菘蓝黄素蛋白单加氧酶及其编码基因和应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体为菘蓝黄素蛋白单加氧酶fmo蛋白、其编码基因和应用。


背景技术：

2.十字花科菘蓝属植物菘蓝(isatis indigotica fort.)是植物提取靛蓝的来源之一。靛蓝(c
16h10
n2o2)是一种蓝色的天然化合物，广泛应用于印染、医药、食品等行业。靛蓝化合物具有多种生物活性，包括抗惊厥、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、镇痛和抗癌等。
3.据统计，全球每年靛蓝需求达5万吨，需求量巨大已发展成为与民生息息相关的经济产业。目前依赖化学合成生产靛蓝存在环境污染、安全隐患等各种问题；通过植物提取也有制备工艺繁琐、质量不稳定等局限性。生物合成靛蓝因绿色环保、安全稳定、高效节能正成为靛蓝生产颇有前途的发展方向。
4.黄素蛋白单加氧酶(flavin-containing monooxygenase，fmo，ec1.14.13.8)是一组依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸(fad，flavin adeninedinucleotide)、还原型辅酶ii(nadph，nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)和分子氧的单组分加氧酶，它属于黄素氧化酶家族，是一种独特的不含亚铁血红素的单加氧酶，参与靛蓝的生物合成。fmo可以催化吲哚生成吲哚酚，吲哚酚发生二聚反应生成靛蓝。
5.本发明从菘蓝中获得菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因，


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种菘蓝黄素蛋白单加氧酶蛋白及其编码基因、应用。
7.本发明还提供了一种制备靛蓝的方法。
8.本发明技术方案如下：
9.菘蓝黄素蛋白单加氧酶(iifmo)，其氨基酸序列含有seq id no.1的序列。优选的，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因，是编码上述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶的核苷酸序列。
11.优选的，所述菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因含有seq id no.2的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的同源序列。
12.在本发明的一个优选方式中，所述菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13.一种重组载体，含有编码上述菘蓝黄素蛋白单加氧酶的核苷酸序列。
14.优选的，所述重组载体含有seq id no.2的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的同源序列。
15.优选的，所述重组载体为pet32a或者pet28a。
16.一种宿主细胞，含有编码上述菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因或者上述的重组载体。
17.优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌，如大肠杆菌bl21或者trans5α。
18.上述菘蓝黄素蛋白单加氧酶、菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因、重组载体或者权宿主细胞可应用于制备靛蓝。
19.一种制备靛蓝的方法，以上述菘蓝黄素蛋白单加氧酶、表达菘蓝黄素蛋白单加氧酶酶的重组载体或者宿主细胞为催化剂，将吲哚转化为吲哚酚，再经二聚反应生成靛蓝。
20.或者，一种制备靛蓝的方法，以色氨酸为原料，加入表达上述菘蓝黄素蛋白单加氧酶酶和色氨酸酶的宿主细胞，经培养发酵，生成靛蓝。
[0021][0022]
本发明从菘蓝中获得了生成靛蓝的关键酶及其编码的基因，为合成生物学生成靛蓝提供重要催化元件；并且菘蓝黄素蛋白单加氧酶fmo基因转化到工程菌中，利用微生物例如大肠杆菌等所表达的色氨酸酶tryptophanase，将色氨酸转化为吲哚，吲哚被fmo氧化为吲哚酚，再经过自发二聚反应生成靛蓝。因此，本发明为靛蓝的生物合成提供了重要的催化元件，有望建立大规模生产靛蓝的细胞工厂，为靛蓝资源的可持续奠定基础，具有很好的应用前景和市场价值。
附图说明
[0023]
图1为实施例1中，从菘蓝叶片cdna文库中扩增菘蓝iifmo基因pcr扩增产物的0.8％琼脂糖凝胶电泳图。
[0024]
图2为实施例1中，菘蓝iifmo基因连接了中间载体的单克隆阳性菌pcr产物0.8％琼脂糖凝胶电泳图。
[0025]
图3为实施例2中，带有酶切位点的iifmo基因pcr扩增产物0.8％琼脂糖凝胶电泳图。
[0026]
