, 56.36, 50.37, 48.15. hr-ms (apci): calcd. for c
30h30
o9n
781
brf，[m+h]
+ 732.12465; found: 732.12634。
[0333]
实施例28
[0334]
按照实施例25中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（200.00 mg, 0.54 mmol）与中间体13c（200.34 mg，0.54 mmol）制备得到181.00 mg化合物iii-4，为黄色油状物，收率50.0%。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.79
ꢀ–ꢀ
8.61 (m, 1h), 8.57 (d, j = 2.8 hz, 1h), 8.21 (dd, j = 9.1, 2.8 hz, 1h), 7.41 (d, j = 8.6 hz, 2h), 7.34 (s, 1h), 7.10 (dd, j = 5.8, 2.7 hz, 1h), 6.98
ꢀ–ꢀ
6.90 (m, 4h), 6.70 (dt, j = 8.7, 3.6 hz, 1h), 5.31 (s, 2h), 3.83 (s, 3h), 3.35
ꢀ–ꢀ
3.25 (m, 4h), 3.16
ꢀ–ꢀ
3.02 (m, 4h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 165.97, 159.72, 158.27, 157.45, 155.82, 155.56, 141.15, 140.28, 140.17, 134.60, 130.93, 127.98, 127.86, 127.80, 123.47, 121.87, 117.74, 116.87, 116.71, 114.30, 109.31, 109.16, 67.30, 55.62, 50.45, 47.93. hr-ms (esi): calcd. for c
28h24
o7n
781
brf，[m-h]
‑ 670.08787; found: 670.08765。
[0335]
实施例29
[0336]
按照实施例25中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（200.00 mg, 0.54 mmol）与中间体13e（199.80 mg，0.54 mmol）制备得到195.00 mg化合物iii-5，为黄色油状物，收率54.0%。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 9.00 (s, 1h), 8.74 (d, j = 2.8 hz, 1h), 8.40 (t, j = 5.7 hz, 1h), 8.19 (dd, j = 8.9, 2.8 hz, 1h), 7.37 (s, 1h), 7.27 (d, j = 8.6 hz, 2h), 7.16
ꢀ–ꢀ
7.07 (m, 2h), 7.02
ꢀ–ꢀ
6.90 (m, 1h), 6.85 (dd, j = 9.1, 2.3 hz, 2h), 6.73
ꢀ–ꢀ
6.62 (m, 1h), 4.55 (d, j = 5.7 hz, 2h), 3.75 (s, 3h), 3.01 (d, j = 5.6 hz, 4h), 2.98 (d, j = 5.0 hz, 4h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 164.84, 159.29, 157.98, 157.30, 155.66, 154.98, 143.40, 140.66, 140.26, 134.87, 129.96, 129.80, 128.26, 127.76, 127.19, 126.93, 123.24, 119.53, 116.74, 114.62, 109.13, 55.49, 51.49, 47.78, 43.52. hr-ms (esi): calcd. for c
28h25
o6n
881
brf，[m-h]
‑ 669.10385; found: 669.10364。
[0337]
实施例30
[0338]
按照实施例25中步骤操作，不同之处在于利用中间体6b（200.00 mg, 0.61 mmol）与中间体13c（226.31 mg，0.61 mmol）制备得到186.00 mg化合物iii-6，为黄色油状物，收率48.8%。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.73 (s, 1h), 8.57 (d, j = 2.8 hz, 1h), 8.20 (dd, j = 9.1, 2.8 hz, 1h), 7.44
ꢀ–ꢀ
7.38 (m, 2h), 7.34 (s, 1h), 6.99
