一种黄酒中生物胺的检测方法与流程

1.本发明涉及黄酒检测方法领域，具体涉及一种黄酒中生物胺的检测方法。
背景技术：
：：2.生物胺广泛存在于食品中，是具有生物活性的低分子含氮有机化合物的总称，一般发酵食品中的生物胺含量明显高于非发酵食品。黄酒是我国传统的发酵酒，含有丰富的氨基酸与维生素等营养物质，黄酒及其他涉及发酵工艺的液体调味料在发酵过程中，一些微生物(乳酸菌、酵母菌等)产生氨基酸脱羧酶，使游离的氨基酸脱羧形成相应的生物胺，摄入过量生物胺会给人体带来健康风险，引起头痛、恶心、呼吸紊乱等反应，严重时还会危及生命。我国并没有规定调味品中的生物胺含量的限量标准，文献表明黄酒中生物胺含量在18.6～140.0mg/l，平均含量为78.3mg/l，远高于葡萄酒和啤酒中生物胺的含量。因此，生物胺成为黄酒中一种潜在的风险物质。3.目前食品中生物胺的检测方法主要为有液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法等。样品前处理技术常见的有丹磺酰氯衍生法、液液萃取法、固相萃取法、免疫亲和层析法、磁珠免疫净化法、quechers法等，而gb5009.208-2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》采用的前处理方法是丹磺酰氯衍生法，同时用内标法定量，存在操作相对烦琐，有机试剂消耗多，不适合高通量检测等缺点，针对我国巨大的黄酒中生物胺检测需求，因此需要建立一种前处理快速简单、成本低的黄酒中生物胺的检测方法。技术实现要素：4.本发明的目的，是为了解决
背景技术：
：中的问题，提供一种黄酒中生物胺的检测方法。5.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种黄酒中生物胺的检测方法，包括以下步骤：s1，盐析辅助液液萃取，称取4～6g黄酒置于离心管中，先后加入1.5～3g碳酸铵和1.0～3.0ml异丙醇溶液，涡旋至碳酸铵固体完全溶解，然后9000～11000r/min转速下离心4～6min；s2，混匀，移取全部上层有机层置于容量瓶中，加水定容至刻度，混匀；s3，过滤，混匀后的样品通过尼龙滤膜进行过滤；s4，液相色谱分离，样品利用流动相进行梯度洗脱，在beh-amide色谱柱上对样品进行分离；s5，质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，采用电喷雾正离子模式检测，基质标准曲线外标法定量。6.采用的流动相分为流动相a和流动相b，流动相a为0.4％甲酸乙腈溶液流；流动相b为10mmol/l甲酸铵溶液，梯度洗脱的程序为0.0～1min，90％流动相a；1～3.0min，90％～60％流动相a；3.0～7.0min，60％流动相a；7.0～8min，60％～90％流动相b；8～10min，90％流动相b；流速0.25ml/min；进样体积5μl；柱温35℃。7.本发明建立了以挥发性铵盐盐析辅助液液萃取结合超高效液相色谱-质谱法检测黄酒中3种生物胺的检测方法，该方法采用异丙醇作为提取溶剂、挥发性铵盐碳酸铵为盐析助剂，采用超高效液相色谱-质谱仪在正离子模式下检测，基质标准曲线外标法定量，同gb5009.208-2016第一法相比，该方法检出限达到现有国家标准，但无需加入内标和进行衍生化处理，有机试剂消耗少，试剂成本与时间成本较国家标准方法大大降低，操作简单快捷、实用性强，适用于黄酒及液体调味品的高通量检测。8.盐析液液萃取是一种通过向样品溶液与萃取溶剂混合物中加人适当的无机盐，促使萃取溶剂更好地从混合物中分离的萃取方法。该方法具有操作简单快速、溶剂消耗少、萃取效率高等优点。目前盐析液液萃取法在蜂蜜、血浆、白酒、水产品、婴幼儿食品、鱼类和肉类等样品的有毒有害物质残留检测中应用较多，但采用氯化钠、硫酸镁、碳酸钾等难挥发盐作为盐析剂与质谱联用时，提取溶剂中残留的盐会导致较强的离子抑制效应，降低待测物的灵敏度，限制了该方法的广泛使用。