一种耐盐高效降解挥发酚、COD的复合菌剂及其应用的制作方法

一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种复合菌剂，具体涉及一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂及其应用。属于环境保护技术领域。


背景技术：

2.挥发酚污染主要来源于工业化生产，例如炼油、塑料、纺织、杀菌剂、树脂、石油和药品等生产过程中，含酚废水的排放对环境、动植物以及人类造成严重的污染和危害。其中苯酚含量为1500-3000mg/l、ph为3-9、硫酸钠含量为2-5％、cod含量为10000-20000mg/l为高盐、高酚、高cod等难降解特征废水，在目前生物降解法中属于亟待解决的关键难题。
3.目前国内外研究者已经筛选出的苯酚降解菌主要为细菌和真菌两大类。细菌主要有芽孢杆菌属(bacillussp.)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、不动杆菌属(acinetobactersp.)和红球菌属(rhodococcussp.)等；真菌主要包括酵母菌属、假丝酵母属。
4.专利《一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用》(cn202210002662.7)中的菌株(nh-1)对苯酚的耐受为1000mg/l；专利《苯酚降解菌及其应用》(cn202110123709.0)提供了一种丛毛单胞菌(comamonassp.)wmf1，其对苯酚降解率仅为59.71％；专利《一种苯酚降解菌株的筛选方法及应用》(cn201910922238.2)中提供了一株抗辐射不动杆菌aph1(acinetobacterradioresistensaph1)，其降解苯酚浓度为500mg/l，耐受上限为950mg/l；专利《一株产生物表面活性剂的苯酚降解菌及其应用》(cn201910240971.6)假单胞杆菌(pseudomonasplecoglossicida)bph-3，其对浓度为200-800mg/l的苯酚的降解率为100％；对cod为200-400mg/l的焦化废水处理后，出水水质的cod为40-60mg/l，对低浓度cod的降解率约为85％；专利《一种利用聚氨酯海绵辅助苯酚降解菌对高浓度苯酚进行增效生物降解的应用》(cn201711472098.0)中，通过添加载体提高丝孢酵母(trichosporon montevideense)phe1对苯酚的降解浓度，从2000mg/l可以提高到3700mg/l。
5.苯酚废水中存在盐度高、高含挥发酚、高cod难降解等难降解情况，大量的苯酚降解菌的应用受到了严重制约。上述菌株存在的问题主要为菌株单一、有机负荷难受度低、需要辅助额外载体进行运行，成本高，操作复杂，存在安全隐患等不足。
6.因此，筛选出既要有较强的降解酚能力，又能适应高冲击负荷的功能菌群非常必要，高效复合菌剂的开发是未来生物强化法的主要研究方向。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂及其应用，其具有良好的耐盐性，并可高效降解挥发酚，高效去除cod。
8.为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
9.1、一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂，是由热带假丝酵母菌(candida tropicalis)、扣囊复膜孢酵母(saccharomycopsisfibuligera)、枯草芽孢杆菌
(bacillussubtilis)和谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)混合制成，其中，所述的热带假丝酵母菌的有效活菌数占总有效活菌数的25～35％，所述的扣囊复膜孢酵母的有效活菌数占总有效活菌数的25～35％，所述的枯草芽孢杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的10～25％，所述的谷氨酸棒杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的10～25％。
10.优选的，所述的热带假丝酵母菌、扣囊复膜孢酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌均为可购买菌种，从中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(accc)购买。
11.优选的，所述的热带假丝酵母菌(candidatropicalis)是常见的假丝酵母属，好氧的特性，在pda培养基上30℃培养3天，菌落表面干燥、呈米白色，为椭圆形芽生细胞。该菌属于现有技术中的菌株，可以从菌种保藏中心购买，选自cicc1254、cicc1321、cicc1351中的至少一种。