ꢀ–ꢀ
6.90 (m, 5h), 6.66 (ddd, j = 8.9, 3.9, 2.8 hz, 1h), 5.30 (s, 2h), 3.83 (s, 3h), 3.34
ꢀ–ꢀ
3.25 (m, 4h), 3.15
ꢀ–ꢀ
3.04 (m, 4h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 165.95, 159.77, 158.24, 156.42, 155.58, 154.77, 141.09, 140.21, 134.37, 130.87, 127.89, 125.07, 122.59, 121.80, 121.52, 121.39, 117.76, 117.08, 116.93, 114.29, 67.31, 60.47, 55.58, 50.44, 47.90. hr-ms (esi): calcd. for c
28h26
o7n7clf，[m+h]
+ 626.15608; found: 626.15570。
[0339]
实施例31
[0340]
按照实施例25中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（200.00 mg, 0.54 mmol）与中间体13d（216.54 mg，0.54 mmol）制备得到174.00 mg化合物iii-7，为黄色油状物，收率46.1%。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.76
ꢀ–ꢀ
8.62 (m, 1h), 8.36
ꢀ–ꢀ
8.11 (m, 1h), 7.35 (d, j = 23.8 hz, 1h), 7.12 (dd, j = 5.6, 2.7 hz, 1h), 6.95 (ddt, j = 12.0, 8.6, 3.6 hz, 2h), 6.76
ꢀ–ꢀ
6.67 (m, 1h), 6.66
ꢀ–ꢀ
6.55 (m, 2h), 6.50
ꢀ–ꢀ
6.42 (m, 1h), 5.29 (s, 2h), 3.79 (d, j = 2.8 hz, 6h), 3.32 (s, 4h), 3.25
ꢀ–ꢀ
3.12 (m, 4h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 165.60, 160.99, 158.22, 157.45, 155.84, 141.15, 140.17, 137.50, 134.59, 128.33, 128.04, 127.92, 123.39, 121.29, 118.04, 116.79, 109.26, 106.60, 100.66, 67.34, 55.55, 50.56, 47.93. hr-ms (esi): calcd. for c
29h28
o8n7brf，[m+h]
+ 700.11613; found: 700.11578。
[0341]
实施例32
[0342]
按照实施例25中步骤操作，不同之处在于利用中间体6a（200.00 mg, 0.54 mmol）与中间体13f（208.44 mg，0.54 mmol）制备得到174.00 mg化合物iii-8，黄色油状物，收率47.2%。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.78 (d, j = 2.8 hz, 1h), 8.56 (s, 1h), 8.40 (t, j = 5.8 hz, 1h), 8.22 (dd, j = 8.9, 2.8 hz, 1h), 7.33 (s, 1h), 7.29 (d, j = 8.2 hz, 2h), 7.20 (d, j = 8.2 hz, 2h), 7.13 (d, j = 8.9 hz, 1h), 7.09 (dd, j = 5.8, 2.7 hz, 1h), 6.94 (t, j = 8.4 hz, 1h), 6.67 (dt, j = 8.7, 3.6 hz, 1h), 4.58 (d, j = 5.9 hz, 2h), 3.11
ꢀ–ꢀ
3.04 (m, 4h), 3.04
ꢀ–ꢀ
2.96 (m, 4h), 2.45 (s, 3h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 164.93, 157.91, 154.90, 143.52, 140.73, 140.22, 138.35, 134.77, 134.61, 128.99, 128.28, 127.88, 127.28, 126.99, 126.84, 123.39, 119.51, 116.84, 116.68, 109.14, 60.43, 51.50, 47.90, 43.52, 15.47. hr-ms (esi): calcd. for c
28h27