本发明通过筛选挥发性铵盐作为盐析剂，采用盐析辅助液液萃取法结合超高效液相色谱-质谱仪在正离子模式下检测，基质标准曲线外标法定量，解决了质谱中因难挥发盐析剂带来的离子信号抑制问题。9.液相色谱分离和质谱检测采用超高效液相色谱-质谱仪，所述超高效液相色谱-质谱仪包括有箱体和自上而下依次设置在箱体上的溶剂瓶、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器，所述溶剂瓶与所述高压输液泵之间通过软管连接，所述软管上设有加热装置。10.本发明通过增加加热装置，能够对软管进行加热，防止温度太低对流动相产生影响，进而对检测器的正常工作带来不良影响，从而使得检测结果更加的准确。11.所述加热装置包括有加热箱、抽水泵、管状加温器，所述加热箱左侧的上部开设有第一进水口，所述加热箱左侧的下部开设有第一出水口，所述管状加温器的两端分别设有第二进水口与第二出水口，所述抽水泵的进水口与所述加热箱的第一出水口通过管道连接，所述抽水泵的出水口与所述管状加温器的第二进水口通过管道连接，所述管状加温器的第二出水口与所述加热箱的第一进水口连接，软管上设有温度传感器。12.本发明通过将管状加温器套设在软管上，当温度传感器检测到温度过低时，抽水泵将加热箱中的液体抽入至管状加温器，对软管进行加热，从而使得流过软管的流动相能够保持恒温，防止温度过低，对流动相产生影响，进而对检测器的正常工作带来不良影响。13.优选地，所述管状加温器包括有导热管、螺旋加热盘管、固定管，所述螺旋加热盘管固定设在所述导热管的内壁上，所述固定管套设在所述管状加温器的外侧壁上，所述软管的外侧壁沿着轴向方向环绕开设有螺旋安装槽，所述软管绕在所述螺旋安装槽上且位于所述固定管内，导热管可以为金属管，第二进水口与第二出水口为所述螺旋加热盘管的两端。14.通过螺旋加热盘管将加热箱内的液体螺旋进入至导热管的内壁，从而导热管充分导热，将热量传递给环绕在螺旋安装槽上的软管，对其加热，从而完成对软管的加热，通过螺旋环绕在导热管上的方式，使得软管缠绕在导热管上的长度加长，从而进行充分加热。15.优选地，所述固定管由第一半壳体与第二半壳体组成，所述第一半壳体开口端的两侧沿着长度方向开设有磁片安装凹槽，所述磁片安装凹槽的底部固定连接有第一磁片，所述第二半壳体上固定连接有与所述第一磁片相互配合的第二磁片，通过第一磁片与第二磁片的配合，使得固定管能够可拆卸，从而便于固定软管。16.优选地，所述加热箱包括有加热箱本体、隔板，所述隔板将加热箱本体分为加热腔和补液腔，所述隔板向上倾斜，所述隔板低端的底部开设有补液孔，所述隔板高端的底部开设有排气孔，所述加热箱本体位于所述补液腔的顶部设有补液盖，所述第一进水口设在所述加热腔侧壁的上部，所述第一出水口设在所述加热腔侧壁的下部，所述加热腔的底部设有加热机构，所述加热机构可以为加热片，也可以为加热丝，这是现有成熟的技术，因此不在本案进行赘述。17.本发明的加热箱通过第一进水口将导热液加入至加热腔内，之后将加热箱与抽水泵、管状加温器进行连接，之后通过加热机构进行加热，加热过程中，产生的空气通过排气孔进入至补液腔，之后补液腔内的液体通过补液孔进入至加热腔内，而将加热腔内的空气排除，防止加热腔内有空气影响导热。18.优选地，所述加热腔右端的侧壁上固定连接有向上倾斜的挡板，所述挡板靠近加热腔侧壁的一端为底端，另一端为高端，所述排气孔设在所述挡板的上方，通过挡板减小水流冲击，防止水冲过来会把气泡打散。19.优选地，所述排气孔靠近补液腔的一侧固定连接有进气管。通过进气管便于空气进入至补液腔。20.综上所述，本发明的有益效果：1.本发明建立了以挥发性铵盐盐析辅助液液萃取结合超高效液相色谱-质谱法检测黄酒中3种生物胺的检测方法，该方法采用异丙醇作为提取溶剂、挥发性铵盐碳酸铵为盐析助剂，采用超高效液相色谱-质谱仪在正离子模式下检测，基质标准曲线外标法定量，同gb5009.208-2016第一法相比，该方法检出限达到现有国家标准，但无需加入内标和进行衍生化处理，有机试剂消耗少，试剂成本与时间成本较国家标准方法大大降低，操作简单快捷、实用性强，适用于黄酒的高通量检测；2.