图4为实施例3中蛋白诱导表达前后，菘蓝黄素蛋白单加氧酶蛋白sds-page电泳胶图。
[0027]
图5为实施例4酶功能验证，iifmo-pet32a-bl21在m9液体培养基中培养后生成靛蓝。
具体实施方式
[0028]
实施例1
[0029]
一、菘蓝叶片rna提取
[0030]
a.样品采集：取新鲜的菘蓝叶片，用铝箔包裹后放入液氮中；用液氮速冻后取出敲碎，将样品移入含有两颗钢珠的1.5ml rnase-free离心管，用球磨机磨碎。
[0031]
b.提取rna：样品裂解，萃取分层，挂柱回收，洗涤离心，洗脱rna(实验步骤参照试剂盒transzol up plus rna kit全式金er501)。
[0032]
c.检测所得rna的浓度及纯度，结果如表1所示。
[0033]
表1
[0034]
样品c(ng/ml)a260/a280a260/a230菘蓝嫩叶910.52.102.01
[0035]
2.菘蓝叶片cdna文库的构建
[0036]
菘蓝叶片总rna逆转录成cdna：total rna放置冰上，使用rnase-free的试剂和耗材，实验步骤参照试剂盒takara primescripttm 1st strand cdna synthesis kit。
[0037]
3.扩增引物设计：用于基因扩增的引物序列如表2所示。
[0038]
表2
[0039]
引物名称序列(5
′‑3′
)iifmo-fatggcctctaagtacgacaaiifmo-rgtttccgtcttgatcgagtc
[0040]
4.基因的扩增
[0041]
实验步骤参照试剂盒(plus dna polymerase货号：ap301)进行操作。参照表3反应液配制，pcr反应程序如表4所示。
[0042]
表3 pcr反应液配方表
[0043]
组分加样量模板(cdna)1μliifmo-f(10μm)1μliifmo-r(10μm)1μl5
×
kd plus buffer10μl2.5mm dntps4μlkd plus0.8μlnuclase-free water补齐至50μl
[0044]
表4 pcr反应程序
[0045][0046]
pcr产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳(150v，15min)，结果如图1，约1.5kb。5.扩增产物连接blunt simple载体
[0047]
实验步骤参照全式金simple cloning kit试剂盒(货号：cb111)，按表5加样，25℃反应15min。
[0048]
表5
[0049]
[0050][0051]
6.载体转化大肠杆菌
[0052]
实验步骤参照全式金trans5α chemically competent cell试剂盒(货号：cd201)：
[0053]
(1)从-80℃冰箱取出感受态细胞(大肠杆菌)，室温下解冻，后迅速置冰上；
[0054]
(2)取5μl连接产物加入到50μl感受态细胞中(超净工作台中进行)；
[0055]
(3)冰上放置30min，42℃热激90s，立即放置冰上5min；
[0056]
(4)加入500μl无抗生素的lb培养液，37℃、200rpm摇床培养约1小时；
[0057]
(5)室温5000rpm离心1min，留100μl上清，吹打重悬；
[0058]
(6)将悬液涂布于含100mg/l amp+的lb固体培养基上，倒放置于37℃恒温培养箱内培养12-16h；
[0059]
(7)挑8个单克隆菌落接种于300μl含100mg/l amp+的lb液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养3h以上。
[0060]
7.单克隆阳性菌检测
[0061]
参照表6配制反应液，pcr反应程序如表7。pcr产物0.8％琼脂糖凝胶电泳(150v，15min)结果如图2。
[0062]
表6 pcr反应液配方
[0063]
组分加样量模板(菌液)1μlm13-f(10μm)1μlm13-r(10μm)1μl2
×
flash pcr mastermix(dye)10μlddh2o加至20μl
[0064]
表7 pcr反应程序表
[0065][0066][0067]
8.测序
[0068]
选择条带匹配的阳性菌，取100μl送测(生工)，利用snapgene软件进行序列比对。测序的核苷酸序列如seq id no.1所示；其编码的蛋白序列如seq id no.2所示。
[0069]
核苷酸序列：
[0070]
atggcctctaagtacgacaatctcacttcttccagagtagccataatcggtgctggtgttagcggtttggcagccgctaagcacttagctcatcacaacccgaccgttttcgaagcctcggactcggtcggaggtgtttggaagag
