一种引物组合物及其在病原检测中的应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及猕猴桃致病菌的检测方法，具体涉及采用raa-lfd技术检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的引物组合物和检测方法。


背景技术：

2.猕猴桃细菌性溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（pseudomonas syringae pv. actinidiae，psa）引起的具有毁灭性的病害。psa致病能力极强，猕猴桃细菌性溃疡病已蔓延至世界主要猕猴桃产区。猕猴桃果园植株一旦感染溃疡病，轻则导致减产，重则毁园，造成严重的经济损失。
3.丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的传统鉴定（检测）方法主要是进行发病组织病原菌分离与形态学鉴定、致病性测定等。由于传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期快速做出诊断，因此难以对病害发生情况进行及时的监测和有效控制。
4.分子生物学的发展为猕猴桃细菌性溃疡病的诊断提供了快速、灵敏、准确的技术支撑，各类pcr、杂交探针、rapd、aflp等分子检测方法已被广泛应用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测鉴定。pcr法在检测特异性和灵敏性上虽有较大的提高，但诊断过程繁琐、周期长、成本高且需要昂贵的仪器和试剂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术（lamp）用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测和鉴定，虽可以不借助pcr仪等精密仪器，但引物设计比pcr更复杂，并且产物的分析采用浊度、金属指示剂等比色法检测，存在难以区分假阳性的情况。
5.重组酶等温扩增技术（recombinase aided amplification，raa）是一种新型恒温（37~42℃）核酸扩增技术，其显著优点是只需要1对引物即可在39℃的恒温条件下实现模板核酸的扩增。与普通pcr相比，raa技术具有简单、快速、高效、灵敏度高、特异性强等优点，可在30 min内获得检出扩增产物，反应过程不需要高温变性和低温退火，降低了对精密温控设备的要求，反应时间明显缩短。raa扩增结果通过与侧流层析试纸条（lateral flow detection，lfd）结合，实现可视化读取，结果可肉眼判读，真正实现病原菌快速现场检测，为植物病原物检测诊断和病害防控提供了快速便捷的技术手段。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题：包括化学农药防治在内的技术手段难以有效遏制猕猴桃细菌性溃疡病的扩展蔓延，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的快速现场检测具有不容忽视的重要意义。对于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的raa检测，目前未见相关应用报道。
7.本发明旨在建立一种方便、快速、灵敏地检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的方法。为有效解决本发明的技术问题，实现本发明的技术目的，本发明提供一种基于raa-lfd技术检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的引物组合物。所述引物组合物由正向引物、反向引物和探针引物构成，设计所述引物组合物的靶标序列为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基
因组中一个假想基因（wp_017704201.1）序列。
8.具体地，所述正向引物的序列如seq id no.1所示。在本发明中，正向引物为raa-psa-f：5
′‑
caccatgatgcggagctactacggcgactg-3
′
（seq id no.1）。
9.具体地，所述反向引物的序列如seq id no.2所示，在本发明中，反向引物为raa-psa-r：5
′‑
biotin-aagtaatttccgcaggagggaggctgttag-3
′
（seq id no.2）。由seq id no.2序列获知，反向引物序列5
′
端用生物素（biotin）标记。作为一优选的实施方式，所用生物素为维生素b7。
10.具体地，所述探针引物的序列如seq id no.3所示。在本发明中，探针引物（序列）为raa-psa-p：5
′‑
famacggcgactggtggcgagtatttgaaagcg/thf/tggggaagtgggtg/c3-spacer（seq id no.3）。由seq id no.3序列获知，探针引物5
′
端用荧光素（fam）标记，距离5
′
端31个碱基的位置处用四氢呋喃（thf）作为dspacer替代一个碱基，3
′
端用c3-spacer封锁。作为一优选的实施方式，所用荧光素为6-羧基荧光素。
11.基于上述设计的引物组合物，本发明请求保护一种检测组合物。本发明所述检测组合物含有所述的引物组合物。这种组合物用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测，可以制备成适用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测的制剂或试剂。
12.基于上述设计的引物组合物，作为一种优选的实施方式，本发明请求保护一种检测试剂盒。所述检测试剂盒的构成组分包含所述的引物组合物，用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测。进一步地，所述检测试剂盒的构成组分还包括：装有raa冻干酶粉的反应单元管、a buffer、醋酸镁溶液（b buffer）、去离子水、运行缓冲液和侧流层析试纸条。本发明提供了一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测的方法，其包括：以待测样本dna为模板，采用所述的引物组合物进行raa扩增；采用侧流层析试纸条检测raa扩增产物，若侧流层析试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则待测样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；若侧流层析试纸条只在质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则待测样本中不含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