本发明通过筛选挥发性铵盐作为盐析剂，采用盐析辅助液液萃取法结合超高效液相色谱-质谱仪在正离子模式下检测，基质标准曲线外标法定量，解决了质谱中因难挥发盐析剂带来的离子信号抑制问题；3.本发明通过将管状加温器套设在软管上，当温度传感器检测到温度过低时，抽水泵将加热箱中的液体抽入至管状加温器，对软管进行加热，从而使得流过软管的流动相能够适宜的温度，防止温度过低，对流动相产生影响，进而对检测器的正常工作带来不良影响，从而使得检测结果更加的准确；4.本发明的加热箱通过第一进水口将导热液加入至加热腔内，之后将加热箱与抽水泵、管状加温器进行连接，之后通过加热机构进行加热，加热过程中，产生的空气通过排气孔进入至补液腔，之后补液腔内的液体通过补液孔进入至加热腔内，从而将加热腔内的空气排除，防止加热腔内有空气影响导热。附图说明21.图1是本发明检测方法流程示意图；图2是本发明超高效液相色谱-质谱仪的整体示意图；图3是本发明加热装置的剖视示意图；图4是本发明管状加温器的剖视示意图；图5是本发明软管绕在导热管上的示意图；图6是本发明螺旋安装槽的示意图；图7是本发明固定管前视示意图；图8是本发明图7的a处的放大示意图；图9是碳酸铵质量筛选图；图10是本发明异丙醇体积条件筛选图；图11是本发明盐析剂类型筛图；图12是本发明样品ph条件筛选图；图13是本发明溶剂类型筛选图。具体实施方式22.以下具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。23.下面结合附图以实施例对本发明进行详细说明。24.实施例1如图1所示，一种黄酒中生物胺的检测方法，包括以下步骤：s1，盐析辅助液液萃取，称取5g黄酒置于离心管中，先后加入2.5g碳酸铵和2ml异丙醇溶液，涡旋至碳酸铵固体完全溶解，然后10000r/min转速下离心5min；s2，混匀，移取全部上层有机层(约2.5ml)置于3.0ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀；s3，过滤，混匀后的样品通过过0.22μm尼龙滤膜进行过滤；s4，液相色谱分离，样品利用流动相进行梯度洗脱，在beh-amide色谱柱上对样品进行分离；s5，质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，采用电喷雾正离子模式检测，基质标准曲线外标法定量。25.建立基于挥发性铵盐盐析辅助液液萃取结合超高效液相色谱-质谱法检测黄酒中β-苯乙胺、酪胺、色胺3种生物胺的分析方法。方法：黄酒样品用异丙醇提取，碳酸铵作为盐析助剂分层，提取液加水定容后，采用beh-amide色谱柱以0.1％甲酸和5mmol/l甲酸铵溶液/甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子模式检测，外标法定量。实验考察了萃取溶剂、盐析助剂及ph对萃取效率的影响。结果：最优实验条件下，在1～200μg/ml范围内3种生物胺线性良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.01～0.04μg/kg，定量限为0.03～0.12μg/kg；对空白黄酒与食用醋样品进行高中低3个水平的加标实验，回收率为71.6％～100.7％，相对标准偏差为0.9％～5.5％。结论该方法操作简捷、无需衍生化、外标法直接定量、成本低、灵敏度高、线性范围广、适用性强。可满足多种黄酒中3种生物胺的快速准确分析要求。26.采用的流动相分为流动相a和流动相b，流动相a为0.4％甲酸乙腈溶液流；流动相b为10mmol/l甲酸铵溶液，梯度洗脱的程序为0.0～1min，90％流动相a；1～3.0min，90％～60％流动相a；3.0～7.0min，60％流动相a；7.0～8min，60％～90％流动相b；8～10min，90％流动相b；流速0.25ml/min；进样体积5μl；柱温35℃，。