o5n8brfs, [m+h]
+
, 685.09870; found: 685.10137。
[0343]
实施例33
[0344]
化合物iv-1的合成步骤如下：
[0345]
（1）将30 ml乙腈、中间体14a（300.00 mg, 0.59 mmol）、中间体5a（201.78 mg, 0.59 mmol）和碳酸钾（162.84 mg, 1.18 mmol）混合，回流（60℃）反应18 h，tlc检测反应完
126.03, 125.17, 121.90, 118.13, 116.37, 107.46, 50.24, 49.99, 45.50, 43.58, 42.86, 41.42, 15.39. hr-ms (esi): calcd. for c
30h20
o6n
981
brfs，[m+h]
+ 744.11812; found: 744.12000。
[0357]
实施例39
[0358]
化合物iv-7的合成步骤如下：
[0359]
按照实施例33中步骤操作，不同之处在于利用中间体14a（300.00 mg, 0.59 mmol）与中间体8（227.74 mg，0.59 mmol）制备得到中间体15g；然后利用所述中间体15g制备得到180.00 mg化合物iv-7，为黄色油状物，收率38.8%。
1 h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.58 (s, 1h), 8.16 (d, j = 8.8 hz, 1h), 7.35 (d, j = 8.1 hz, 2h), 7.24 (d, j = 8.1 hz, 2h), 7.12 (s, 1h), 7.09
ꢀ–ꢀ
7.05 (m, 1h), 6.94
ꢀ–ꢀ
6.86 (m, 2h), 6.77 (d, j = 8.0 hz, 1h), 6.52 (s, 1h), 5.28 (d, j = 14.3 hz, 2h), 3.74 (s, 2h), 3.66 (s, 4h), 3.40 (s, 2h), 3.18 (s, 2h), 3.12 (d, j = 17.0 hz, 4h), 2.46 (s, 3h). 13
c nmr (151 mhz, chloroform-d) δ 165.45, 156.80, 155.56, 155.18, 141.25, 140.22, 139.55, 138.91, 136.13, 131.82, 129.45, 128.27, 128.03, 127.56, 126.39, 123.41, 120.88, 117.88, 116.14, 115.99, 108.58, 108.43, 67.17, 51.18, 50.39, 48.99, 47.19, 44.07, 42.57, 41.76, 15.52. hr-ms (esi): calcd. for c
32h34
o7n
981
brfs，[m+h]
+ 788.14434; found: 788.14594。
[0360]
实施例40
[0361]
化合物iv-8的合成步骤如下：
[0362]
向甲苯（10 ml）中加入化合物ca-4（300 mg, 0.95 mmol）、2-溴乙醇（141 mg, 1.14 mmol）、三苯基膦（299 mg, 1.14 mmol）和偶氮二甲酸二异丙酯（230 mg, 1.14 mmol），在室温条件下反应24 h，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，紫外显色）；减压蒸干所得产物体系中溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离纯化（按体积比计，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯=4：1），得到白色油状产物215 mg，为中间体16，收率54%；
[0363]
向乙腈（30 ml）中加入中间体16（200 mg, 0.47 mmol）、中间体8（183 mg, 0.47 mmol）和碳酸钾（129 mg, 0.94 mmol），在80℃条件下搅拌反应20 h，tlc检测反应完毕（按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇=10：1，紫外显色）；将所得产物体系过滤去除碳酸钾，滤液减压蒸干后经硅胶柱层析分离纯化（按体积比计，洗脱液为二氯甲烷：甲醇=30：1），得到灰白色固体90 mg，为化合物iv-8，收率27%。m.p. 100.0~101.6℃。1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 7.21 (dd, j = 5.9, 2.7 hz, 1h), 7.13 (s, 1h), 6.98 (t, j = 8.4 hz, 1h), 6.89 (td, j = 9.2, 8.7, 3.3 hz, 2h), 6.84 (d, j = 1.9 hz, 1h), 6.79 (d, j = 8.3 hz, 1h), 6.50 (s, 2h), 6.46 (s, 2h), 6.06 (t, j = 5.8 hz, 1h), 5.30 (s, 2h), 4.39