12.所述的扣囊复膜孢酵母(saccharomycopsisfibuligera)是常见的假丝酵母属，pda培养基30℃培养3天，菌落圆形、白色、表面放射状隆起、质干，3-5mm；个体形态结构呈卵形、腊肠形，单个、双个、多个；长*宽(2.5-5)
×
(6.25-10)μm；假丝酵母型菌丝；无性繁殖方式为多边芽殖；化能异养；嗜温；趋酸；兼性厌氧。该菌属于现有技术中的菌株，可以从菌种保藏中心购买，选自cicc1429、cicc1981、cicc31128中的至少一种。
13.所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是常见的芽孢杆菌属，好氧的特性，在lb培养基上生长较快，菌落表面干燥、呈米白色，为椭圆形芽生细胞菌落呈乳白色，圆形，不透明。表面有褶皱，微突起，边缘不整齐。革兰氏染色阳性，菌体呈杆状。该菌属于现有技术中的菌株，可以从菌种保藏中心购买，选自cicc10732、cicc25064、cicc10260中的至少一种。
14.所述的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)是常见的棒杆菌属，菌落圆形、浅黄色、表面光滑，2.0-3.0mm，质地粘稠。细胞棒杆状膨大、稍弯，单个或成对；一般不运动，g+，嗜微碱；化能异养，好氧，好氧生长良好者常有表面膜；接触酶阳性。产l-赖氨酸。该菌属于现有技术中的菌株，可以从菌种保藏中心购买，选自cicc20043、cicc10049、cicc 10132中的至少一种。
15.优选的，所述复合菌剂的总有效活菌数大于等于6.5
×
109cfu/ml。
16.优选的，热带假丝酵母菌、扣囊复膜孢酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌的有效活菌数比例为1：1：1：1。
17.优选的，所述挥发酚为苯酚。
18.2、上述一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂的制备方法，具体步骤如下：先将热带假丝酵母菌、扣囊复膜孢酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌分别活化、培养获得相应的种子液，混合，得到混合种子液；然后在无菌条件下将灭菌保护剂加入混合种子液中，搅拌均匀，得到液体复合菌剂；其中，所述保护剂是由以下组分混合制成的：脱脂奶粉10～15mg/ml，生理盐水8.5～10mg/ml，甘油10～15mg/ml，其余的补充蒸馏水。
19.优选的，热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母的活化方法为：将热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母接种至pda培养基上，20～30℃培养48～72小时；枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌的活化方法为：将枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌接种至lb培养基上，30～40℃培养24～36小时。
20.优选的，热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母的培养方法为：先将活化后的热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母接种至pda培养基，在20～30℃和150～160rpm条件下摇床培养48～72小时，接着以10％体积接种量(v/v)接种至装有种子培养基的发酵罐中，通气量1～1.5l/min，培养温度20～40℃，搅拌速度150～160rpm，培养时间48～72小时，即得相应的种子液。
21.优选的，枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌的培养方法为：先将活化后的枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌接种至lb培养基，在30～40℃和200～260rpm条件下摇床培养24～36小时，接着以10％体积接种量接种至装有种子培养基的发酵罐中，通气量1～1.5l/min，培养温度30～40℃，搅拌速度200～260rpm，培养时间24～36小时，即得相应的种子液。
22.进一步优选的，所述种子培养基是由以下质量百分比的原料混合制成的：玉米粉糖化液0.1～0.8％，玉米浆15～25％，硫酸铵2～5％，mgso40.1～0.5％，feso4·
7h2o0.1～0.2％，kh2po40.5～2％，麸皮汁1～2％，ph＝5.5，余量为水。
23.优选的，保护剂的添加量为混合种子液质量的2～5％。
24.优选的，保护剂经115℃高压蒸汽灭菌30分钟。
25.优选的，液体复合菌剂经低温冷冻干燥或低温喷雾干燥制成干燥菌粉。
26.3、上述复合菌剂在含挥发酚废水处理中的应用。
27.优选的，废水处理的工艺条件为：温度10～50℃，溶解氧do＜2.0mg/l，ph3.5-8.5，水力停留时间36～96h，耐受盐质量浓度2～5％。