27.采取基质加标制备标准曲线：精密吸取上述混合标准工作液各5μl进超高效液相色谱-质谱仪检测，测定定量离子出峰面积，以进样浓度(x，ng/ml)为横坐标，定量离子峰面积(y)为纵坐标，绘制3种生物胺基质标准溶液曲线图。28.质谱条件：电喷雾正离子(electronsprayionization，esi+)模式扫描，多反应监测(multiplereactionmonitoring，mrm)模式检测；毛细管电压为0.5kv；离子源温度350℃；脱溶剂温度350℃；脱溶剂气流速800l/h；锥孔气流速50l/h；碰撞气为氩气；β-苯乙胺，酪胺，色胺的有关质谱参数详见表1。29.表1待测物的监测离子对及最佳质谱参数表1待测物的监测离子对及最佳质谱参数注：a：定性离子对；b：定量离子对。30.数据处理试样中3种生物胺含量按式(1)计算：式(1)中：xi-试样中生物胺的含量，μg/kg；ci-样品溶液中生物胺的含量，ng/ml；v-样品溶液定容体积，ml；m-称量样品质量，g。31.数据统计与分析采用spss26.0软件对数据进行单因素方差分析(one-wayanalysisofvariance，anova)、最小显著差(leastsignificantdifference，lsd)多重比较，显著水平设为a＝0.05，以p＜0.05表示差异具有统计学意义；使用origin9.0进行数据绘图。32.反应体系ph值的优化根据相关发明显示，ph值是影响生物胺萃取效率的重要因素，在酸性或中性的条件下，某些生物胺不易检出，而调味品的初始ph值多为酸性，因此，本实验探究了4.0(初始ph)、7.0、10.0、11.0、12.0五种反应体系ph值对生物胺回收率的影响，如图12所示，结果表明，随着ph值的增大，三种生物胺的回收率有逐渐增大的趋势，其中，ph值对酪胺的提取效率的影响尤为显著，但在ph值达到10以后，随着ph值的增大，三种生物呢胺的回收率并未呈现显著性差异，因此，选择ph＝10为该实验最佳ph值。33.生物胺对照品溶液的制备β-苯乙胺、酪胺、色胺标准储备液的配制：称取或吸取采购的β-苯乙胺、酪胺、色胺标准品与标准溶液适量，用甲醇稀释，配制质量浓度为1μg/ml的β-苯乙胺、酪胺、色胺标准储备液，-20℃下避光保存。吸取β-苯乙胺、酪胺、色胺标准储备液适量，经空白基质溶液稀释，配制成浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200ng/ml的β-苯乙胺、色胺和酪胺标准工作溶液。取1ml标准溶液经0.22μm尼龙滤膜后供仪器分析。34.标准曲线、线性范围与检出限由于黄酒基质效应较强，通过比较基质标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率，测得3种生物胺基质效应(matrixeffect，me)在58～87％之间，显示出一定的基质抑制效应，因此采用基质标准曲线定量。将5个浓度生物胺混合对照基质溶液依次进超高效液相色谱-质谱仪测定，绘制3种生物胺标准曲线图，通过仪器软件线性拟合自动得到线性方程与相关系数，结果见表2。由表2可知，3种目标物线性拟合良好，相关系数(r2)均大于0.999。β-苯乙胺，酪胺，色胺对照品色谱图见图6。由图6可见，3种生物胺峰形对称、周围无杂峰干扰，可以满足定量检测要求。依据信噪比(s/n)＝3，通过降低进样浓度得出3种生物胺的检出限，是以3倍检出限来确定定量限，结果见表2，4种生物胺检出限为0.2～0.4μg/kg，定量限为0.6～1.2μg/kg，说明方法灵敏度较高。35.表2β-苯乙胺、酪胺、色胺的回归方程、线性范围、检出限与定量限回收率与精密度实验在黄酒和食用醋阴性空白样品中分别加入高中低3种浓度的生物胺标准溶液，按照已建立的方法重复测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差(relativestandarddeviations，rsds)，结果见表3-4。