一种光固化的透明质酸基复合水凝胶及其制备与应用

1.本发明属于生物医用材料的技术领域，具体涉及一种光固化的透明质酸基复合水凝胶及其制备与应用。


背景技术：

2.关节软骨是无血管、无淋巴的结缔组织，由软骨细胞、细胞外基质及大量的水组成，自修复能力很弱。因此软骨损伤修复一直是再生医学领域的难题。软骨组织工程是将支架材料与细胞、生长因子相结合的一种方法，被认为是软骨组织修复最有前景的研究方向。目前软骨组织工程已应用到临床，即自体软骨细胞移植术(aci)，但其存在着软骨细胞增殖过程中功能丢失、再生软骨纤维化和手术失败率高等问题，限制了其在临床上的广泛应用。
3.水凝胶是通过物理或化学交联形成的富含水的三维网络，具有与细胞外基质高度相似的结构和性质，因而在生物医学领域得到了广泛研究应用。水凝胶对软骨细胞进行三维包载有利于营养物质和代谢废物的交换运输，提供增殖生长的空间，可为软骨细胞提供适宜的生长微环境。与细胞直接接触的生物材料的力学性能会通过机械应力转导影响细胞行为，研究表明类细胞外基质的应力松弛环境更有利于细胞的黏附、迁移和增殖。
4.透明质酸是软骨细胞外基质中的重要组分，其能与细胞表面的cd44受体结合对细胞行为造成影响。透明质酸会刺激软骨细胞的代谢活动，能显著促进聚集蛋白聚糖、ii型胶原蛋白的分泌。软骨细胞能利用半乳糖为原料合成糖胺聚糖，半乳糖可促进软骨细胞分泌基质，半乳糖聚合物较半乳糖分子而言在水凝胶中的存留时间更长，能够为负载于凝胶中的软骨细胞提供基质分泌所需营养物质。
5.本发明制备的水凝胶以透明质酸为主体材料，通过接枝的苯硼酸官能团与半乳糖聚合物间形成动态苯硼酸酯键，既为软骨细胞制造了应力松弛微环境，还大量提供了其分泌基质所需的营养物质。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供了一种用于软骨组织工程的光固化的透明质酸基复合水凝胶及其制备方法。本发明利用光引发自由基聚合以及苯硼酸基团和1，2-或1，3-二醇间形成苯硼酸酯键，得到了具有良好生物相容性和应力松弛特性的水凝胶，可以包裹细胞原位注射光固化成胶，成胶过程温和快速，在软骨组织工程领域具有广泛的应用前景。本发明的复合水凝胶用于软骨组织工程。
7.为了实现以上目的，本发明所提供的技术方案为：
8.一种光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.在缓冲溶液中，将改性透明质酸和半乳糖聚合物以及光引发剂混合，光固化，获得透明质酸基复合水凝胶。
10.所述改性透明质酸的结构式为式i：
[0011][0012]
其中n＞0且n为整数。
[0013]
所述半乳糖聚合物的结构式为式ii：
[0014][0015]
其中n为25～100的整数。
[0016]
所述改性透明质酸在缓冲溶液中的质量浓度为1～10％，半乳糖聚合物在缓冲溶液中的质量浓度为0.1～5％。
[0017]
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
[0018]
所述光引发剂为光引发剂i2959、光引发剂lap、光引发剂va-086中一种以上。
[0019]
所述光引发剂在缓冲溶液中的质量浓度为0.1～0.5％。缓冲溶液的密度按照1g/ml计算。
[0020]
所述光固化为紫外光固化，光照的时间为1～5min。
[0021]
所述改性透明质酸的制备，包括以下步骤：
[0022]
1)在吗啉乙磺酸缓冲液中，采用活化剂将透明质酸进行活化；然后加入3-氨基苯硼酸一水合物，反应，透析冻干，得到苯硼酸改性透明质酸；
[0023]
2)在水中，将高碘酸钠与苯硼酸改性透明质酸进行反应，透析冻干，得到氧化的苯硼酸改性透明质酸；
[0024]
3)低温下，将甲基丙烯酸酐与氧化的苯硼酸改性透明质酸的水溶液混合，将ph值调节至碱性后反应，离心取上清液透析冻干，获得氧化的苯硼酸和双键改性透明质酸。
[0025]
步骤1)中，所述透明质酸和3-氨基苯硼酸一水合物的质量比为5∶1～10∶1。
[0026]
步骤1)中，所述活化剂为4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐或edc/nhs体系。
[0027]
步骤1)中，所述反应的时间为12～36h。所述反应为避光室温反应。
[0028]
步骤1)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
[0029]
步骤2)中，所述苯硼酸改性透明质酸和高碘酸钠的质量比为1∶1～5∶1。
[0030]
步骤2)中，所述反应的时间为0.5～6h。
[0031]
步骤2)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
