一种新型链霉亲和素填料及其制备方法与流程

1.本发明涉及生化分离介质技术领域，尤其涉及一种新型链霉亲和素填料及其制备方法。


背景技术：

2.亲和层析是一种通过分子间的特异性识别和相互作用来分离纯化物质的层析方法，如酶与底物、抗原和抗体之间专一的相互作用等，将其一作为配基固定在填料上，就可以从初始样品中吸附相应的生物分子，然后通过合适的洗脱将其解离达到纯化的目的。亲和层析具有高选择性、高分辨率、高结合载量的优点，经常可以一步纯化达到＞90％的纯度，能够完成一般方法很难完成的物质分离。
3.链霉亲和素(streptavidin，简称sa)是一种来自于链霉菌的四聚体蛋白质，大小为66kda，它具有高效结合生物素(biotin)的能力，解离常数达到了10-14
，是目前已知的最强的生物分子间的相互作用之一。链霉亲和素和生物素之间的相互作用，被广泛地用于核酸检测、单分子成像、蛋白质相互作用、临床诊断等许多方面，是生物技术关键性的一种研究手段。
4.链霉亲和素与亲和素相似，能与生物素特异性结合，但是与亲和素相比，链霉亲和素的等电点低(等电点6.0)，不含糖基，其非特异性结合远比亲和素低，尤其在免疫组织化学和dna分子杂交检测中，几乎无背景显色。
5.目前市面上有一些链霉亲和素填料，但是生物素结合量低，在300nmol/ml左右，且耐碱性低。因此探究一种高耐压、耐碱，低非特异性吸附，具有较高的生物素结合量，且制备工艺简单，能快速放大生产的链霉亲和素填料也是目前市场的迫切需求。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明旨在于提供一种新型链霉亲和素填料及其制备方法，其具有较好的耐碱性能和对生物素或生物素化样品具有高度的亲合性。
7.本发明首先提供了一种新型链霉亲和素填料的制备方法，包含如下步骤：
8.1)基质亲水改性：将聚合物基质分散在碱性溶液1中，加入环氧试剂1、葡聚糖搅拌反应，过滤清洗得到中间体1；
9.2)环氧活化：将所述中间体1分散在碱性溶液2中，加入环氧试剂2搅拌反应，过滤清洗得到中间体2；
10.3)偶联链霉亲和素：将所述中间体2、pb缓冲液、链霉亲和素水溶液混合，调节ph，反应，得到一种新型链霉亲和素填料。
11.基质亲水改性的条件为先将聚合物基质分散在碱性溶液1中0.5-1小时，然后加入环氧试剂1、葡聚糖，在25-70℃下搅拌8.0-40小时，优选的在25-45℃下搅拌10-24小时，过滤清洗得到中间体1。通过化学键合在基质表面引入葡聚糖分子，使基质表面富含大量-oh，表现出较好的亲水性，减少特异性吸附。
12.环氧活化的条件为先将所述中间体1分散在碱性溶液2中0.5-2小时，然后加入环氧试剂2，在40-105℃下搅拌4-24小时，优选的在60-75℃下搅拌4-6小时，过滤清洗得到中间体2。
13.进一步地，本发明对聚合物基质没有限制，大部分聚合物都可以实现，优选的聚合物基质为聚苯乙烯/二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺；所述基质为多孔微球，孔径在粒径为5.0-100μm。
14.优选的，所述基质的孔径为粒径为80μm；优化至孔径粒径60μm再优化至孔径粒径50μm。
15.进一步地，所述碱性溶液1和碱性溶液2为无机碱，包括氢氧化钠、氢氧化钾等，所述碱性溶液1的浓度为0.5-2.0m，所述碱性溶液2的浓度为0.5-6.0m，优选的，碱性溶液2的浓度为0.5-4.0m。
16.碱性溶液1和碱性溶液2既可以使用同一种无机碱溶液，也可以使用不同种碱溶液。
17.进一步地，所述环氧试剂1和环氧试剂2选自表氯醇、乙二醇缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2-环己二醇二缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚，环氧试剂1和环氧试剂2既可以使用同一种化合物，也可以使用不同的化合物。
18.进一步地，所述葡聚糖的分子量为2000-200000，例如可以是2000、6000、20000、40000、200000等。
19.进一步地，所述基质与所述葡聚糖的质量比为1.0:0.02-0.4，所述基质与所述环氧试剂1的质量比为1.0:1.0-1.5。
20.进一步地，所述基质与所述环氧试剂2的质量比为1.0:2.0-2.5。
21.进一步地，所述ph的范围为5.0-12.0，优选的ph的范围为6.5-9.0。偶联链霉亲和素时，反应环境在酸性或碱性条件下均可，但在偏碱性条件下，偶联效果会更好；调节ph所用的试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等无机碱。
22.进一步地，偶联链霉亲和素时，在25-45℃下反应16-24小时，优选的在25-40℃下反应16-18小时。
23.进一步地，在加入偶联链霉亲和素前，先将所述中间体2分散在水中0.5-2小时。通常情况下，不先进行分散也可，但先分散再偶联，效果会更好。
24.此外，本发明还提供了由上述方案制备得到的新型链霉亲和素填料。
25.有益效果：
26.本发明的新型链霉亲和素填料对生物素或者生物素化的物质具有高度的亲和性，生物素结合量最高可达到377nmol/ml。由于采用了聚合物基质的大孔基球，表面做了亲水性处理，所以具有很好的耐碱性，在0.1m naoh溶液中浸泡48小时后，生物素结合量下降小于0.8％。此外该填料还具有较好的耐压性、较高的传质效率以及优良的亲水性，非特异性吸附极低；另外本发明工艺简单，易放大规模化成产。
附图说明
27.图1为实施例1制备的填料纯化生物素的图谱。
具体实施方式
28.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