ctgcagttacgagacaactaagttacaatcggctcgagtcgattacgagttctctgacttcccatggcccaatagagatgacacaacgttcccatcttacgttgagatattggattacttggaatcttacgctaagcattttgatctcctcaagttcatgaagtttggctctaaggtcatcgaagttaggtacacaggtgacggcgacactccacagatggttgacctcggtgcttacggcaacttgttgcccggaaaacctgtatgggaagttgctgttcagaacggagatgctggagatattcagtggcatgcatttgagttcgtggtggtgtgcaccggaaaattcggcgacgtaccaagaataccgacgtttccggtgaagaaagggcctgagatattcaaagggaaagtgatgcattcgatggattactgcaaattagacaaagaagaagcttctcatctcctccgtggcaagaaagtcgccgtcattggcttcaagaaatccgccattgatttggctttagagtctgctttagccaatcaaggagaaggtggacaagcatgcacaatggtggtgagaacaacacattgggtgttccctcattattgggtgtggggactaccgttcttcttgttctactctaccagagcttctcaattcctccatgataggcctaaccaaagtttccttagaactctcttttgcctcctattctctcttctgcgtgccgtggtttccaaattcatcgaagcatatgttacgtggaagcttcctctagagaaatatggtcttaaaccggaccattcttttgaagaagattatgcttcttgtcaaatggcgatcataccggagaatttcttcgatgaagcggataaagggatgatccggtttaagaaaacatcaaaatggtgcttttatgatcaagggattgagtttgaggatgggactacgctagaagctgatgttgtgatactcgcgactgggtatgatggcaagaagaagctcaaagccattgttcctgaaccctttcgaacttggcttgagtttccatgcggtgttatgcctctatacaggggaacaatccatccattgataccaaacatgggcttcgtgggatacgttcagagcaacgcaaacctacacacatcagagctacgttccctgtggttaagccggctcgtggatgagaaattcaaattaccgagcaaagagaaaatgttggatcaattctccaaggaaatggaagtgatgagaagatctagcagattctataaacgtcattgcatttctactttcagcatccaacatgctgatgatttgtgtcatgacatgggactcaatcctcggcgtaaatccaacttgttcctcgaagcctttagtccttatggttctcaagattatcgactcgatcaagacggaaactaa
[0071]
iifmo蛋白序列：
[0072]
maskydnltssrvaiigagvsglaaakhlahhnptvfeasdsvggvwkscsyettklqsarvdyefsdfpwpnrddttfpsyveildylesyakhfdllkfmkfgskvievrytgdgdtpqmvdlgaygnllpgkpvwevavqngdagdiqwhafefvvvctgkfgdvpriptfpvkkgpeifkgkvmhsmdyckldkeeashllrgkkvavigfkksaidlalesalanqgeggqactmvvrtthwvfphywvwglpfflfystrasqflhdrpnqsflrtlfcllfsllravvskfieayvtwklplekyglkpdhsfeedyascqmaiipenffdeadkgmirfkktskwcfydqgiefedgttleadvvilatgydgkkklkaivpepfrtwlefpcgvmplyrgtihplipnmgfvgyvqsnanlhtselrslwlsrlvdekfklpskekmldqfskemevmrrssrfykrhcistfsiqhaddlchdmglnprrksnlfleafspygsqdyrldqdgn
[0073]
实施例2原核表达载体的构建
[0074]
1.抽提质粒
[0075]
取10μl测序正确的菌液iifmo-bs，加入5ml lb(amp+100mg/l)培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床中过夜培养。同时取10μl菌液pet32a+-t1，加入5ml lb(ka+100mg/l)培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床中过夜培养。裂解菌体，离心取上清，上清液挂柱回收，洗涤离心，洗脱得质粒溶液(质粒提取步骤参照试剂盒easypure plasmid miniprep kit全式金em101)。
[0076]
2.pet32a+质粒双酶切
[0077]
使用hind iii-hf(neb)和saci-hf(neb)双酶切pet32a+载体用于iifmo无缝克隆，反应体系如表8。
[0078]
表8
[0079]
体系组成体积