由表3-4可知，3种生物胺在黄酒空白基质中的加标回收率为71.6％～100.7％，rsds在1.3％～5.5％之间。在食用醋空白基质中的加标回收率为71.7％～97.6％，rsds在0.9％～5.2％之间，由此可见，该方法不仅在黄酒中，在其他液体调味料中，3种生物胺精密度和回收率均能满足定量检测要求。该方法具有通用性。36.样品检测与分析为验证所建立方法的实用性和可靠性，采用该方法用于实际样品中生物胺的筛查。采集当地市场随机抽取的黄酒和食用醋样品共计20批，1h内即可完成所有样品的前处理。37.与文献方法的比较表4为本方法与已报道的黄酒等液体调味品中生物胺检测方法的比较。由表4可知，本方法具有检出限低和回收率高等优点。更为重要的是，传统的生物胺检测方法较为复杂，前期前处理过程往往需要进行衍生化反应以及添加内标物质，时间成本高，试剂消耗量大，而本方法大大简化了操作步骤，无需衍生化和加入内标，有机试剂用量极少、成本更低、对环境更友好，具有较好的应用前景，可作为一种简便、快速、高效检测液体调味料中痕量生物胺的新方法。38.表3精密度及回收率测试结果(n＝6)table3resultsoftestsforrecoveryandprecision(n＝6)表4精密度及回收率测试结果(n＝6)table3resultsoftestsforrecoveryandprecision(n＝6)表5本方法与调味品中生物胺其他检测比较table4comparisonofthismethodwithothermethodsfordeterminationofaflatoxinsinsoysauce注：超高效液相色谱-质谱检测方法(ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry)；高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)；/为未注明。39.本发明建立了以挥发性铵盐盐析辅助液液萃取结合超高效液相色谱-质谱法检测黄酒中3种生物胺的检测方法；该方法采用异丙醇作为提取溶剂、挥发性铵盐碳酸铵为盐析助剂，采用超高效液相色谱-质谱仪在正离子模式下检测，基质标准曲线外标法定量，解决了质谱中因难挥发盐析剂带来的离子信号抑制问题。同gb5009.208-2016第一法相比，该方法检出限达到现有国家标准，但无需加入内标和进行衍生化处理，有机试剂消耗少，试剂成本与时间成本较国家标准方法大大降低，操作简单快捷、实用性强，适用于黄酒中生物胺污染的高通量检测。40.如图2-8所示，液相色谱分离和质谱检测采用超高效液相色谱-质谱仪1，所述超高效液相色谱-质谱仪1包括有箱体11和自上而下依次设置在箱体11上的溶剂瓶12、高压输液泵13、进样器14、色谱柱15、检测器16，所述溶剂瓶12与所述高压输液泵13之间通过软管17连接，所述软管17上设有加热装置2，所述加热装置2包括有加热箱21、抽水泵22、管状加温器23，所述加热箱21左侧的上部开设有第一进水口211，所述加热箱21左侧的下部开设有第一出水口212，所述管状加温器23的两端分别设有第二进水口231与第二出水口232，所述抽水泵22的进水口与所述加热箱21的第一出水口212通过管道连接，所述抽水泵22的出水口与所述管状加温器23的第二进水口231通过管道连接，所述管状加温器23的第二出水口232与所述加热箱21的第一进水口211连接，所述管状加温器23包括有导热管233、螺旋加热盘管234、固定管235，所述螺旋加热盘管234固定设在所述导热管233的内壁上，所述固定管235套设在所述管状加温器23的外侧壁上，所述软管17的外侧壁沿着轴向方向环绕开设有螺旋安装槽171，所述软管17绕在所述螺旋安装槽171上且位于所述固定管235内，所述固定管235由第一半壳体236与第二半壳体237组成，所述第一半壳体236开口端的两侧沿着长度方向开设有磁片安装凹槽238，所述磁片安装凹槽238的底部固定连接有第一磁片239，所述第二半壳体237上固定连接有与所述第一磁片239相互配合的第二磁片240。