一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法及应用

1.本发明属于医学动物模型技术领域，具体涉及一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.心力衰竭(heart failure)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心衰是最重要也是最严重的心血管病之一，随着年龄增加，心衰患病率迅速增加，70岁以上人群患病率可上升至10％以上，4年死亡率达50％，严重者1年死亡率高达50％。心衰可按照射血分数分类为射血分数降低的心衰(hfref)，射血分数中间值的心衰(hfmref)，射血分数保留的心衰(hfpef)。射血分数保留的心衰(hfpef)也称为舒张期心衰，即左心室射血分数正常或接近正常(通常≥50％)的心衰，其诊断标准包括：1)有典型心衰症状和体征；2)保留正常的左心室射血分数值；3)有相关结构性心脏病存在的证据如左心室肥厚和(或)舒张功能障碍。射血分数保留的心衰(hfpef)是一种发病率和死亡率很高的疾病，约占心力衰竭患者入院人数的一半，是心衰最常见的形式。虽然hfref和hfpef的临床表现类似于心衰，但临床证据认为这两个综合征的病理生理机制不同，已证实对hfref有效的神经激素治疗未能改善hfpef的症状，且目前还没有治疗方法可以改善hfpef，因此一个被广泛认可的hfpef模型对于hfpef的发病机制研究和药物开发十分重要。
3.目前已有的hfpef小鼠模型包括血管紧张素ii刺激模型、瘦素受体缺陷小鼠模型、高脂或西方饮食诱导模型、老年鼠模型、加速衰老模型以及组合模型(醋酸脱氧皮质酮及高盐模型、醛固酮单肾切除模型、高脂饮食合并结构性一氧化氮合酶抑制剂(l-name)模型)。其中血管紧张素ii刺激模型存在表型不稳定，症状较轻微的问题；瘦素受体缺陷小鼠模型在生命早期出现严重症状，老年期出现舒张性功能障碍；高脂或西方饮食诱导模型容易诱发肾功能损伤；老年鼠模型造模时间长，通常需要1年以上的造模时间；加速衰老模型通常伴随其它功能障碍混杂因素。因此，急需构建一种射血分数保留的心衰动物模型，进一步探究hfpef的机制，并以此寻找新的治疗靶点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法及应用。本发明的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法操作简单，可实现标准化，诱导成功率高，所需要的时间较短，为后续的研究提供了基础，为进一步研究射血分数保留的心衰的发生机制和临床治疗和药物筛选奠定了基础。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，将rbp4过表达小鼠饲喂6个月，得射血分数保留的心衰小鼠模型。现有技术中的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建周期长，大多需要一年左右。本发明的射血分数保
留的心衰小鼠模型仅需将rbp4过表达小鼠饲喂6个月，构建周期短。本发明的rbp4过表达小鼠的构建方法包括转基因技术、重组腺相关病毒(adeno-associated virus aav)载体进行rbp4基因过表达或体内注射rbp4重组蛋白等使小鼠体内rbp4水平持续升高的技术方法。
6.作为本发明所述射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述rbp4过表达小鼠为雄性小鼠。
7.作为本发明所述射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述rbp4过表达小鼠的构建方法包括以下步骤：
8.(1)将rbp4过表达载体注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内；
9.(2)对步骤(1)的母鼠产出的f0代小鼠的dna进行pcr鉴定，获得f0代rbp4过表达小鼠；
10.(3)将f0代rbp4过表达小鼠与野生型小鼠交配获得子代雄鼠，经鉴定后获得rbp4过表达小鼠。
11.本技术发明人研究发现，采用上述构建方法繁育rbp4过表达小鼠，可以大批量繁殖获得遗传性状稳定的rbp4过表达小鼠，且构建成本较低。
12.作为本发明所述射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的小鼠为c57bl/6j小鼠。