质粒30μlhind iii-hf1μlsaci-hf1μlcutsmart buffer5μlddh2o13μl
[0080]
反应液混匀，置于37℃消化30min，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将相应片段切下，胶回收得线性质粒溶液，利用微量紫外分光光度计检测线性质粒溶液得浓度和纯度，用于下一步计算。线性质粒溶液在-20℃下可保存一周。
[0081]
3.无缝克隆引物设计
[0082]
用于无缝克隆的引物(限制性核酸内切酶位点带有下划线)如表9所示(seq id no.3-4)。
[0083]
pet32a-iifmo-f引物的限制性核酸内切酶位点：gagctc；pet32a-iifmo-r
[0084]
引物的限制性核酸内切酶位点：aagctt。
[0085]
表9
[0086]
引物名称序列(5
′‑3′
)pet32a-iifmo-fatcggatccgaattcgagctcatggcctctaagtacpet32a-iifmo-rctcgagtgcggccgcaagcttgtttccgtcttgatc
[0087]
4.基因片段的扩增
[0088]
实验步骤参照试剂盒plus dna polymerase(货号：ap301)，pcr反应液配方和pcr程序见表11和表11。
[0089]
表10 pcr反应液配方表
[0090]
组分加样量模板(iifmo-bs-t12质粒)1μlf(10μm)1μlr(10μm)1μl5
×
kd plus buffer10μl2.5mm dntps4μlkd plus1μlnuclase-free water补齐至50μl
[0091]
表11 pcr反应程序
[0092][0093]
pcr产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳(150v，15min)，结果如图3。
[0094]
5.无缝克隆
[0095]
a.参照表12配制反应液，轻轻混匀，金属浴37℃，30min，反应后立即置于冰上或者降至4℃(步骤参照试剂盒clonexpress ii one step cloning kit诺唯赞c112)。
[0096]
表12
[0097][0098][0099]
b.重组产物转化大肠杆菌感受态trans5α(实验步骤参照试剂盒全式金trans5αchemically competent cell，货号：cd201)。
[0100]
c.涂板，挑斑，加500μl lb(amp+100mg/l)，37℃，200rpm，摇菌，过夜，菌检，送测(生工)，序列比对。
[0101]
6.抽提质粒，转化表达型菌株bl21
[0102]
测序正确的的iifmo-pet32a-trans5α菌液，取10μl于10ml lb(amp+100mg/l)液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养过夜。
[0103]
第二天抽提质粒，重新转化bl21(方法同trans5α感受态)。涂板，37℃恒温培养箱培养过夜。挑斑，菌检，留阳性克隆菌株。
[0104]
实施例3蛋白诱导与纯化
[0105]
1.蛋白诱导表达
[0106]
a.各取10μl菌液iifmo-pet32a-bl21加入0.5ml lb(含amp+100mg/l)培养基，过夜培养，活化两次。
[0107]
b.取10μl菌液加入5ml lb(含amp+100mg/l)培养基中，200rpm、37℃培养。再取1ml菌液加入100ml m9(含2.38g/lna2hpo4、3g/l kh2po4、1g/l nh4cl 0.5g/l nacl、2mm mgso4、0.8mm色氨酸、amp+50mg/l、1μm烟酸、0.1mm cacl2、1μm核黄素、0.5mg/ml葡萄糖)培养基中，200rpm、28℃培养至od
600
值达到0.5-0.6；
[0108]
c.加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.1mmol/l，100rpm、25℃培养过夜(48h)；
[0109]
d.6000rpm离心10min富集菌体，分次收集到50ml离心管中，5ml pbs缓冲液(ph＝7.4)重悬，再离心，去上清；
[0110]
e.用超高压连续流细胞破碎仪获得粗蛋白，破碎菌液温度不得超过4℃；
[0111]
f.超声破碎液于4℃、6000rpm离心10min，收集上清，即粗蛋白液。
[0112]
2.sds-page电泳分析
[0113]
上步实验得到的上清、沉淀各取20μl加入4μl蛋白上样缓冲液(6
×
protein loading buffer)，混匀后沸水煮8min(加热变性12,000rpm离心2min，取上清液进行sds-page电泳分析。
[0114]
a.配制10％ sds-page胶，分离胶和浓缩胶配方如表13，表中为两块胶的量。先将分离胶加入制胶槽中，约30min凝固后加入浓缩胶，并迅速插入齿梳。凝固后立即使用或者用浸湿的吸水纸包裹后置于4℃保存。
[0115]
表13分离胶和浓缩凝胶的配方
[0116]
