一种新型不对称双查尔酮化合物、合成方法及其应用

1.本发明涉及一种新型不对称双查尔酮化合物、合成方法及其应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤已成为当今突出的公共卫生问题，目前治疗的方式主要有手术治疗、放射治疗、化学疗法、生物治疗等，其中，化学药物治疗仍是主要的治疗方式。一线治疗药物主要是经典的细胞毒性药物，毒性和副作用严重。因此，鉴别具有更高疗效、更低毒性的新型小分子化学药物对治疗肿瘤至关重要。
3.设计使用天然产物作为先导化合物的药物一直是当前药物发现的一个重要组成部分。查尔酮是一类广泛分布于蔬菜、水果、茶和各种植物中的天然化合物，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。“双查尔酮”是查尔酮家族的一名成员，也具有多种药理活性。然而，到目前为止，无论是从天然产物还是化学合成中分离出来的双查尔酮，都是具有对称结构的化合物（图1 a）。“不对称双查尔酮”尚未见报道，其是否具有药理活性尚不清楚。合成的挑战可能是不对称的双查尔酮尚未被报道的原因。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种新型不对称双查尔酮化合物、合成方法及其应用。
5.本发明所采取的技术方案如下：一种新型不对称双查尔酮化合物，所述化合物如通式（）所示,；其中r1和r2为不同基团。
6.进一步的，合成其的反应式如下：具体包括以下步骤：s1：原甲酸三乙酯和催化量的氯化铵与对苯二甲醛进行缩醛反应，得到化合物2；
s2：化合物2和r1取代的苯乙酮在氢氧化钾催化下进行克莱森-施密特反应，得到中间体3a-3b；s3：然后通过加入三氟乙酸去除中间体3a-3b的保护基团，得到中间化合物4a-4b；s4：最后在氢氧化钾的催化下，再次将中间化合物4a-4b与r2取代的苯乙酮进行缩合反应，得到新型不对称双查尔酮化合物。
7.优选地，所述对苯二甲醛与原甲酸三乙酯的投料比为3：1；中间化合物4a-4b与r2取代的苯乙酮的投料比为1：10；通过氢氧化钾控制s2中溶液的ph值为8~9，s4中溶液的ph值为9~10。
8.还提供上述新型不对称双查尔酮化合物在制备抗肿瘤产品中的应用，具体为：r1为2-取代的卤素，2-取代的烷氧基或3-取代的烷氧基；r2为h，单取代或多取代的2-、3-、4-、5-的卤素，单取代或多取代的2-、3-、4-、5-的烷氧基，单取代或多取代的2-、3-、4-、5-的卤代烷基，或，单取代或多取代的2-、3-、4-、5-的烷基氨基。
9.优选的，将上述新型不对称双查尔酮化合物应用于抗肿瘤产品，其中r1为2-取代的卤素；作为最优选，将其应用于治疗胃癌的药物组合物，其中r1为2-cl，r2为3, 4, 5-och3。
10.上述新型不对称双查尔酮化合物用于抗肿瘤产品及包括其的药物组合物，均落入本发明的保护范围，所述药物组合物的制剂形式选自注射剂、片剂、栓剂、膜剂、胶囊剂、软膏剂、气雾剂、滴丸剂、控释或缓释剂和纳米制剂的一种。
11.本发明的有益效果如下：本发明采用四步法合成了一系列新型的不对称双查尔酮化合物，该化合物表现出良好的抗肿瘤活性。
12.进一步的，采用人工智能的随机森林算法建立了定量构效关系模型（r2= 0.851627），发现最佳化合物j3浓度依赖性地抑制胃癌细胞集落的形成，并通过诱导促凋亡蛋白parp的表达导致细胞凋亡；此外，在每日10 mg/kg剂量下，j3在体内抑制肿瘤生长近70%，并对裸鼠的体重和器官无明显的毒性作用，由此可见，该新型化合物具有良好的应用于抗胃癌药物的前景。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