13.作为本发明所述射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述pcr鉴定的引物包括：
14.转基因正向引物：cctcctgaacctcgatggca；
15.转基因逆向引物：ccggccatcaccactttgta；
16.内控基因正向引物：actccaaggccacttatcacc；
17.内控基因逆向引物：attgttaccaactgggacgaca。
18.作为本发明所述射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法的优选实施方式，还包括对小鼠进行模型特征检测。
19.作为本发明所述射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述模型特征包括小鼠尾部收缩压与舒张压、小鼠心室结构和收缩功能、小鼠左心室舒张功能、小鼠心衰相关症状体征和小鼠心脏大小及结构变化。
20.本发明还提供一种采用所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法构建的射血分数保留的心衰小鼠模型。
21.本发明还提供所述的射血分数保留的心衰小鼠模型在研究射血分数保留的心力衰竭中的应用。
22.本发明还提供所述的射血分数保留的心衰小鼠模型在筛选和/或制备治疗射血分数保留的心力衰竭药物中的应用。
23.本发明的有益效果：本发明提供一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法。本发明的射血分数保留的心衰小鼠模型仅需将rbp4过表达小鼠饲喂6个月即可获得所述射血分数保留的心衰小鼠模型，操作简单，可实现标准化，诱导成功率高，所需要的时间较短，节省时间和经济成本。
tg小鼠，对繁殖出的f1代rbp4-tg小鼠进行基因型鉴定。取待鉴定小鼠尾尖组织提取dna，使用dna凝胶电泳技术分离dna条带，根据条带分子量鉴定小鼠基因型。同时对f1代rbp4-tg小鼠血清rbp4浓度进行测量。
39.如图2b所示，rbp4-tg小鼠在224bp处存在特异性条带，野生型小鼠仅在413bp处显示条带。如图2c所示，f1代rbp4-tg小鼠血清rbp4浓度显著高于野生型小鼠，证明rbp4过表达模型小鼠构建成功。
40.表1
[0041][0042]
表2
[0043][0044]
实施例2
[0045]
本实施例构建射血分数保留的心衰动物模型，具体方法如图3所示：将实施例1构建得到的rbp4过表达模型小鼠(rbp4-tg雄性小鼠)作为实验组，野生型小鼠(wt小鼠)作为对照组。将实验组和对照组小鼠饲养于spf级动物房的独立通气笼中，喂养期间自由摄食和饮水，饲喂至6月龄后进行检测，具体检测方法和结果如下：
[0046]
(1)小鼠血压改变检测：使用无创小鼠血压仪分别测量实验组和对照组小鼠尾部收缩压与舒张压。结果如图4所示。由图4a可知，rbp4-tg小鼠血压相较于野生型小鼠无明显改变；同时使用动脉插管直接测量小鼠主动脉血压，由图4b可知野生型与rbp4-tg小鼠血压无明显差异。
[0047]
(2)小鼠心室结构和收缩功能改变检测：使用小动物超声成像系统对实验组和对照组小鼠进行心脏超声检测，评估小鼠心脏收缩功能；对小鼠左心室胸骨旁短轴切面和胸骨旁长轴切面的超声图像进行分析。结果如图5所示，由图5a-b可知，rbp4-tg小鼠左心室射
血分数不变且大于50％，左心室质量显著增加，判断rbp4-tg小鼠发生左心室离心性肥厚。接着对小鼠心脏的应变力进行分析，结果如图5c-f所示，可以发现rbp4-tg小鼠左心室整体纵向应变(gls)显著降低，左心室整体圆周应变(gcs)、左心室整体径向应变(grs)、左心室缩短分数(fs)无显著变化，表明rbp4-tg小鼠左心室纵轴方向顺应性变差，僵硬度增加，收缩功能略有降低。
[0048]
(3)小鼠左心室舒张功改变检测：在小鼠心脏超声四腔心切面，用脉冲多普勒采集小鼠左心室二尖瓣口血流数据，得到舒张早期二尖瓣血流速度峰值(e)；用组织多普勒采集小鼠左心室二尖瓣环室间隔侧的运动数据，得到舒张早期二尖瓣环运动速度峰值(e')。结果如图6所示。由图6a-c可知，rbp4-tg小鼠e'显著降低，e/e'显著升高，提示rbp4-tg小鼠左心室舒张功能障碍、充盈压力增高。为了获取左心室内压力变化的直接证据，将带有压力传感器的导管经小鼠右颈总动脉插入小鼠左心室，直接检测小鼠左心室压力的变化，结果如图6d-e所示，小鼠左心室收缩末期压力(lvesp)、左心室舒张末期压力(lvedp)均显著升高。
[0049]