13.所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法，包括以下具体步骤：1）提取待测样本基因组dna；2）以待测样本基因组dna为模板，利用所述引物组合物进行raa扩增；3）采用侧流层析试纸条进行raa扩增产物检测。当侧流层析试纸条出现两条棕色条带（control line and test line），一条位于质控区，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；当侧流层析试纸条只有质控区出现一条棕色条带（control line），检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
14.上述方法中，步骤2）所述raa-lfd检测的反应体系为：向raa冻干酶粉中加入25 μl a缓冲液（a buffer）、12.9 μl超纯水、10 μm正向引物raa-psa-f 2 μl、10 μm反向引物raa-psa-r 2 μl、10 μm探针引物raa-psa-p 0.6 μl、2 μl dna模板及2.5 μl醋酸镁（b buffer），总反应体系50 μl。
15.其中，a buffer的具体成分为100 mm kcl，1.2 m tris-hcl（ph 8.0），25 mm mgcl2，60 mm (nh4)2so4，5%甘油。b buffer（醋酸镁溶液）浓度为280 mmol/l。
16.进一步地，在所述raa-lfd检测体系下39℃水浴箱内进行扩增反应30 min。上述方法中，移取10 μl raa扩增产物检测到样品垫上，将样品垫端置于200 μl的运行缓冲液中，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
17.在另一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测的方法中，采用所述的检测试剂盒进行raa扩增。
18.本发明提供的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法具有极高的检测灵敏度，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种dna的检测灵敏度最低限为1 pg/μl，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的菌悬液最低检测限为1
×
10
3 cfu/ml。
19.还有，本发明提供丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法在丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测或辅助检测中的应用。
20.与现有技术相比，本发明“一种引物组合物及其在病原检测中的应用”具有以下几方面的技术优势或有益效果：1）本发明所提供的检测方法具有高度特异性。所述引物组合物是经过大量试验验证筛选获得，能够特异性检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，与其它病菌无交叉反应。
21.2）本发明所提供的检测方法具有极高的检测灵敏度。所述方法能够检测最低限度为1 pg/μl的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因组dna和最低浓度为1.0
×
10
3 cfu/ml菌悬液，其最低检测限和普通pcr检测限一致。
22.3）本发明所提供的检测方法在39℃下30 min内即可完成扩增，与普通pcr检测相比检测速度更快，且无需借助精密仪器和设备，极大的提高了检测效率。
23.4）本发明所应用的raa检测体系，通过与侧流层析试纸条（lfd）相结合，在无需借助任何设备的情况下，实现可视化读取，可肉眼直接判读检测结果。
24.5）猕猴桃细菌性溃疡病在田间发病速度快，本发明能够适于基层实验室和田间生产中丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的快速检测。本发明可用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的田间快速检测，只需30 min即可获得检测结果，对病害的早期诊断、确定最佳的防治时期、建立有效防病策略具有十分重要的意义。
25.6）本发明首次采用raa-lfd技术建立快速检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的方法，特异性强、灵敏度高、检测速度快，可用于田间现场样品检测，为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的现场检测提供了一种新方法。
附图说明
26.图1为本发明方法对表1菌株的检测结果图。1表示丁香假单胞菌猕猴桃致病变种m228，2表示丁香假单胞菌猕猴桃致病变种sxzzf4-8，3表示丁香假单胞菌猕猴桃致病变种sxzz-y-6，4表示丁香假单胞菌猕猴桃致病变种sbjm-fl-2，5表示大黄欧文菌（erwinia rhapontici）sxer-t-1，6表示河生肠杆菌（lelliottia amnigena）sxla-y-1，7表示芽孢杆菌（bacillus sp.）sxba-4，8表示成团泛菌（pantoea agglomerans）bjwg-4，9表示黄杆菌
（flavobacterium sp.）bjm-2，10表示不动杆菌（acinetobacter sp.）sxzz-ac-2。
27.图2为本发明方法对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的灵敏度（基因组dna）试验结果图。
28.图3为本发明方法对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的灵敏度（基因组dna）试验结果图。c表示质控区（control line），t表示检测区（test line）。
29.图4为本发明方法对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种灵敏度（菌悬液浓度）试验结果图。