组成分离胶组成浓缩胶mini-q h2o5.0mlmini-q h2o3.4ml30％acr-bis(29:1)3.3ml30％acr-bis(29:1)0.63ml1m tris
·
hcl(ph＝8.8)3.5ml1m tris
·
hcl(ph＝6.8)0.5ml10％sds0.1ml10％sds0.05ml10％ap0.1ml10％ap0.05mltemed0.004mltemed0.005ml
[0117]
b.取8μl变性后的样品上清液，均匀加入浓缩胶的泳道中，使用bio-rad电泳装置，电泳程序为：80v 20min，120v 60min。
[0118]
c.反应结束后，将胶取出，小心切下浓缩胶，将分离胶置于加有考马斯亮蓝快染液的玻璃平皿中，侧摆摇床震荡10-30min左右，取出放入清水中，微波炉中火加热30s脱色，反复多次直到蛋白条带明显可见为止。结果如图4，m：蛋白marker，1：诱导前，2：iptg诱导后，3：破碎后(上清)，4：破碎后(沉淀)。
[0119]
d.结果分析：iifmo蛋白分子量为59.71kda，加上载体标签，目标蛋白大小为82.14kda，上清和沉淀中均检测到了目的蛋白。
[0120]
实施例4酶功能验证
[0121]
取10μl iifmo-pet32a-bl21菌液加入5ml lb(含amp+100mg/l)培养基中200rpm 37℃培养；再取1ml菌液加入100ml m9(含2.38g/lna2hpo4、3g/l kh2po4、1g/l nh4cl、0.5g/l nacl、2mm mgso4、0.8mm色氨酸、amp+50mg/l、1μm烟酸、0.1mm cacl2、1μm核黄素、0.5mg/ml葡萄糖)培养基中200rpm 28℃培养至od
600
值达到0.5-0.6。
[0122]
然后继续培养48h，菌液中产生了蓝色物质(靛蓝)，如图5所示。
[0123]
bl21工程菌可表达色氨酸酶tryptophanase，催化色氨酸tyr生成吲哚indole。工程菌表达的靛蓝黄素蛋白单加氧酶(iifmo)催化吲哚转化为吲哚酚，再发生二聚反应生成靛蓝。
[0124]
pet32a+-bl21作为对照组，培养后颜色不发生变化。
[0125]
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，并不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属的技术领域的不脱离本发明构思的前提下，做出的若干等同替代或明显变型，且性能或用途相同或相似的，都应当属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.菘蓝黄素蛋白单加氧酶，其特征在于，其氨基酸序列含有seq id no.1的序列。2.根据权利要求1所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。3.菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因，其特征在于，为编码权利要求1或2所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因，其特征在于，其核苷酸序列含有seq id no.2的序列或者编码相同蛋白质的同源序列。5.一种重组载体，其特征在于，含有编码权利要求1或2所述菘蓝黄素蛋白单加氧酶的核苷酸序列。6.一种宿主细胞，其特征在于，含有编码权利要求1或2所述菘蓝黄素蛋白单加氧酶的核苷酸序列、权利要求3或4所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因或者含有权利要求5所述的重组载体。7.权利要求1或2所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶、权利要求3或4所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶基因、权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的宿主细胞在制备靛蓝方面的应用。8.一种制备靛蓝的方法，其特征在于，以权利要求1或2所述的菘蓝黄素蛋白单加氧酶、权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的宿主细胞为催化剂，将吲哚转化为吲哚酚，再经二聚反应生成靛蓝。9.一种制备靛蓝的方法，其特征在于，以色氨酸为原料，加入表达权利要求1所述菘蓝黄素蛋白单加氧酶酶和色氨酸酶的宿主细胞，经培养发酵，生成靛蓝。

技术总结
本发明涉及生物工程领域和医药领域，公开了菘蓝黄素蛋白单加氧酶FMO及其编码基因。菘蓝黄素蛋白单加氧酶可以催化吲哚生成吲哚酚，再进一步二聚反应生成靛蓝。本发明为靛蓝的生物合成提供了重要的催化元件，有望建立大规模生产靛蓝的细胞工厂，为靛蓝资源的可持续奠定基础，具有很好的应用前景和市场价值。具有很好的应用前景和市场价值。具有很好的应用前景和市场价值。


技术研发人员：肖莹 李蓉蓉 陈万生 陈军峰 李永康
受保护的技术使用者：上海中医药大学
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/7/22