28.优选的，所述复合菌剂通过在低浓度含挥发酚废水中梯度驯化提高其耐受度。
29.优选的，所述复合菌剂将初始挥发酚浓度380～2500mg/l降解100％，将初始cod浓度8000～25000mg/l降解85％以上。
30.优选的，利用生物膜反应器进行含挥发酚废水处理。
31.本发明的有益效果：
32.本发明将热带假丝酵母菌(candidatropicalis)、扣囊复膜孢酵母(saccharomycopsis fibuligera)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)复配制成复合菌剂，是由真菌和细菌复配而成，充分发挥真菌和细菌的协同降解作用，在含酚、高cod浓度废水中具有广阔的应用前景。具体优势如下：
33.(1)本发明制备的复合菌剂能够适应较大的温度范围，10～50℃。
34.(1)本发明制备的复合菌剂在具有较好的耐受盐浓度范围为2～5％。
35.(2)本发明制备的复合菌剂能够适应较宽的酸碱度，即ph3.0～9.0。
36.(3)本发明制备的复合菌剂能够耐受较高的苯酚浓度，即380～2500mg/l，降解率达到100％。
37.(4)本发明制备的复合菌剂能够耐受较高的cod浓度，即8000～25000mg/l，降解率达到85％以上。
38.(5)本发明制备的复合菌剂主要成分为真菌和细菌的复配，充分发挥真菌和细菌的协同降解作用。
附图说明
39.图1为复合菌剂中的菌株图片。
40.图2为复合菌剂在不同盐浓度条件下的苯酚降解情况。
41.图3为复合菌剂在不同盐浓度条件下的cod降解情况。
42.图4为单菌(xj1)对苯酚降解情况。
43.图5为单菌(xj2)对苯酚降解情况。
44.图6为单菌(zj1)对苯酚降解情况。
45.图7为单菌(zj2)对苯酚降解情况。
46.图8复合菌剂组合1对苯酚和cod的降解情况。
47.图9复合菌剂组合2对苯酚和cod的降解情况。
48.图10复合菌剂组合3对苯酚和cod的降解情况。
49.图11为复合菌剂在生物反应器中的运行情况(箭头处为调整进水流速)。
具体实施方式
50.下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
51.为便于比较，具体实施部分的zj-1为cicc1254，zj-2为cicc1429，xj-1为cicc 10732，xj-2为cicc20043。
52.应用实施例1：
53.复合菌剂的制备，具体步骤如下：
54.(1)菌株活化
55.下述实施例中所述菌株活化为分别将复合菌剂的各个菌种接种到各个菌种对应的斜面培养基上培养，其中热带假丝酵母菌(zj-1)、扣囊复膜孢酵母(zj-2)接种到pda培养基上，20℃培养72小时，枯草芽孢杆菌(xj-1)、谷氨酸棒杆菌(xj-2)种到lb培养基上，30℃培养36小时，其菌落图片如图1。
56.(2)种子液制备
57.下述实施例中所述种子液制备为分别将步骤(1)活化的菌株，接种到各个菌种对应的三角瓶液体(200ml/500ml)，培养基上摇瓶培养，其中zj-1、zj-2接种到pda培养基上，20℃，摇床转速160rpm，培养48小时；xj-1、xj-2种到lb培养基上，40℃培养，摇床转速200rpm，36小时；得到各个菌株的种子培养液。
58.(3)混合种子液制备
59.分别将步骤(2)制得的各个菌种的三角瓶培养液按体积分数(v/v)的10％接种量，分别接种到装有种子培养基的发酵罐中(50l)，所述种子培养基由以下质量百分比的原料组成：玉米粉糖化液0.1％，玉米浆25％，硫酸铵2％，mgso40.5％，feso4.7h2o0.1％，kh2po42％，麸皮汁1％，ph＝5.5，余量为水；种子罐中培养通气量1.5l/min，培养温度20℃，搅拌速度260rpm，培养时间为24h，得到各个菌株的种子液。
60.活菌计数：按照下述各个菌种的活有效活菌数占总有效活菌数的百分比将上述制得的各个菌种的种子液混合制成混合种子液：所述的热带假丝酵母菌的有效活菌数占总有效活菌数的25％，所述的扣囊复膜孢酵母的有效活菌数占总有效活菌数的35％，所述的枯草芽孢杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的10％，所述的谷氨酸棒杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的25％。
61.(4)保护剂的制备与添加
62.保护剂的制备：脱脂奶粉10mg/ml，生理盐水10mg/ml，甘油10mg/ml，其余的补充蒸馏水；115℃高压蒸汽灭菌30min。
63.保护剂添加：将灭菌好的保护剂，在无菌条件下按上述复合菌剂的重量百分比5％添加至复合菌剂中，搅拌均匀，获得液体复合菌剂。或者低温冷冻干燥或者低温喷干，获得干燥菌粉。
64.(5)产品质量检验与分装
65.经检验产品中活有效活菌数大于等于6.5
×
109cfu/ml，合格产品用塑料桶分装。
66.应用实施例2：
67.复合菌剂的制备，具体步骤如下：
68.(1)菌株活化