[0032]
步骤3)中，所述低温的温度为1～4℃，所述ph值为8～10，所述反应的时间为12～24h。
[0033]
步骤3)中，所述氧化的苯硼酸改性透明质酸和甲基丙烯酸酐的质量比为1∶2～1∶7。
[0034]
所述甲基丙烯酸酐采用滴加的方式加入。
[0035]
所述ph值调节至碱性中调节是指采用碱进行调节，如：naoh。
[0036]
步骤3)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
[0037]
所述的半乳糖聚合物的制备，包括以下步骤：
[0038]
s1)将6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖与引发剂和链转移剂溶于有机溶剂中，进行聚合反应；猝灭反应，后续处理，得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)；
[0039]
s2)将步骤s1)得到的聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)用三氟乙酸溶液脱去吡喃糖环上的羟基保护基团异亚丙基，经透析冻干得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-d-半乳糖)。
[0040]
步骤s1)中，所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化二苯甲酰中一种以上。
[0041]
步骤s1)中，所述链转移剂为4-氰基-4(苯基硫代甲酰硫基)戊酸。
[0042]
步骤s1)中，所述有机溶剂为1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n二甲基甲酰胺中一种以上。
[0043]
步骤s1)中，所述6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖与链转移剂的摩尔比为50∶1～120∶1，所述引发剂与链转移剂的摩尔比为1∶4～1∶6。
[0044]
步骤s1)中，所述聚合反应的条件为无氧环境下65～80℃下反应12～48h。
[0045]
步骤s1)中，所述猝灭反应是指进行低温猝灭，所述低温是指-20℃～-80℃。
[0046]
步骤s1)中，所述后续处理为用甲醇醇沉后真空干燥。
[0047]
步骤s2)中，所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸与水的体积比为5∶1～3∶1。
[0048]
步骤s2)中，所述透析是指使用截留分子量为3000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
[0049]
所述光固化的透明质酸基复合水凝胶通过上述制备方法得到。
[0050]
所述光固化的透明质酸基复合水凝胶在组织工程领域中的应用，特别是软骨组织工程领域，用作软骨细胞三维培养和/或软骨修复。
[0051]
所述光固化的透明质酸基复合水凝胶用于软骨细胞三维培养，包括以下步骤：
[0052]
(1)将软骨细胞与水凝胶预聚液混合，得到复合物；复合物中细胞密度为1
×
105～1
×
107个/ml预聚液；所述水凝胶预聚液为前面所述透明质酸基复合水凝胶光固化前的混合液；
[0053]
(2)将复合物注入细胞培养装置中，在365nm紫外光下照射1～3min，实现对软骨细胞的三维包封。
[0054]
本发明的水凝胶用于软骨组织工程领域，包括软骨细胞三维培养及病损软骨修复等。本发明通过光引发自由基聚合的方式制备同时含有静态共价交联和苯硼酸酯动态交联的水凝胶，反应条件温和，制得的水凝胶具有良好的生物相容性和应力松弛特性，同时多种成分构成的复合水凝胶的微环境有利于软骨细胞形态和功能维持。
[0055]
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
[0056]
(1)本发明所用原料透明质酸为天然提取物，来源广泛，是软骨细胞外基质的重要组分，能为软骨细胞提供更相似的生长微环境。
[0057]
(2)本发明的水凝胶制备过程简单容易操作，制备条件温和，有利于软骨细胞的三维包封。
[0058]
(3)本发明制备的水凝胶具有应力松弛特性，更有利于软骨细胞的生长、增殖及特征基质分泌。
[0059]
(4)本发明中的半乳糖聚合物可用于软骨细胞的营养物。
附图说明
[0060]
图1为实施例1制备的改性透明质酸的核磁氢谱图；
[0061]
图2为实施例1制备的半乳糖聚合物的核磁氢谱图；
[0062]