ꢀ–ꢀ
4.35 (m, 2h), 4.12
ꢀ–ꢀ
4.08 (m, 2h), 3.81 (s, 3h), 3.79 (s, 3h), 3.69 (s, 6h), 3.36 (q, j = 5.8 hz, 2h), 2.96 (t, j = 5.9 hz, 2h). 13
c nmr (151 mhz, methanol-d4) δ 156.56, 155.85, 154.95, 152.86, 148.89, 147.41, 140.82, 138.95, 136.94, 133.40, 130.22, 129.34, 128.76, 127.44, 123.68, 122.71, 115.39, 114.55, 111.76, 107.37, 106.00, 103.39, 72.83, 67.59, 59.81, 55.11, 55.05, 41.77, 40.52, 38.17. hr-ms (esi): calcd. for c
31h35
o7n
681
brf，[m+h]
+ 703.17087; found: 703.17194。
[0364]
测试例1
[0365]
将实施例1~40制备的n-羟基脒衍生物进行ido1抑制活性测试，具体如下：
[0366]
（1）生化水平ido1抑制活性测定
[0367]
在100 μl标准反应体系中，主要包括50 mm磷酸二氢钾缓冲液（ph 6.5）、10 mm抗坏血酸、10 μm亚甲蓝、100 μg/ml牛肝过氧化氢酶、100 μm l-trp、100 nm ido1及不同浓度待测化合物。将96孔板置于37℃反应30 min，加入40 μl的40%（w/v）三氯乙酸终止反应。后将样品在65℃孵育15 min以促进犬尿氨酸的产生。最后加入60 μl的对二甲氨基苯甲醛-冰醋酸溶液（3.75%，w/v）。用酶标仪测定混合溶液在490 nm波长处吸光度，按照以下公式计算化合物对ido1抑制率，其中，酶活初筛化合物浓度为100 μm，抑制率大于50%的化合物用二倍稀释法稀释并测定，使用graphpad prism 9通过非线性回归分析确定ic
50
值：
[0368]
。
[0369]
（2）细胞水平ido1抑制活性测定
[0370]
将hela细胞以2
×
104/孔的密度接种于96孔培养板中，最终体积为200 μl，置于37℃、5% co2培养箱中培养过夜。次日，弃原来培养基，加入含终浓度为100 ng/ml人干扰素-γ、50 μm l-trp和不同浓度待测化合物的细胞培养基200 μl，置于37℃、5% co2培养箱中培养48 h后，取140 μl上清液与10 μl 40%（w/v）三氯乙酸混合，65℃孵育15 min。后将混合物以2500 r/min的速度离心10 min以去除沉淀物。取100 μl的上清液与等体积对二甲氨基苯甲醛-冰醋酸溶液（2%，w/v）混合，室温孵育10 min，于490 nm波长处读取吸光度，计算化合物对ido1抑制率（计算公式同上），细胞初筛化合物浓度为10 μm，抑制率大于50%的化合物用二倍稀释法稀释并测定，使用graphpad prism 9计算ec
50
值。
[0371]
（3）细胞毒性测定
[0372]
为探讨hela细胞水平生物活性是由ido1抑制引起的，而不是由细胞毒性造成的假阳性，采用mtt法评价了生化及细胞水平酶抑制活性均较好的化合物对hela细胞的细胞毒性（cc
50
）（阳性对照为5-fu）。hela细胞以5
×
103/孔的密度接种于96孔培养板中，终体积为100 μl，置于37℃、5% co2培养箱中培养过夜。次日，弃原有培养基，每孔加入含药培养基100 μl，置于37℃、5% co2恒温培养养箱中培养48 h。弃原有培养基，每孔加入1 mg/ml mtt工作液100 μl（避光操作），37℃恒温培养3.5~4 h。弃掉反应液，每孔加入150 μl dmso溶液，将96孔板置于微量振荡器上震荡5 min，确保结晶完全溶解。用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。按照以下公式计算细胞相对存活率，graphpad prism软件计算药物cc
50
值并绘制浓度-生存率曲线：
[0373]
。
[0374]
测定结果整理如表1~2和图1~8所示（以epacadostat为阳性对照）。其中，图1和图2为epacadostat对ido1的抑制活性测定结果，图3和图4为化合物i-1对ido1的抑制活性测定结果，图5和图6为化合物i-2对ido1的抑制活性测定结果，图7和图8为化合物iv-7对ido1的抑制活性测定结果。