14.图1为非对称双查尔酮的设计策略；其中(a)查尔酮的结构公式和合成，以及已报道的对称双查尔酮；(b)未报道的不对称双查尔酮的结构公式；(c)基于四步法合成的不对称双查尔酮和活性化合物的设计与筛选；(d)最佳化合物j3；图2为化合物n1-n10、j1-j17的合成步骤；试剂和条件：a.原甲酸三甲酯，氯化铵，乙醇，0℃； b. (r1取代的)苯乙酮，氢氧化钾，乙醇，室温； c.三氟乙酸，二氯甲烷，室温；d. （r2取代的）苯乙酮，氢氧化钾，乙醇，室温；图3：qsar模型的构建；（a、b、c）根据理化性质和分子结构计算了化合物的分子描述符；qsar模型由rf算法构建；
图4：j3抑制bgc-823和sgc-7901集落形成；（a，b）采用集落形成法测定不同浓度的j3（分别为1μm、2.5μm、5μm）处理后的bgc-823和sgc-7901的细胞增殖情况；图5：j3诱导bgc-823胃癌细胞凋亡；（a，c）bgc-823细胞用不同浓度的j3处理24小时，使用流式细胞术检测凋亡率；（b，d）western blotting用于检测用j3处理24小时的bgc-823细胞中促凋亡蛋白裂解parp的表达（与对照组相比，**p《0.01，***p《0.001）；图6：（a）对照组与实验组，（b）肿瘤体积；（c）肿瘤质量；（d）裸鼠体重；（e）器官系数；图7：简明扼要地展现本发明首次合成的不对称双查尔酮化合物的结构以及其抗肿瘤活性。
具体实施方式
15.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
16.实施例1.不对称双查尔酮化合物的合成:不对称双查尔酮化合物的反应式如下所示：其制备过程如下：s1：将购买得到的原甲酸三乙酯和催化量的氯化铵在0℃下与对苯二甲醛进行缩醛反应，得到一侧保护的化合物2；s2：接下来，化合物2和r1取代的苯乙酮在10%氢氧化钾催化下进行克莱森-施密特反应，得到中间体3a-3b；s3：然后通过加入三氟乙酸去除中间体3a-3b的保护基团，得到中间化合物4a-4b；s4：最后，在10%氢氧化钾的催化下，再次将中间化合物4a-4b与r2取代的苯乙酮进行缩合反应，成功得到了所需的化合物n1-n10和j1-j17（如表1-2所示）。
17.其中，在化合物2制备的条件筛选过程中，发现对苯二甲醛与原甲酸三乙酯的投料比会明显影响目标产品的收率，当对苯二甲醛与原甲酸三乙酯的投料比为3：1时，目标产品的收率最佳，可提高到80%，利用该比例制备了后续的化合物。
18.其中，在化合物3a-3b制备的条件筛选过程中，发现反应液中碱的浓度会影响收率，当碱的浓度过低，反应不易进行，当碱的浓度过高，就会产生额外的副产物（对称双查尔酮化合物），其原因可能是缩醛在强碱性条件下不稳定地分解为化合物4a-4b，然后与另一个分子的取代苯乙酮进行醛醇缩合，因此形成我们不期望的对称双查尔酮化合物。因此，经过大量实验，最后确定有必要控制催化剂的添加量使反应液的ph值在8-9之间。
19.其中，在最终产物n1-n10和j1-j17制备的条件筛选过程中，发现反应液的ph值以
及化合物4a-4b与不同取代苯乙酮的投料比会明显影响收率，经过大量实验确定，将溶液的ph值控制在9~10，此时化合物4a-4b与不同取代苯乙酮的投料比为1：10，普遍收率较高，部分化合物的收率可达70%以上。
