MK-571作为流感病毒mRNA疫苗佐剂的应用

mk-571作为流感病毒mrna疫苗佐剂的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种mk-571作为流感病毒mrna疫苗佐剂的应用。


背景技术：

2.流行性感冒，简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，通过空气飞沫传播，是传播速度最快的传染病之一。季节性流感每年导致全球300-500万例重症病例，29-65万死亡病例。甲型h1n1流感病毒，自1918年西班牙流感大流行后就扎根人群，与h3n2、b型流感病毒交替流行，不断危害人类健康。由于流感病毒自身易变异，因此会出现候选疫苗株和流行毒株之间抗原不匹配的情况。目前，接种流感疫苗仍然是预防流感的最有效方式。
3.mrna疫苗可以作为一种应对新发突发传染病的应急疫苗。与传统疫苗相比，mrna疫苗的优势包括：研发速度快、安全性高、不整合到基因组、可批量生产。因此，面对易变异的流感病毒，可以开展mrna疫苗的研发。
4.在对肿瘤mrna疫苗的长期研究过程中，研究人员尝试多种递送技术用于实现抗原表达效率的最大化。同时，引入具有免疫激活活性的佐剂用于增强机体对肿瘤mrna疫苗的免疫应答。然而，在预防或治疗病毒感染的mrna疫苗中，佐剂的种类却相对较少。
5.在佐剂设计的策略中，最为常规的方法是将编码抗原的mrna与佐剂分子通过包封材料共同封装进同一聚合物内，确保两个必需的组分共同递送进入相同的抗原递呈细胞中。发明人所在的团队，前期借鉴肿瘤mrna疫苗的研究经验，将r848佐剂应用至h5n1亚型禽流感病毒mrna疫苗的研究中。结果显示，r848佐剂的加入显著增强机体产生体液和细胞免疫应答，有效预防h5n1亚型禽流感病毒的感染。因此，筛选并应用新型佐剂是提升流感病毒mrna疫苗效果的关键。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的一个目的在于提供一种mk-571作为流感病毒mrna疫苗佐剂在制备流感病毒mrna疫苗中的应用。
7.在预防或治疗病毒感染的mrna疫苗研究中，佐剂的种类相对较少。然而，疫苗佐剂又是提升免疫效果的关键。因此，有必要开发新的或筛选现有的免疫佐剂进行尝试。本发明选择mk-571(一种白三烯拮抗剂，可增强基因在体外和体内的递送)作为免疫佐剂，并用于制备流感病毒mrna疫苗。
8.根据文献报道，该研究团队选择210种化合物分别预处理细胞，然后利用脂质纳米颗粒(lnp)包裹mrna转染细胞，确定了几种可使转染增强的化合物。对这几种化合物进一步验证表明，只使用一种化合物mk-571对细胞进行预处理便可使转染效果增加200％。最后，在balb/c小鼠体内进行静脉给药，比较lnp和lnp-mk571的体内给药情况，结果发现两种纳米颗粒在肝脏和脾脏中均显示基因表达，而lnp-mk571在两个器官中均在6小时后表达量显著增加(超过2倍)，表明这种生物活性亲脂性化合物可以增强体外和体内转染。因此，我们
将目光聚焦于mk-571，并首次将其作为mrna疫苗佐剂，在流感病毒mrna疫苗的设计中进行尝试。结果表明，mk-571能够增强基因在体内的递送，诱导机体产生更强的体液及细胞免疫应答，最终能够有效预防流感病毒的感染。因此，mk-571作为流感病毒mrna疫苗佐剂进行使用，为流感病毒mrna疫苗的开发提供了一种新策略。
9.本发明的另一目的在于提供一种流感病毒mrna疫苗，其包括流感病毒mrna和mk-571。
10.本发明首次将mk-571作为免疫佐剂应用于流感病毒mrna疫苗中，mrna疫苗中加入mk-571佐剂，能够提升mrna在体内的翻译效率，诱导机体产生更强的体液免疫和细胞免疫应答，有效预防流感病毒的感染。因此，mk-571作为mrna疫苗佐剂进行使用，为流感病毒mrna疫苗的开发提供了一种新策略。
11.在一些实施例中，所述流感病毒mrna疫苗还包括脂质纳米颗粒。
12.在一些实施例中，所述流感病毒mrna和所述mk-571的质量比为10:3。
13.在一些实施例中，所述流感病毒mrna和所述脂质纳米颗粒p/n的摩尔比为1:5.67。
14.在一些实施例中，所述流感病毒mrna为h1n1亚型流感病毒血凝素(ha)基因的mrna。
15.本发明的另一目的在于提供一种流感病毒mrna疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
16.提供流感病毒mrna和mk-571；
17.将所述流感病毒mrna和所述mk-571与递送载体混合，得到所述流感病毒mrna疫苗。
18.本发明的流感病毒mrna疫苗的制备方法，包括分别提供流感病毒mrna和mk-571，再与递送载体进行混合处理即可得到疫苗。该制备方法简单快捷，不需要提供大型仪器设备。
19.在一些实施例中，所述递送载体为脂质纳米颗粒。
20.在一些实施例中，将所述流感病毒mrna和所述mk-571与递送载体混合具体包括以下步骤：
21.先将流感病毒mrna与所述mk-571通过漩涡震荡器混合得到(mrna+mk-571)，然后利用微流控装置将递送载体与(mrna+mk-571)进行混合。在一些实施例中，所述流感病毒mrna和所述脂质纳米颗粒的p/n摩尔比为1:5.67。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明一个实施例中活体成像及荧光强度分析结果；其中(a)为活体成像图，(b)为荧光强度分析，左栏为mluciferase+mk-571组，右栏为mluciferase组；
24.图2为本发明一个实施例中针对四种抗原肽的特异性igg抗体测定结果；其中，(a)为抗原肽b1包被后检测结果，(b)为抗原肽b2包被后检测结果，(c)为抗原肽t1包被后检测