[0375]
表1实施例1~24制备的化合物的活性测试结果
[0376][0377]
注：aic
50
、ec
50
和cc
50
的值是至少三次试验的平均值；“nd”代表未检测。
[0378]
表2实施例25~40制备的化合物的活性测试结果
[0379][0380]
注：aic
50
、ec
50
和cc
50
的值是至少三次试验的平均值；“nd”代表未检测。
[0381]
表1~2和图1~8的活性评价实验数据表明，化合物i-5、i-8和i-13对ido1的抑制活性优于化合物i-11、i-12和i-14；化合物i-1、i-2与i-3、i-5、i-6、i-7、i-8对比，新引入侧链苯环上有取代基（吸电子取代基，给电子取代基）的化合物，在细胞水平上对ido1的抑制活性下降5~65倍，酶活性相差不大；同时，用哌嗪取代亚甲基，得到的化合物i-15~i-18对ido1几乎没有抑制活性。
[0382]
对比化合物ii-1、ii-3、ii-4、ii-5，在细胞水平上，侧链苯环上哌嗪取代的化合物对ido1的抑制活性＞吗啉取代的化合物＞硫代吗啉取代的化合物＞boc哌嗪取代的化合物，其hela ec
50
在0.199~8.65 μm之间，在酶活水平上活性相差不大；对比化合物ii-2与ii-3，将苯环换为吡啶，化合物的活性相差不大；同时，将苯环上的c-2位杂环和c-5位硝基换成氟，化合物ii-6在细胞水平和酶活水平上对ido1的抑制活性都有所提高。
[0383]
总体而言，本发明化合物i-1、i-2、ii-5、ii-6、iv-3、iv-6和iv-7在细胞水平上具有较好的ido1抑制活性，其hela ec
50
值低于200 nm。为了研究该化合物的细胞活性是由ido1抑制引起的，还是仅仅由细胞毒性引起的，本发明还采用基于细胞的方法测定了活性较好化合物i-1、i-2、ii-5、ii-6、iv-3、iv-6和iv-7对hela细胞的cc
50
值，并计算得到选择指数si（cc
50
/ec
50
）在91.66~37423之间（一般认为选择指数si》30，表明在细胞活性是由ido1抑制引起的）。尤其值得注意的是化合物iv-7（hela ec
50 = 0.00017
±
0.01 μm），是目前ido1抑制剂中在细胞水平上对ido1抑制活性最好的化合物，其hela ec
50
值达到了亚纳摩尔级，具有进一步临床开发应用的价值，可以作为药物先导分子进一步研究开发。
[0384]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种n-羟基脒衍生物，其特征在于，具有式i、式ii、式iii、式iv-a、式iv-7或式iv-8所示结构：式i；式ii；式iii；式iv-a；式iv-7；式iv-8；式i中r1为、、、、、、、、、、、、、、、、或；式ii中r2为、、、、或；式iii中r1为-cl或-br；式iii和式iv-a中，r3为-h、-sch3或-och3，r4为-h或-och3，r5为-h或-och3，x为-o-或-nh-。2.根据权利要求1所述的n-羟基脒衍生物，其特征在于，所述n-羟基脒衍生物为以下化合物中的任一种：、、、
、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、
、、、、、、、、、。3.权利要求1或2所述n-羟基脒衍生物的制备方法，其特征在于，（i）具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：将取代胺化合物、中间体6a与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体9；将所述中间体9、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式i所示结构的n-羟基脒衍生物；所述取代胺化合物为n-苯基乙二胺、2-(吡啶-2-基)乙胺、4-氟苯乙胺、3,4,5-三氟苄胺、4-甲基苯乙胺、4-溴苯乙胺、2-(4-三氟甲基苯基)乙胺、4-羟基苯乙胺、3-氟苯乙胺、2-氟苯乙胺、4-甲硫基苄胺、4-甲氧基苄胺、3-氯苯乙胺、3-氯苄胺、4-哌嗪基苯腈、3-羟基苯基哌嗪、1-苯甲酰基哌嗪或1-乙酰基哌嗪；所述中间体6a和中间体9的结构式依次如下所示：；；所述r1如式i所定义；（ii）具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：（ii-1）将取代甲酸化合物、中间体8、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三唑、三乙胺与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到中间体10；将所述中间体10、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式ii所示