69.下述实施例中所述菌株活化为分别将复合菌剂的各个菌种接种到各个菌种对应的斜面培养基上培养，其中热带假丝酵母菌(zj-1)、扣囊复膜孢酵母(zj-2)接种到pda培养基上，30℃培养48小时，枯草芽孢杆菌(xj-1)、谷氨酸棒杆菌(xj-2)种到lb培养基上，40℃培养24小时，其菌落图片如图1。
70.(2)种子液制备
71.下述实施例中所述种子液制备为分别将步骤(1)活化的菌株，接种到各个菌种对应的三角瓶液体(200ml/500ml)，培养基上摇瓶培养，其中zj-1、zj-2接种到pda培养基上，30℃，摇床转速150rpm，培养72小时；xj-1、xj-2种到lb培养基上，30℃培养，摇床转速260rpm，24小时；得到各个菌株的种子培养液。
72.(3)混合种子液制备
73.分别将步骤(2)制得的各个菌种的三角瓶培养液按体积分数(v/v)的10％接种量，分别接种到装有种子培养基的发酵罐中(50l)，所述种子培养基由以下质量百分比的原料组成：玉米粉糖化液0.8％，玉米浆15％，硫酸铵5％，mgso40.1％，feso4.7h2o0.2％，kh2po40.5％，麸皮汁2％，ph＝5.5，余量为水；种子罐中培养通气量1l/min，培养温度40℃，搅拌速度150rpm，培养时间为72h，得到各个菌株的种子液。
74.活菌计数：按照下述各个菌种的活有效活菌数占总有效活菌数的百分比将上述制得的各个菌种的种子液混合制成混合种子液：所述的热带假丝酵母菌的有效活菌数占总有效活菌数的35％，所述的扣囊复膜孢酵母的有效活菌数占总有效活菌数的25％，所述的枯草芽孢杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的25％，所述的谷氨酸棒杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的10％。
75.(4)保护剂的制备与添加
76.保护剂的制备：脱脂奶粉15mg/ml，生理盐水8.5mg/ml，甘油15mg/ml，其余的补充蒸馏水；115℃高压蒸汽灭菌30min。
77.保护剂添加：将灭菌好的保护剂，在无菌条件下按上述复合菌剂的重量百分比2％添加至复合菌剂中，搅拌均匀，获得液体复合菌剂。或者低温冷冻干燥或者低温喷干，获得干燥菌粉。
78.(6)产品质量检验与分装
79.经检验产品中活有效活菌数大于等于6.5
×
109cfu/ml，合格产品用塑料桶分装。
80.应用实施例3：
81.复合菌剂的制备，具体步骤如下：
82.(1)菌株活化
83.下述实施例中所述菌株活化为分别将复合菌剂的各个菌种接种到各个菌种对应的斜面培养基上培养，其中热带假丝酵母菌(zj-1)、扣囊复膜孢酵母(zj-2)接种到pda培养基上，25℃培养60小时，枯草芽孢杆菌(xj-1)、谷氨酸棒杆菌(xj-2)种到lb培养基上，35℃培养30小时，其菌落图片如图1。
84.(2)种子液制备
85.下述实施例中所述种子液制备为分别将步骤(1)活化的菌株，接种到各个菌种对应的三角瓶液体(200ml/500ml)，培养基上摇瓶培养，其中zj-1、zj-2接种到pda培养基上，25℃，摇床转速160rpm，培养60小时；xj-1、xj-2种到lb培养基上，35℃培养，摇床转速260rpm，30小时；得到各个菌株的种子培养液。
86.(3)混合种子液制备
87.分别将步骤(2)制得的各个菌种的三角瓶培养液按体积分数(v/v)的10％接种量，分别接种到装有种子培养基的发酵罐中(50l)，所述种子培养基由以下质量百分比的原料组成：玉米粉糖化液0.5％，玉米浆20％，硫酸铵3％，mgso40.3％，feso4.7h2o0.15％，kh2po41％，麸皮汁1.5％，ph＝5.5，余量为水；种子罐中培养通气量1.2l/min，培养温度30℃，搅拌速度200rpm，培养时间为50h，得到各个菌株的种子液。
88.活菌计数：按照下述各个菌种的活有效活菌数占总有效活菌数的百分比将上述制得的各个菌种的种子液混合制成混合种子液：所述的热带假丝酵母菌的有效活菌数占总有效活菌数的30％，所述的扣囊复膜孢酵母的有效活菌数占总有效活菌数的30％，所述的枯草芽孢杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的20％，所述的谷氨酸棒杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的20％。
89.(4)保护剂的制备与添加
90.保护剂的制备：脱脂奶粉12mg/ml，生理盐水9mg/ml，甘油12mg/ml，其余的补充蒸馏水；115℃高压蒸汽灭菌30min。
91.保护剂添加：将灭菌好的保护剂，在无菌条件下按上述复合菌剂的重量百分比3％添加至复合菌剂中，搅拌均匀，获得液体复合菌剂。或者低温冷冻干燥或者低温喷干，获得干燥菌粉。
92.(7)产品质量检验与分装
93.经检验产品中活有效活菌数大于等于6.5
×
109cfu/ml，合格产品用塑料桶分装。
94.将应用实施例1所得复合菌剂进行实施例1～5的相关实验。
95.实施例1：复合菌剂的苯酚降解能力驯化