结果，(d)为抗原肽t2包被后检测结果；左栏为mh1n1-ha疫苗组，右栏为mh1n1-ha+mk-571疫苗组；
25.图3为本发明一个实施例中细胞免疫应答水平测定；其中，(a)为抗原特异性cd3
+
cd4
+
t细胞，(b)为抗原特异性cd3
+
cd8
+
t细胞；
26.图4为本发明一个实施例中攻毒后小鼠体重变化；其中mh1n1-ha代表lnp递送组，mh1n1-ha+mk571代表lnp递送并加mk571佐剂组，pbs代表对照组。
具体实施方式
27.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
28.除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
29.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
30.下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度和/或操作精度导致的可接受的偏差。
31.实施例1
32.流感病毒mrna疫苗的制备方法，包括如下步骤：
33.首先，将mrna与mk-571通过漩涡震荡器混合，得到mrna+mk-571。然后，利用微流控装置将有机相的材料(sm-102：dspc：cho-hp：dspe-mpeg2000＝50：10：38.5：1.5)与水相的mrna+mk-571按照n
n-sm-102
：n
p-mrna
＝5.67：1进行混合，得到lnp/mrna/mk-571。
34.按照上述lnp/mrna/mk-571的制备方法，制备lnp/mluciferase和lnp/mluciferase/mk-571，分别注射至c57bl/6小鼠腿部肌肉，其中每只小鼠注射的mluciferase剂量为10μg，mk-571剂量为3μg。在注射6h、12h、24h、48h、72h、84h、96h后进行活体成像观察，如图1所示，结果显示在各个时间点lnp/mluciferase/mk-571组的荧光强度均显著高于lnp/mluciferase组。
35.实施例2
36.制备lnp/mh1n1-ha和lnp/mh1n1-ha/mk-571疫苗，分别注射至c57bl/6小鼠腿部肌肉，其中每只小鼠注射的mh1n1-ha剂量为10μg，mk-571剂量为3μg。免疫程序包括三次免疫，免疫间隔为14天。分别在二免一周和三免一周采集小鼠眼眶外周静脉血血清检测特异性抗体，如图2所示，结果表明mh1n1-ha+mk-571疫苗组抗体水平均显著高于mh1n1-ha疫苗组；如图3所示，在初次免疫后第42天(三免二周)分离小鼠脾淋巴细胞检测cd3
+
cd4
+
、cd3
+
cd8
+
，结
果表明mh1n1-ha+mk-571疫苗组中阳性细胞数比例均显著高于mh1n1-ha疫苗组；在第三次免疫后2周，以20
×
ld
50
h1n1亚型流感病毒感染小鼠，监测周期为14天，如图4所示，可见mh1n1-ha/mk-571疫苗组小鼠体重变化相比mh1n1-ha疫苗组下降程度较轻，且后期体重恢复较快，而pbs组小鼠在攻毒后第10天全部死亡。
37.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.mk-571作为流感病毒mrna疫苗佐剂在制备流感病毒mrna疫苗中的应用。2.一种流感病毒mrna疫苗，其特征在于，包括流感病毒mrna和mk-571。3.根据权利要求2所述的流感病毒mrna疫苗，其特征在于，所述流感病毒mrna疫苗还包括脂质纳米颗粒。4.根据权利要求2所述的流感病毒mrna疫苗，其特征在于，所述流感病毒mrna和所述mk-571的质量比为10:3。5.根据权利要求3所述的流感病毒mrna疫苗，其特征在于，所述流感病毒mrna和所述脂质纳米颗粒p/n的摩尔比为1:5.67。6.根据权利要求2～5任一项所述的流感病毒mrna疫苗，其特征在于，所述流感病毒mrna为h1n1亚型流感病毒血凝素基因的mrna。7.一种流感病毒mrna疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：提供流感病毒mrna和mk-571；将所述流感病毒mrna和所述mk-571与递送载体混合，得到所述流感病毒mrna疫苗。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述递送载体为脂质纳米颗粒。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述流感病毒mrna和所述mk-571与递送载体混合具体包括以下步骤：先将流感病毒mrna与所述mk-571通过漩涡震荡器混合得到mrna+mk-571，然后利用微流控装置将递送载体与mrna+mk-571进行混合。10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述流感病毒mrna和所述脂质纳米颗粒p/n的摩尔比为1:5.67。

技术总结
本发明涉及一种MK-571作为流感病毒mRNA疫苗佐剂的应用。本发明首次将MK-571作为免疫佐剂应用于流感病毒mRNA疫苗中，结果显示制备的流感病毒mRNA疫苗能够诱导机体产生更强的体液及细胞免疫应答，最终能够有效预防流感病毒的感染。因此，MK-571作为mRNA疫苗佐剂进行使用，为流感病毒mRNA疫苗的开发提供了一种新策略。策略。


技术研发人员：金宁一 田明尧 庄忻雨 夏胜男 杨松惠 狄亚心 唐家凤 姜人月 许智强 陈璐儿 于潼 张桐
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/7/22