图3为实施例4-7制备的复合水凝胶的应力松弛曲线；
[0063]
图4为实施例8制备的水凝胶用于软骨细胞的体外三维培养的活死染色结果图；
[0064]
图5为实施例8制备的水凝胶用于软骨细胞的体外三维培养，培养7天后aggrecan基因的表达情况。
具体实施方式
[0065]
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0066]
实施例1
[0067]
(1)将1g透明质酸溶于100mm吗啉乙磺酸缓冲液中，全部溶解后加入0.692g羧基活化剂4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐搅拌30min以活化羧基；称取0.129g 3-氨基苯硼酸一水合物加入溶液中，室温避光反应24h；将反应后的溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析三天，透析结束后过滤后冷冻干燥，得到苯硼酸改性透明质酸；
[0068]
(2)将1g步骤(1)产物加入150ml去离子水中，室温搅拌待其完全溶解后滴加5ml的0.5m高碘酸钠溶液，避光反应2h，加入1ml乙二醇猝灭未反应的高碘酸盐，继续搅拌反应1h，置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析三天，透析结束后冷冻干燥得到氧化的苯硼酸改性透明质酸；
[0069]
(3)将2g步骤(2)产物加入200ml去离子水，4℃低温反应器中搅拌使其完全溶解，用恒压漏斗逐滴滴加7.5ml甲基丙烯酸酐；逐滴滴加5m氢氧化钠溶液至反应溶液ph稳定在8～9之间，继续反应12h，将反应液10000rpm离心15min后取上清液置于截留分子量为8000～14000透析袋中透析三天，透析结束后冷冻干燥得到氧化的苯硼酸和双键改性透明质酸；
[0070]
(4)将6.56g 6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖、6.6mg引发剂偶氮二异丁腈和55.8mg链转移剂4-氰基-4(苯基硫代甲酰硫基)戊酸混合，溶于20ml 1，4-二氧六环中，随后将反应液用鼓气法除氧40min，随后置于预热至75℃的油浴锅中反应16h，转移至-80℃冰箱猝灭反应；解冻后用20倍体积甲醇沉淀，10000rpm离心15min后倒弃溶液，留底部沉淀于真空烘箱中干燥，得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)；
[0071]
(5)将步骤(4)产物用三氟乙酸溶液(tfa/h2o＝4/1)溶解，室温搅拌反应4h后用截留分子量为3000的透析袋透析三天，冷冻干燥得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-d-半乳糖)；
[0072]
(6)称取80mg的步骤(3)产物、5mg的步骤(5)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解；将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的复合凝胶。
[0073]
对本实施例制备的改性透明质酸和半乳糖聚合物进行核磁测试，结果分别见图1、2。
[0074]
实施例2
[0075]
(1)将1g透明质酸溶于100mm吗啉乙磺酸缓冲液中，全部溶解后加入0.692g羧基活化剂4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐搅拌30min以活化羧基，称取0.158g 3-氨基苯硼酸一水合物加入溶液中，室温避光反应18h；溶液置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析三天，透析结束后过滤后冷冻干燥得到苯硼酸改性透明质酸；
[0076]
(2)将1g步骤(1)产物加入150ml去离子水中，室温搅拌待其完全溶解后滴加8ml的0.5m高碘酸钠溶液，避光反应1h，加入2ml乙二醇猝灭未反应的高碘酸盐，继续搅拌反应1h；置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析三天，透析结束后冷冻干燥得到氧化的苯硼酸改性透明质酸；
[0077]
(3)将2g步骤(2)产物加入200ml去离子水，2℃低温反应器中搅拌使其完全溶解，用恒压漏斗逐滴滴加10.5ml甲基丙烯酸酐；逐滴滴加5m氢氧化钠溶液至反应溶液ph稳定在8～9之间，继续反应20h；将反应液10000rpm离心15min后取上清液置于截留分子量为8000～14000透析袋中透析三天，透析结束后冷冻干燥得到氧化的苯硼酸和双键改性透明质酸；