30.图5为本发明方法检测田间样品结果图。1-8分别表示猕猴桃细菌性溃疡病疑似发病样品，9-10分别表示健康样品。
实施方式
31.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
32.实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
33.本实施例供试菌株见表1，所有10株供试菌株均由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治研究团队实验室分离并保存。
34.表1，供试菌株信息
35.菌株基因组dna提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，按照说明书提取菌株基因组dna。raa-nfo核酸扩增试剂（试纸条型）购自杭州众测生物科技有限公司。引物组合物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；lfd测流层析胶体金试纸条购自德国milenia geneline公司。
36.根据丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（pseudomonas syringae pv. actinidiae）基
因组中一个假想基因部分序列（ncbi登录号：wp_017704201.1）为靶标序列，设计了正向引物raa-psa-f、反向引物raa-psa-r和探针引物raa-psa-p。其中反向引物raa-psa-r序列5
′
端用生物素（biotin）标记；探针raa-psa-p序列5
′
端用荧光素（fam）标记，距离5
′
端31个碱基的位置处用四氢呋喃（thf）作为dspacer替代一个碱基，3
′
端用c3-spacer阻断。具体序列如下：raa-psa-f：5
′‑
caccatgatgcggagctactacggcgactg-3
′
（seq id no.1）；raa-psa-r：5
′‑
biotin-aagtaatttccgcaggagggaggctgttag-3
′
（seq id no.2）；raa-psa-p：5
′‑
famacggcgactggtggcgagtatttgaaagcg/thf/tggggaagtgggtg/c3-spacer（seq id no.3）。
37.以提取的基因组dna为模板，采用设计的引物在反应体系中进行raa反应：向raa冻干酶粉中加入25 μl a 缓冲液（a buffer）、12.9 μl超纯水、10 μm引物raa-psa-f 2 μl、10 μm引物raa-psa-r 2 μl、10 μm探针引物raa-psa-p 0.6 μl、2 μl dna模板及2.5 μl醋酸镁，总反应体系50 μl。
38.将上述反应体系于39℃水浴箱内进行扩增反应30 min。应用侧流层析试纸条（lfd）进行扩增产物检测。移取10 μl扩增产物到样品垫上，将样品垫端置于200 μl的运行缓冲液中，当侧流层析试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；当侧流层析试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
实施例
39.验证丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法的特异性。
40.选取4株丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌株和6株猕猴桃内生细菌菌株，以基因组dna为模板来验证检测方法特异性。结果如图1所示，lfd测流层析试纸条结果显示，只有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（菌株编号分别为m228、sxzzf4-8、sxzz-y-6、sbjm-fl-2）为阳性结果，即lfd试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区。其余6个菌株dna检测结果均为阴性，即lfd试纸条只出现一条棕色条带，位于质控区内，结果为阴性。这表明设计的raa-lfd反应体系具有高度特异性。
实施例
41.验证丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法的灵敏性。
42.以提取的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因组dna和不同浓度的菌悬液为模板，确定检测方法的灵敏度。提取的基因组dna浓度依次进行10倍系列浓度稀释，获得质量浓度分别为10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl的8个梯度，将模板dna替换为等量的超纯水做空白对照（ck）。将丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌悬液，用无菌水按照10倍浓度梯度稀释，浓度依次为1.0
×
108、1.0
×
107、1.0
×
106、1.0
×
105、1.0
×
104、1.0
×
103、1.0
×
102、1.0
×
10
1 cfu/ml，用超纯水做空白对照（ck）。
43.结果如图2、图3所示，分别以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因组dna浓度10 ng/
μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl进行raa-lfd检测，lfd测流层析试纸条出现两条棕色条带，呈阳性反应；反应体系中分别含有100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl丁香假单胞菌猕猴桃致病变种dna的lfd测流层析试纸条只出现一条棕色条带，呈阴性反应。显色结果表明丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法的灵敏度达到1 pg/μl。
44.如图4所示，分别以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌悬液浓度1.0
×
108、1.0
×
107、1.0
×
106、1.0
×
105、1.0
×
104、1.0
×
103、1.0
×
102、1.0
×