结构的n-羟基脒衍生物；所述取代甲酸化合物为2-(4-吗啉基)-5-硝基苯甲酸、2-(4-硫代吗啉基)-5-硝基苯甲酸、2-(4-boc-哌嗪基)-5-硝基苯甲酸、6-三氟甲基烟酸或2,5-二氟苯甲酸；所述中间体8和中间体10的结构式依次如下所示：；；所述r2如式ii中所定义；（ii-2）将中间体10d与有机溶剂混合，在酸性条件下进行脱保护基反应，得到中间体10e；将所述中间体10e、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式ii所示结构的n-羟基脒衍生物；所述中间体10d与中间体10e的结构式依次如下所示：；；（iii）具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：将中间体6、中间体13、有机溶剂与氢氧化钠水溶液混合，进行取代-开环反应，得到具有式iii所示结构的n-羟基脒衍生物；所述中间体6和所述中间体13的结构式依次如下所示：；；所述r1、r3、r4、r5与x如式iii中所定义；（iv-1）具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：将中间体5a、中间体14、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体15；将所述中间体15、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式iv-a所示结构的n-羟基脒衍生物；所述中间体5a、中间体14与中间体15的结构式依次如下所示：
；；；所述r3、r4、r5与x如式iv中所定义；所述r7为-cl或-br；（iv-2）具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：将中间体8、中间体14a、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体15g；将所述中间体15g、氢氧化钠水溶液与有机溶剂混合，进行开环反应，得到具有式iv-7所示结构的n-羟基脒衍生物；所述中间体14a和中间体15g的结构式依次如下所示：；；（iv-3）具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物的制备方法，包括以下步骤：将化合物ca-4、2-溴乙醇、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯与有机溶剂混合，进行取代反应，得到中间体16；将所述中间体16、中间体8、碳酸钾与有机溶剂混合，进行取代-开环反应，得到具有式iv-8所示结构的n-羟基脒衍生物；所述化合物ca-4与中间体16的结构式依次如下所示：；。4.权利要求1或2所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐在制备ido1抑制剂中的应用。5.权利要求1或2所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌或恶性胶质瘤。7.一种肿瘤免疫治疗药物，包括活性成分和药学上可接受的载体，所述活性成分为权利要求1或2所述n-羟基脒衍生物或其药学上可接受的盐。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括射用水、丙二醇、甘露醇、甘油、硬脂酸、氯化钠、糊精、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、羟甲基淀粉钠、聚乙二醇、海藻酸和聚山梨酯80中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、气雾剂、注射剂或栓剂。10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括静脉注射、口服、吸入或直肠给药。

技术总结
本发明提供了N-羟基脒衍生物及制备方法和应用、肿瘤免疫治疗药物，属于医药技术领域。本发明提供了一种N-羟基脒衍生物，本发明以处于III期临床试验的N-羟基脒类抑制剂Epacadostat为先导物，通过研究Epacadostat与IDO1复合物的晶体结构，保留了活性部位呋咱环、N-羟基脒基和苯环部分，对侧链氨基磺酰胺进行结构修饰，设计合成了具有较好IDO1抑制活性的新型N-羟基脒衍生物，能够用于制备肿瘤免疫治疗药物。疫治疗药物。疫治疗药物。


技术研发人员：山广志 周霞 刘伊彤 赵午莉 赵聪 左利民 朱志玲 李怡然 赵学佳 赵婷 赵圣楠 姜艺菲 连晓芳 孟庆国
受保护的技术使用者：中国医学科学院医药生物技术研究所
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/7/22