[0078]
(4)将6.56g 6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖、8.2mg引发剂偶氮二异丁腈和69.8mg链转移剂4-氰基-4(苯基硫代甲酰硫基)戊酸混合，溶于20ml 1，4-二氧六环中，随后将反应液用鼓气法除氧60min，随后置于预热至70℃的油浴锅中反应24h，转移至-80℃冰箱猝灭反应；解冻后用20倍体积甲醇沉淀，10000rpm离心15min后倒弃溶液，留底部沉淀于真空烘箱中干燥，得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)；
[0079]
(5)将步骤(4)产物用三氟乙酸溶液(tfa/h2o＝5/1)溶解，室温搅拌反应3h后用截留分子量为3000的透析袋透析三天，冷冻干燥得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-d-半乳糖)；
[0080]
(6)称取60mg的步骤(3)产物、20mg的步骤(5)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解。将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的复合凝胶。
[0081]
实施例3
[0082]
(1)将1g透明质酸溶于100mm吗啉乙磺酸缓冲液中，全部溶解后加入0.692g羧基活化剂4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐搅拌45min以活化羧基，称取0.186g 3-氨基苯硼酸一水合物加入溶液中，室温避光反应30h；溶液置于截留分子量为8000～
14000的透析袋中透析三天，透析结束后过滤后冷冻干燥得到苯硼酸改性透明质酸；
[0083]
(2)将1g步骤(1)产物加入150ml去离子水中，室温搅拌待其完全溶解后滴加5ml的0.2m高碘酸钠溶液，避光反应4h，加入1ml乙二醇猝灭未反应的高碘酸盐，继续搅拌反应1h；置于截留分子量为8000～14000的透析袋中透析三天，透析结束后冷冻干燥得到氧化的苯硼酸改性透明质酸；
[0084]
(3)将2g步骤(2)产物加入200ml去离子水，4℃低温反应器中搅拌使其完全溶解，用恒压漏斗逐滴滴加7ml甲基丙烯酸酐；逐滴滴加5m氢氧化钠溶液至反应溶液ph稳定在8～9之间，继续反应16h；将反应液10000rpm离心15min后取上清液置于截留分子量为8000～14000透析袋中透析三天，透析结束后冷冻干燥得到氧化的苯硼酸和双键改性透明质酸；
[0085]
(4)将6.56g6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖、13.7mg引发剂偶氮二异丁腈和93.1mg链转移剂4-氰基-4(苯基硫代甲酰硫基)戊酸混合，溶于20ml 1，4-二氧六环中，随后将反应液用鼓气法除氧60min，随后置于预热至80℃的油浴锅中反应14h，转移至-80℃冰箱猝灭反应；解冻后用20倍体积甲醇沉淀，10000rpm离心15min后倒弃溶液，留底部沉淀于真空烘箱中干燥，得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)；
[0086]
(5)将步骤(4)产物用三氟乙酸溶液(tfa/h2o＝3/1)溶解，室温搅拌反应5h后用截留分子量为3000的透析袋透析三天，冷冻干燥得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-d-半乳糖)；
[0087]
(6)称取20mg的步骤(3)产物、40mg的步骤(5)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解；将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的复合凝胶。
[0088]
实施例4
[0089]
步骤(1)-(3)同实施例1；
[0090]
(4)称取40mg的步骤(3)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解；将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的改性透明质酸凝胶，命名为a4p0。
[0091]
实施例5
[0092]
步骤(1)-(5)同实施例1；
[0093]