10 cfu/ml为模板进行raa-lfd检测，试纸条出现两条棕色条带，呈阳性反应。显色结果表明丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法的灵敏度达到1.0
×
10
3 cfu/ml。
实施例
45.从陕西省周至、眉县、武功等猕猴桃产区共采集到猕猴桃细菌性溃疡病疑似样品8份，猕猴桃健康样品2份，进行raa-lfd检测。样品经清水冲洗和75%酒精表面消毒后，用灭菌的手术刀切下1 cm长宽的植物组织，切碎并放置于1.5 ml离心管中，加入1ml无菌水，静置10 min后，100℃水浴10 min，以菌悬浮液为模板，进行raa-lfd检测。结果如图5所示。从图5中可以看出，疑似样品1-8号检测结果出现两条棕色条带，一条位于质控区内（control line），一条位于检测区（test line），检测结果为阳性，表明样品含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。健康猕猴桃叶片组织9-10号只有质控区出现一条棕色条带，检测区（test line）没有条带，检测结果为阴性，表明样品中不含丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。本实施例再次证明了raa-lfd检测方法的结果准确可靠，实用性强。
46.综上所述，本发明基于raa-lfd技术建立了针对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的可视化检测方法，并评估其检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的特异性和灵敏性。经验证，该方法检测灵敏度高，检测限可达1 pg/μl，且特异性好，与其他属病菌无交叉反应。此外，本发明进一步验证了所建立方法（raa-lfd检测体系）对实际样品的检测效果，利用此方法可快速鉴别猕猴桃细菌性溃疡病疑似样品及健康样品，检测结果准确可靠。本发明丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测方法具有快速、特异、灵敏、简便特点，为植物病原物检测诊断和病害防控提供了新的技术手段。
47.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由正向引物、反向引物和探针引物构成，所述正向引物的序列如seq id no.1所示，所述反向引物的序列如seq id no.2所示，所述探针引物的序列如seq id no.3所示，设计所述引物组合物的靶标序列为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因组中一个假想基因wp_017704201.1序列。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述反向引物的5
′
端用生物素标记。3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述探针引物的5
′
端用荧光素标记，距离5
′
端第31个碱基的位置用四氢呋喃替代，3
′
端用c3-spacer封锁。4.一种检测组合物，其特征在于，所述检测组合物包含权利要求1至3任一项所述的引物组合物。5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1至3任一项所述的引物组合物。6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含装有raa冻干酶粉的反应单元管、侧流层析试纸条。7.权利要求1至3任一项所述的引物组合物，或权利要求4所述的检测组合物，或权利要求5或6所述的检测试剂盒在丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测中的应用。8.一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测的方法，其特征在于，包括：以待测样本dna为模板，采用权利要求1至3任一项所述的引物组合物，或采用权利要求4所述的检测组合物，或采用权利要求5或6所述的检测试剂盒进行raa扩增；采用侧流层析试纸条检测raa扩增产物，若侧流层析试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则待测样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；若侧流层析试纸条只在质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则待测样本中不含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种dna的检测灵敏度最低限为1 pg/μl，对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌悬液最低检测限为1
×
10
3 cfu/ml。10.权利要求8所述的方法在丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种由正向引物、反向引物和探针引物构成的引物组合物。正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，探针引物的序列如SEQ ID No.3所示，设计所述引物组合物的靶标序列为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种中一个假想基因（WP_017704201.1）序列。本发明建立了丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测方法，包括：提取待测样品基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物组合物进行RAA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。本发明检测方法对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种DNA的检测灵敏度最低限为1 pg/μL，对菌悬液最低检测限为1


技术研发人员：黄丽丽 徐亮胜 刘海龙
受保护的技术使用者：西北农林科技大学深圳研究院
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/7/22