41.如图3所示，所述加热箱21包括有加热箱本体213、隔板214，所述隔板214将加热箱本体213分为加热腔215和补液腔216，所述隔板214向上倾斜，所述隔板214低端的底部开设有补液孔217，所述隔板214高端的底部开设有排气孔218，所述加热箱本体213位于所述补液腔216的顶部设有补液盖219，所述第一进水口211设在所述加热腔215侧壁的上部，所述第一出水口212设在所述加热腔215侧壁的下部，所述加热腔215的底部设有加热机构210，所述加热腔215右端的侧壁上固定连接有向上倾斜的挡板24，所述挡板24靠近加热腔215侧壁的一端为底端，另一端为高端，所述排气孔218设在所述挡板24的上方，所述排气孔218靠近补液腔216的一侧固定连接有进气管25。42.工作原理：如图2-8所示，使用超高效液相色谱-质谱仪时，将溶剂瓶12出来的软管17缠绕在管状加温器23的螺旋安装槽171内，之后将第一半壳体236与第二半壳体237通过第一磁片与第二磁片进行吸合，之后加热箱21内加入导热液，一般导热液为水，之后将管状加温器23的螺旋加热盘管234的第二进水口231与所述抽水泵22连接，抽水泵22与所述加热箱的第一出水口212连接，螺旋加热盘管234的第二出水口231与所述加热箱的第一进水口211连接，之后加热箱23开始工作，当温度传感器检测到温度低时，抽水泵从加热箱内进行抽水，加热后的水经过螺旋加热盘管234从而对软管进行加热，之后水重新流入至加热箱内进行循环使用，从而对软管进行加热，防止温度太低对流动相产生影响，进而对检测器的正常工作带来不良影响，从而使得检测结果更加的准确。43.整个加热过程中，加热箱21内产生的的空气通过排气孔218进入至补液腔216，之后补液腔216内的液体通过补液孔217进入至加热腔215内，从而将加热腔215内的空气排除，防止加热腔215内有空气影响导热。44.实施例2，与实施例1不同的是碳酸铵的用量为1.5g；实施例3，与实施例1不同的是碳酸铵的用量为2.0g；实施例4，与实施例1不同的是碳酸铵的用量为3.0g；盐析剂质量对盐析效果至关重要，本发明进一步探究了碳酸铵的用量(1.50、2.00、2.50g、3.00g)对盐析液液萃取富集效应和萃取效率的影响，结果见图9。发明表明：不同碳酸铵用量对盐析后的有机相体积影响较大，随着碳酸铵用量由1.50g增加到2.50g时，提取回收率和有机相析出体积随碳酸铵用量的增大而提高，随着碳酸铵用量进一步加大时，提取回收率和有机相析出体积的增加并不显著(p＞0.05)。因此，从节约试剂原则出发，确定2.50g为最佳盐析剂质量。45.实施例5，与实施例1不同的是异丙醇用量在1.0ml。46.实施例6，与实施例1不同的是异丙醇用量在2.0ml。47.实施例7，与实施例1不同的是异丙醇用量在3.0ml。48.过低的萃取溶剂体积会导致萃取不完全，降低萃取效率，过高的萃取溶剂体积则降低富集倍数，浪费有机试剂。因此，本发明比较了萃取溶剂异丙醇的用量(1.0～3.0ml)对萃取溶剂与样品溶液分层效果和目标物萃取效率的影响，结果见图10。异丙醇用量在1.0ml时，盐析后有机层体积较少、回收率很低，增加异丙醇用量，不同生物胺的提取回收率得到较大幅度的提升，三种生物胺在异丙醇用量在2.0ml以上回收率较2.0ml以下用量差异显著(p＜0.05)，此时，当异丙醇用量继续增加到3.0ml时提取回收率差异不显著(p＞0.05)。因此，为节省有机溶剂和缩短提取时间，确定2.0ml为最佳提取体积。49.对比实施例1，与实施例1不同的是采用的是甲酸铵作为盐析剂。50.对比实施例2，与实施例1不同的是采用的是乙酸铵作为盐析剂。51.对比实施例3，与实施例1不同的是采用的是氯化铵作为盐析剂。52.对比实施例4，与实施例1不同的是采用的是硫酸铵作为盐析剂。53.盐析剂的选取直接影响目标物萃取效率的高低。