(6)称取40mg的步骤(3)产物、5mg的步骤(5)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解；将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的复合凝胶，命名为a4p0.5。
[0094]
实施例6
[0095]
步骤(1)-(5)同实施例1；
[0096]
(6)称取40mg的步骤(3)产物、10mg的步骤(5)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解；将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的复合凝胶，命名为a4p1。
[0097]
实施例7
[0098]
步骤(1)-(5)同实施例1；
[0099]
(6)称取40mg的步骤(3)产物、20mg的步骤(5)产物和2mg光引发剂i2959溶于1ml的磷酸盐缓冲液中，在室温下避光搅拌至完全溶解；将预聚液注入直径10mm，高度5mm的模具中，在365nm紫外灯下照射2min固化得到透明的复合凝胶，命名为a4p2。
[0100]
实施例8
[0101]
将实施例4-7中配制的水凝胶预聚液过0.22μm针式滤膜除去预聚液中的细菌，用预聚液重悬软骨细胞得到软骨细胞悬液。将细胞悬液注射进48孔板中，每孔0.2ml，在紫外灯下照射2min成胶。加入软骨细胞专用培养基后置于细胞培养箱中培养4h，更换新的培养基后继续培养观察软骨细胞行为。
[0102]
性能测试：
[0103]
使用动态热机械分析仪(dma，q800)测试实施例4-7制备得到的复合水凝胶的压缩应力松弛，所得到的应力松弛曲线如图3所示。结果表示，随着半乳糖聚合物含量增加，复合凝胶的应力松弛速率越快。这是因为随着半乳糖聚合物含量增加，形成的苯硼酸酯键越多。
[0104]
将实施例8中软骨细胞包载密度为5
×
105个/ml的凝胶材料体外培养第1、4、7天时与calcein-am和pi活死染色工作液在37℃下孵育15min，通过激光共聚焦显微镜进行观察拍照，照片如图4所示。图4为实施例8中水凝胶用于软骨细胞的体外三维培养的活死染色结果图。结果表示，在三维培养过程中软骨细胞一直具有很好的活性，表明水凝胶良好的生物相容性。
[0105]
将实施例8中软骨细胞包载密度为5
×
106个/ml的凝胶材料体外培养7天后采用聚合链式反应(pcr)检测软骨相关特征基因aggrecan的表达情况，结果如图5所示。图5为实施例8中水凝胶用于软骨细胞的体外三维培养，培养7天后aggrecan基因的表达情况。结果表示，a4p1组促aggrecan表达的效果最好，证明复合水凝胶对其中包载的细胞具有促基质分泌的效果。
[0106]
以上所述实例只为本发明之较佳实施例，并非以此限定本发明的实施范围，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在其中。

技术特征：
1.一种光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：在缓冲溶液中，将改性透明质酸和半乳糖聚合物以及光引发剂混合，光固化，获得透明质酸基复合水凝胶；所述改性透明质酸的结构式为式i：其中n＞0且n为整数；所述半乳糖聚合物的结构式为式ii：其中n为25～100的整数。2.根据权利要求1所述光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述改性透明质酸在缓冲溶液中的质量浓度为1～10％，半乳糖聚合物在缓冲溶液中的质量浓度为0.1～5％；所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液；所述光引发剂为光引发剂i2959、光引发剂lap、光引发剂va-086中一种以上；所述光引发剂在缓冲溶液中的质量浓度为0.1～0.5％；所述光固化为紫外光固化，光照的时间为1～5min。3.根据权利要求1所述光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述改性透明质酸的制备，包括以下步骤：1)在吗啉乙磺酸缓冲液中，采用活化剂将透明质酸进行活化；然后加入3-氨基苯硼酸一水合物，反应，透析冻干，得到苯硼酸改性透明质酸；2)在水中，将高碘酸钠与苯硼酸改性透明质酸进行反应，透析冻干，得到氧化的苯硼酸改性透明质酸；3)低温下，将甲基丙烯酸酐与氧化的苯硼酸改性透明质酸的水溶液混合，将ph值调节至碱性后反应，离心取上清液透析冻干，获得氧化的苯硼酸和双键改性透明质酸。4.根据权利要求3所述光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤
1)中，所述透明质酸和3-氨基苯硼酸一水合物的质量比为5∶1～10∶1；步骤1)中，所述活化剂为4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐或edc/nhs体系；步骤1)中，所述反应的时间为12～36h；所述反应为避光室温反应；步骤2)中，所述苯硼酸改性透明质酸和高碘酸钠的质量比为1∶1～5∶1；步骤2)中，所述反应的时间为0.5～6h；步骤3)中，所述低温的温度为1～4℃，所述ph值为8～10，所述反应的时间为12～24h；步骤3)中，所述氧化的苯硼酸改性透明质酸和甲基丙烯酸酐的质量比为1∶2～1∶7。5.根据权利要求3所述光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天；步骤2)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天；步骤3)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。6.根据权利要求1所述光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述半乳糖聚合物的制备，包括以下步骤：s1)将6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖与引发剂和链转移剂溶于有机溶剂中，进行聚合反应；猝灭反应，后续处理，得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)；s2)将步骤s1)得到的聚(6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖)用三氟乙酸溶液脱去吡喃糖环上的羟基保护基团异亚丙基，经透析冻干得到聚(6-o-甲基丙烯酰基-d-半乳糖)。7.根据权利要求6所述光固化的透明质酸基复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤s1)中，所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化二苯甲酰中一种以上；步骤s1)中，所述链转移剂为4-氰基-4(苯基硫代甲酰硫基)戊酸；步骤s1)中，所述有机溶剂为1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n二甲基甲酰胺中一种以上；步骤s1)中，所述6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮半乳糖与链转移剂的摩尔比为50∶1～120∶1，所述引发剂与链转移剂的摩尔比为1∶4～1∶6；步骤s1)中，所述聚合反应的条件为无氧环境下65～80℃下反应12～48h；步骤s1)中，所述猝灭反应是指进行低温猝灭，所述低温是指-20℃～-80℃；步骤s1)中，所述后续处理为用甲醇醇沉后真空干燥；步骤s2)中，所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸与水的体积比为5∶1～3∶1；步骤s2)中，所述透析是指使用截留分子量为3000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。8.一种由权利要求1～7任一项所述制备方法得到的光固化的透明质酸基复合水凝胶。9.根据权利要求8所述光固化的透明质酸基复合水凝胶在软骨组织工程中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述透明质酸基复合水凝胶用于软骨细胞三维培养和/或受损软骨修复的修复材料。

技术总结
本发明属于生物医用材料的技术领域，公开了一种光固化的透明质酸基复合水凝胶及其制备与应用。方法：在缓冲溶液中，将改性透明质酸和半乳糖聚合物以及光引发剂混合，光固化，获得透明质酸基复合水凝胶。所述改性透明质酸的结构式为式I，所述半乳糖聚合物的结构式为式II。所述复合水凝胶用于软骨组织工程领域，包括软骨细胞三维培养及受损软骨修复等。本发明通过光引发自由基聚合的方式制备同时含有静态共价交联和苯硼酸酯动态交联的水凝胶，反应条件温和，制得的水凝胶具有良好的生物相容性和应力松弛特性，同时多种成分构成的复合水凝胶的微环境有利于软骨细胞形态和功能维持。胶的微环境有利于软骨细胞形态和功能维持。胶的微环境有利于软骨细胞形态和功能维持。


技术研发人员：刘卅 任力 刘颖 袁中润 闭港源 宋文婧
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/7/22