96.(1)新疆某企业苯酚废水，cod为8000～25000mg/l，挥发酚含量为1500～2500mg/l，ph6～9，盐度2％(电导率测定法)。
97.(2)废水中cod指标检测，采用国标hj828-2017方法检测；挥发酚类物质以苯酚为主要检测指标，采用高效液相色谱法，检测条件为检测波长270nm，sb-c18250mm柱,柱温35℃，70％的甲醇为流动相，流速0.6ml/min，检测时间10min。
98.(3)将含酚废水按照比例稀释为组1、组2、组3，其中组1：cod为8000mg/l，挥发酚含
量为380mg/l；组2：cod为16000mg/l，挥发酚含量为720mg/l；组3：cod为25000mg/l，挥发酚含量为1600mg/l；
99.(4)将所述复合菌剂按照10％的添加比例(体积比)，接种到组1中，培养5～7d，检测苯酚降解完全；转接到组2中，培养5～7d，检测苯酚降解完全；转接到组3中，培养5～7d，检测苯酚降解完全，驯化完成。
100.实施例2：复合菌剂的耐盐情况
101.(1)将复合菌剂分别接种于不同梯度的含盐苯酚废水中，分别测定其对苯酚以及cod的降解率；
102.(2)含盐苯酚废水的盐度用nacl进行调节，盐度分别设置为2％、3％、5％；其他配方为新疆某企业苯酚废水，cod为8000～15000mg/l，挥发酚含量为800～2500mg/l，ph6～9；
103.(3)将复合菌剂按照10％的体积接种量，接种于(2)中的梯度盐浓度苯酚废水中，连续培养7d，每天检测苯酚及cod的降解情况，具体结果见图2、图3。
104.(4)检测结果表明：本发明提供的复合菌剂在盐浓度为2％时，在第4d将苯酚降完全，在第7d将cod降至785mg/l；在盐浓度为3％时，在第5d将苯酚降完全，在第7d将cod降至1044mg/l；在盐浓度为5％时，在第6d将苯酚降完全，在第7d将cod降至1440mg/l。
105.实施例3：单株菌对苯酚废水的降解情况
106.(1)将上述活化菌株，单株菌按照10％的体积接种量(v/v)分别接种于新疆某企业苯酚废水中，其废水条件为：盐度为2％、cod为8000mg/l，挥发酚含量为850～900mg/l，ph7.0；
107.(2)细菌(xj1、xj2)条件为37℃、150rpm，真菌(zj1、zj2)条件为30℃、150rpm，连续培养7d，每天检测苯酚的降解情况，具体结果见附图4、图5、图6、图7。
108.(3)检测结果表明：zj1在第6天将苯酚降解到92.88％；zj2在第5天将苯酚降解到73.42％；xj1在第7天将苯酚降解到100％；xj2在第6天将苯酚降解到100％。
109.实施例4：复合菌剂对苯酚废水的降解情况
110.(1)将上述活化菌株，将上述4株菌分别两两组合和4种菌复配试验，组合1：菌株zj1、菌株zj2按照有效活菌数1:1比例混合；组合2：菌株xj1、菌株xj2按照有效活菌数1:1比例混合；组合3：菌株zj1、菌株zj2、菌株xj1、菌株xj2按照有效活菌数1：1：1：1比例混合；控制复合菌剂的总接种量为10％(v/v)，接种于新疆某企业苯酚废水中，其废水条件为：盐度为2％、cod为8000mg/l，挥发酚含量为850mg/l，ph7.0；
111.(2)培养条件为30℃、150rpm，连续培养7d，每天检测苯酚及cod的降解情况，组合1、组合2、组合3具体结果见图8、图9、图10。
112.(3)检测结果表明：真菌组合1在第4d将苯酚降解完全，在第5d将cod降价至75％；细菌组合2在第5d将苯酚降解完全，在第5d将cod降价至86％；复合菌剂(细菌+真菌)组合3在第3天将苯酚降解到100％，在第5d将cod降价至87％；对比实验组合1、组合2、组合3，发现对苯酚的降解是以真菌组合发挥主要作用，对cod的降解方面，细菌组合具备一定的优势；综合对比发现复合菌剂组合3比单菌株完全降解苯酚提前2-3d，说明菌剂复配能够更好的发挥真菌与细菌之间的协同效果，不仅快速降解了苯酚；同时也对cod的降解起到了协同作用，总去除率达到85％以上。
113.实施例5：复合菌剂在生物膜反应器中的运行情况
114.将上述复合菌剂按照10％的体积接种量加入实验室移动床膜生物反应器(movingbed biofilmreactor,mbbr)中，其废水条件为：盐度为2％、cod为25000mg/l，挥发酚含量为1600mg/l，ph5.0-9.0。前期进行闷爆工艺(即只曝气而不进废水)5-7d，苯酚降解50％后，逐步调整苯酚废水的进出水流速，每天对进出水的苯酚以及cod进行检测，持续43天的动态水质降解，经过4次进水流速调节，进水速度从0.06l/h升至0.6l/h，水力停留时间从(hrt)从96h提升到36h；苯酚的降解率在99.99％以上，cod的降解率在85％以上。具体数据如图11。