(4)rbp4-tg小鼠心衰相关症状体征变化：为了探讨小鼠是否出现心衰相关症状和体征，在小动物跑步机上检测两组小鼠的最大跑步距离，以判断小鼠的运动耐量；称量新鲜摘取的小鼠肺脏湿重(lw)，并分离小鼠胫骨在显微镜测量其长度(tl)，用胫骨长度校正的肺重量(lw/tl)判断小鼠的肺充血情况。结果如图7a-c所示，rbp4-tg小鼠跑步距离显著降低、lw/tl显著升高，提示rbp4-tg小鼠运动耐量下降、肺充血更加严重，即出现了心衰的典型症状和体征。
[0050]
(5)rbp4-tg小鼠心脏大小及结构变化：为了进一步确认小鼠的心脏结构变化，取实验组和对照组小鼠整个心脏组织称重并拍照。如图8a-c所示发现rbp4-tg小鼠心脏显著增大，心脏重量显著增加，胫骨长度校正的心脏重量显著增加。对小鼠心肌横切面和纵切面石蜡切片进行he染色，结果如图8d-e所示，可知rbp4-tg小鼠心肌横切面积和纵切面积均显著增大。
[0051]
将本实施例构建得到的射血分数保留的心衰动物模型的特征与目前使用较多、认可度较高的hfpef动物模型和hfpef诊断标准进行比较。如表3所示，本发明的射血分数保留的心衰小鼠模型呈现出hfpef的主要症状特征，且具有操作简便、耗时较短的优点。
[0052]
表3
[0053][0054]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和
范围。

技术特征：
1.一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，将rbp4过表达小鼠饲喂6个月，得射血分数保留的心衰小鼠模型。2.根据权利要求1所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述rbp4过表达小鼠为雄性小鼠。3.根据权利要求1所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述rbp4过表达小鼠的构建方法包括以下步骤：(1)将rbp4过表达载体注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内；(2)对步骤(1)的母鼠产出的f0代小鼠的dna进行pcr鉴定，获得f0代rbp4过表达小鼠；(3)将f0代rbp4过表达小鼠与野生型小鼠交配获得子代雄鼠，经鉴定后获得rbp4过表达小鼠。4.根据权利要求3所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的小鼠为c57bl/6j小鼠。5.根据权利要求3所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述pcr鉴定的引物包括：转基因正向引物：cctcctgaacctcgatggca；转基因逆向引物：ccggccatcaccactttgta；内控基因正向引物：actccaaggccacttatcacc；内控基因逆向引物：attgttaccaactgggacgaca。6.根据权利要求1所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括对小鼠进行模型特征检测。7.根据权利要求6所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述模型特征包括小鼠尾部收缩压与舒张压、小鼠心室结构和收缩功能、小鼠左心室舒张功能、小鼠心衰相关症状体征和小鼠心脏大小及结构变化。8.一种采用权利要求1～7任一项所述的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法构建的射血分数保留的心衰小鼠模型。9.权利要求8所述的射血分数保留的心衰小鼠模型在研究射血分数保留的心力衰竭中的应用。10.权利要求8所述的射血分数保留的心衰小鼠模型在筛选和/或制备治疗射血分数保留的心力衰竭药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法及应用，属于医学动物模型技术领域。本发明的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法为将RBP4过表达小鼠饲喂6个月，得射血分数保留的心衰小鼠模型。本发明的射血分数保留的心衰小鼠模型的构建方法操作简单，可实现标准化，诱导成功率高，所需要的时间较短，为后续的研究提供了基础，为进一步研究射血分数保留的心衰的发生机制和临床治疗和药物筛选奠定了基础。选奠定了基础。选奠定了基础。


技术研发人员：柳雁 陈样新 夏敏 赵雅文
受保护的技术使用者：中山大学孙逸仙纪念医院
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/22