由于在盐析液液萃取当中，过量盐的使用会使得萃取溶剂中带有盐析剂，而残留的难挥发盐会在质谱中降低目标物离子丰度，并对仪器硬件造成腐蚀和污染。因此本发明选择易挥发的铵盐作为盐析剂，分别考察了甲酸铵、乙酸铵、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵5种铵盐对生物胺的提取效率，实验发现，只有加入碳酸铵和硫酸铵作为盐析剂的反应体系发生了明显的萃取溶剂与样品溶液的分层现象，如图11(不同小写字母表示存在显著性差异(p＜0.05))，结果显示，碳酸铵对3种生物胺的提取回收率均优于硫酸铵，且具有显著差异(p＜0.05)，因此选用碳酸铵作为盐析剂。54.对比实施例5，与实施例1不同的是采用的是乙腈作为萃取溶剂。55.对比实施例6，与实施例1不同的是采用的是甲醇作为萃取溶剂。56.对比实施例7，与实施例1不同的是采用的是正丙醇作为萃取溶剂。57.对比实施例8，与实施例1不同的是采用的是正丁醇作为萃取溶剂。58.萃取溶剂是影响萃取效率的重要因素之一。在盐析液液萃取中，萃取溶剂一般要求密度小于水且与水混溶，同时又要在加入盐后与水分层，因此本发明考察了乙腈、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇5种常见的萃取溶剂。加入盐析剂碳酸铵后，乙腈、正丙醇、异丙醇、正丁醇四种反应体系出现明显分层，测定3种目标物的提取回收率，结果见图13，考察β-苯乙胺和酪胺的回收率，数据显示回收率大小排序为正丙醇＞异丙醇＞正丁醇＞乙腈，三种醇类与乙腈之间显示出显著差异，而酪胺的回收率，则显示为异丙醇＞正丙醇＞正丁醇＞乙腈，且溶剂间均呈现显著差异(p＜0.05)，因此，从通用性角度出发，选取异丙醇作为三种生物胺的萃取溶剂。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，盐析辅助液液萃取，称取4～6g黄酒置于离心管中，先后加入1.5～3g碳酸铵和1.0～3.0ml异丙醇溶液，涡旋至碳酸铵固体完全溶解，然后9000～11000r/min转速下离心4～6min；s2，混匀，移取全部上层有机层置于容量瓶中，加水定容至刻度，混匀；s3，过滤，混匀后的样品通过尼龙滤膜进行过滤；s4，液相色谱分离，样品利用流动相进行梯度洗脱，在beh-amide色谱柱上对样品进行分离；s5，质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，采用电喷雾正离子模式检测，基质标准曲线外标法定量。2.根据权利要求1所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，采用的流动相分为流动相a和流动相b，流动相a为0.4％甲酸乙腈溶液流；流动相b为10mmol/l甲酸铵溶液。3.根据权利要求2所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为0.0～1min，90％流动相a；1～3.0min，90％～60％流动相a；3.0～7.0min，60％流动相a；7.0～8min，60％～90％流动相b；8～10min，90％流动相b；流速0.25ml/min；进样体积5μl；柱温35℃。4.根据权利要求1所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，液相色谱分离和质谱检测采用超高效液相色谱-质谱仪(1)，所述超高效液相色谱-质谱仪(1)包括有箱体(11)和自上而下依次设置在箱体(11)上的溶剂瓶(12)、高压输液泵(13)、进样器(14)、色谱柱(15)、检测器(16)，所述溶剂瓶(12)与所述高压输液泵(13)之间通过软管(17)连接，所述软管(17)上设有加热装置(2)。5.