115.本发明提供的一种耐盐高效降解苯酚、cod的复合菌剂的制备方法及其应用及思路，应当指出，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂，其特征在于，是由热带假丝酵母菌、扣囊复膜孢酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混合制成，其中，所述的热带假丝酵母菌的有效活菌数占总有效活菌数的25～35％，所述的扣囊复膜孢酵母的有效活菌数占总有效活菌数的25～35％，所述的枯草芽孢杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的10～25％，所述的谷氨酸棒杆菌的有效活菌数占总有效活菌数的10～25％。2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述热带假丝酵母菌选自cicc1254、cicc1321、cicc1351中的至少一种；所述的扣囊复膜孢酵母选自cicc1429、cicc1981、cicc31128中的至少一种；所述的枯草芽孢杆菌选自cicc10732、cicc25064、cicc10260中的至少一种；所述的谷氨酸棒杆菌选自cicc20043、cicc10049、cicc10132中的至少一种。3.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的总有效活菌数大于等于6.5
×
109cfu/ml。4.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，热带假丝酵母菌、扣囊复膜孢酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌的有效活菌数比例为1：1：1：1。5.权利要求1～4中任一项所述一种耐盐高效降解挥发酚、cod的复合菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：先将热带假丝酵母菌、扣囊复膜孢酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌分别活化、培养获得相应的种子液，混合，得到混合种子液；然后在无菌条件下将灭菌保护剂加入混合种子液中，搅拌均匀，得到液体复合菌剂；其中，所述保护剂是由以下组分混合制成的：脱脂奶粉10～15mg/ml，生理盐水8.5～10mg/ml，甘油10～15mg/ml，其余的补充蒸馏水。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母的活化方法为：将热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母接种至pda培养基上，20～30℃培养48～72小时；枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌的活化方法为：将枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌接种至lb培养基上，30～40℃培养24～36小时。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母的培养方法为：先将活化后的热带假丝酵母菌或扣囊复膜孢酵母接种至pda培养基，在20～30℃和150～160rpm条件下摇床培养48～72小时，接着以10％体积接种量接种至装有种子培养基的发酵罐中，通气量1～1.5l/min，培养温度20～30℃，搅拌速度150～160rpm，培养时间48～72小时，即得相应的种子液；枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌的培养方法为：先将活化后的枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌接种至lb培养基，在30～40℃和200～260rpm条件下摇床培养24～36小时，接着以10％体积接种量接种至装有种子培养基的发酵罐中，通气量1.5～2.0l/min，培养温度30～40℃，搅拌速度200～260rpm，培养时间24～36小时，即得相应的种子液。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，保护剂的添加量为混合种子液质量的2～5％。9.权利要求1～4中任一项所述复合菌剂在含挥发酚废水处理中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，利用生物膜反应器进行含挥发酚废水处理。

技术总结
本发明公开了一种耐盐高效降解苯酚、COD的复合菌剂，是将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)、扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)复配制成。本发明的复合菌剂是由真菌和细菌复配而成，充分发挥真菌和细菌的协同降解作用，在含酚、高COD浓度废水中具有广阔的应用前景。度废水中具有广阔的应用前景。度废水中具有广阔的应用前景。


技术研发人员：苗红霞 潘琨 曹斌 吴纪南
受保护的技术使用者：中核华纬工程设计研究有限公司
技术研发日：2023.04.22
技术公布日：2023/7/22