29.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
30.实施例1
31.s1、基质亲水改性
32.天平准确称量聚甲基丙烯酸酯基球10g加入500ml三口烧瓶中，将200ml 0.5mol/lnaoh溶液加入反应瓶中搅拌1.0小时，加入环氧氯丙烷10g，4.0g葡聚糖2000，25℃搅拌10.0小时，反应结束后用布氏漏斗过滤，200ml乙醇洗涤，再用超纯水清洗至ph试纸显示中性，抽干备用，得到中间体1。
33.s2、环氧活化
34.将上述中间体1转移至500ml三口烧瓶中，加入200ml 1.5mol/l的氢氧化钠水溶液，搅拌反应1.0小时，然后再加入20g乙二醇缩水甘油醚，25℃下搅拌4小时，反应结束后用布氏漏斗过滤，用超纯水洗至中性，得到中间体2。
35.s3、偶联配基
36.将上述中间体2加入250ml三口烧瓶中，加入50ml 20mm pb缓冲液，加入4.0ml 2.0mg/ml链霉亲和素(sa)水溶液，ph调至8.0，40℃反应20h，反应结束后用布氏漏斗过滤，依次用500ml乙醇、500ml超纯水清洗填料，最终将填料保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。
37.实施例2
38.与实施例1区别在于，在s1基质亲水改性中，将葡聚糖2000换成葡聚糖4000，其余过程与实施例1相同。
39.实施例3
40.与实施例1区别在于，在s1基质亲水改性中，将葡聚糖2000换成葡聚糖6000，其余过程与实施例1相同。
41.实施例4
42.与实施例1区别在于，在s2环氧活化中，将乙二醇缩水甘油醚换成1,4-丁二醇二缩水甘油醚，其余过程与实施例1相同。
43.对照例
44.与实施例1相比，区别在于在s3偶联配基步骤中不添加sa，其余过程与实施例1相同。sa亲和填料的吸附与洗脱测试
45.层析柱：取实施例1制备的sa亲和填料装填4.6*50mm的层析柱；
46.仪器：蛋白纯化系统scg；
47.流速：0.34ml/min；
48.检测器：uv 280nm；
49.流动相：a：20mm nah2po4+150mm nacl，ph 7.4；
50.b：8m盐酸胍，ph 1.5；
51.上样量：5μl(3.4mg/ml的生物素)；
52.柱温：室温；
53.方法：
54.平衡：100％a，12min；
55.洗脱：100％b，16min；
56.下表1为实施例1-4与对照例的测试结果
57.表1
[0058][0059][0060]
下表2实施例1和实施例4的泡碱测试结果
[0061]
(泡碱条件：将填料浸入0.1m naoh溶液中48小时)
[0062]
表2
[0063][0064]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种新型链霉亲和素填料的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：1)基质亲水改性：将聚合物基质分散在碱性溶液1中，加入环氧试剂1、葡聚糖搅拌反应，过滤清洗得到中间体1；2)环氧活化：将所述中间体1分散在碱性溶液2中，加入环氧试剂2搅拌反应，过滤清洗得到中间体2；3)偶联链霉亲和素：将所述中间体2、pb缓冲液、链霉亲和素水溶液混合，调节ph，反应，得到一种新型链霉亲和素填料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物基质选自聚苯乙烯/二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺；所述基质为多孔微球，孔径在粒径为5.0-100μm。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液1和碱性溶液2为无机碱，包括氢氧化钠、氢氧化钾，所述碱性溶液1的浓度为0.5-2.0m，所述碱性溶液2的浓度为0.5-6.0m。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环氧试剂1和环氧试剂2选自表氯醇、乙二醇缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2-环己二醇二缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为2000-200000。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基质与所述葡聚糖的质量比为1.0:0.02-0.4，所述基质与所述环氧试剂1的质量比为1.0:1.0-1.5。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基质与所述环氧试剂2的质量比为1.0:2.0-2.5。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ph的范围为5.0-12.0。9.一种新型链霉亲和素填料，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述方法制备而成。

技术总结
本发明公开了一种新型链霉亲和素填料及其制备方法，以聚苯乙烯/二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺等聚合物基球为基质，先对其表面进行亲水性修饰后，再引入环氧基团，随后将链霉亲和素键合在已活化的基质上形成链霉亲和素(SA)亲和填料。该SA亲和填料具有较好的耐碱性能，且对生物素或生物素化样品具有高度的亲合性。的亲合性。


技术研发人员：赵毛雨 胡新妹 黄学英
受保护的技术使用者：苏州赛分科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/7/22