根据权利要求1所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，所述加热装置(2)包括有加热箱(21)、抽水泵(22)、管状加温器(23)，所述加热箱(21)左侧的上部开设有第一进水口(211)，所述加热箱(21)左侧的下部开设有第一出水口(212)，所述管状加温器(23)的两端分别设有第二进水口(231)与第二出水口(232)，所述抽水泵(22)的进水口与所述加热箱(21)的第一出水口(212)通过管道连接，所述抽水泵(22)的出水口与所述管状加温器(23)的第二进水口(231)通过管道连接，所述管状加温器(23)的第二出水口(232)与所述加热箱(21)的第一进水口(211)连接。6.根据权利要求5所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，所述管状加温器(23)包括有导热管(233)、螺旋加热盘管(234)、固定管(235)，所述螺旋加热盘管(234)固定设在所述导热管(233)的内壁上，所述固定管(235)套设在所述管状加温器(23)的外侧壁上，所述软管(17)的外侧壁沿着轴向方向环绕开设有螺旋安装槽(171)，所述软管(17)绕在所述螺旋安装槽(171)上且位于所述固定管(235)内。7.根据权利要求6所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，所述固定管(235)由第一半壳体(236)与第二半壳体(237)组成，所述第一半壳体(236)开口端的两侧沿着长度方向开设有磁片安装凹槽(238)，所述磁片安装凹槽(238)的底部固定连接有第一磁片(239)，所述第二半壳体(237)上固定连接有与所述第一磁片(239)相互配合的第二磁片(240)。
8.根据权利要求5所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，所述加热箱(21)包括有加热箱本体(213)、隔板(214)，所述隔板(214)将加热箱本体(213)分为加热腔(215)和补液腔(216)，所述隔板(214)向上倾斜，所述隔板(214)低端的底部开设有补液孔(217)，所述隔板(214)高端的底部开设有排气孔(218)，所述加热箱本体(213)位于所述补液腔(216)的顶部设有补液盖(219)，所述第一进水口(211)设在所述加热腔(215)侧壁的上部，所述第一出水口(212)设在所述加热腔(215)侧壁的下部，所述加热腔(215)的底部设有加热机构(210)。9.根据权利要求8所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，所述加热腔(215)右端的侧壁上固定连接有向上倾斜的挡板(24)，所述挡板(24)靠近加热腔(215)侧壁的一端为底端，另一端为高端，所述排气孔(218)设在所述挡板(24)的上方。10.根据权利要求9所述的一种黄酒中生物胺的检测方法，其特征在于，所述排气孔(218)靠近补液腔(216)的一侧固定连接有进气管(25)。

技术总结
本发明公开一种黄酒中生物胺的检测方法。采用黄酒样品用异丙醇提取，碳酸铵作为盐析助剂分层，提取液加水定容后，采用BEH-Amide色谱柱以0.1％甲酸和5mmol/L甲酸铵溶液/甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子模式检测，外标法定量，建立基于挥发性铵盐盐析辅助液液萃取结合超高效液相色谱-质谱法检测黄酒中β-苯乙胺、酪胺、色胺3种生物胺的分析方法，该方法操作简捷、无需衍生化、外标法直接定量、成本低、灵敏度高、线性范围广、适用性强。可满足多种液体调味品中3种生物胺的快速准确分析要求。析要求。析要求。


技术研发人员：王东旭 杨帆 王新财 胡奇杰 王凤丽
受保护的技术使用者：湖州市食品药品检验研究院（湖州市药品和医疗器械不良反应监测中心、湖州市医疗器械监督检验中心、湖州市食品认证审评和粮油质量监测中心）
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/7/22