20.本实施例以最优方案进行合成的具体实验过程如下：1.1药品来源及仪器除非另有说明，所有化学品均从商业来源购买，并按提供的方式使用，无需进一步纯化。柱层析(cc)在硅胶(200-300目，中国青岛海洋化学公司)上进行。所有化合物均通过硅胶薄层色谱法（250 m硅胶60 f254 玻璃板）验证均匀性。通过tlc监测反应进程并通过254nm和365nm的紫外光可视化。1h nmr和
13
cnmr光谱（400 mhz）在 bruker 400 ultrashield 光谱仪上使用四甲基硅烷（tms，内标）以百万分之几（ppm）为单位记录。使用 bruker esquire 3000t 光谱仪以正模式收集电子喷雾电离质谱 (esi-ms) 数据。目标化合物的1h 和
13
c光谱在补充数据中提供。使用fisher-johns 熔点仪测定熔点，未经校正。目标化合物j3的纯度为≥95%，采用安捷伦c18柱（4.6 mm
×
150 mm，5μm）的hplc（hplc）分析，采用梯度洗脱（甲醇/水=85/15~100/0），流速为1 ml/min。
21.化合物2制备方法在对苯二甲醛（2.0g，15 mmol）和原甲酸三乙酯（0.74g，5mmol）的乙醇（20 ml）溶液中加入氯化铵（80.0 mg，1.5 mmol）作为催化剂。将反应混合物在0℃下搅拌过夜。采用薄层色谱法监测反应过程。反应充分后，用水淬灭，用乙酸乙酯（3
×
20 ml）和饱和盐水（3
×
20 ml）萃取。接下来，有机层合并，在硫酸镁上干燥。采用石油醚：乙酸乙酯（10：1-15：1）硅胶柱色谱法，得到了油状化合物2（0.73g，70%）。
22.中间体3a-3b制备方法在化合物2（1.0g，4.8mmol）和（r1取代的）苯乙酮（2.4 mmol）的甲醇（15 ml）溶液中加入10%氢氧化钾（调整为ph 8-9）溶液作为催化剂。在室温下进行反应，用薄层色谱点板监测反应过程。反应完成后，用水淬火。有机相用乙酸乙酯（3
×
20 ml）萃取，用饱和盐水（3
×
20 ml）洗涤。用石油醚：乙酸乙酯（15：1-25：1）的硅胶柱色谱法，得到油性化合物3a-3b。
23.中间化合物4a-4b制备方法将中间体3a-3b（2.0 mmol）溶解在二氯甲烷（10 ml）中，加入三氟乙酸（tfa）将ph调整至2-3进行反应。采用薄层色谱法监测反应过程。在反应完成后，用饱和的碳酸钠水溶液将ph调整为7。有机层用乙酸乙酯（3
×
20 ml）萃取，用饱和盐水（3
×
20 ml）洗涤。接下来，有机层合并，在硫酸镁上干燥。粗产品直接用于下一步，未经额外纯化。
24.最终产物制备方法(n1-n10, j1-j17)将r2取代的苯乙酮（20 mmol）溶于甲醇（10 ml）中，加入10%氢氧化钾水溶液，调节溶液的ph值至10。在室温下活化10分钟后，加入化合物4a-4b（2.0mmol）的甲醇（10 ml）溶液进行反应。采用薄层色谱法监测反应过程，并在反应完成后加入冰醋酸将ph调整为7。有机层用乙酸乙酯（3
×
20 ml）萃取，用饱和盐水（3
×
20 ml）洗涤。石油醚：二氯甲烷（1：1—2：1）硅胶柱色谱或重结晶得到目标化合物n1-n10和j1-j17。
25.通过以上过程，本实施例成功合成了表1、表2中的多种化合物，并用质子核磁共振（1hnmr）、（
13
cnmr）和电喷雾电离质谱（esi-ms）对不对称双查尔酮化合物的结构进行了彻底的表征。
(s, 1c), 131.40 (s, 1c), 130.39 (s, 1c), 130.06 (s, 1c), 129.48(s, 1c), 129.10 (s, 5c), 128.11 (s, 1c), 127.79 (s, 1c), 127.43 (s, 1c), 126.97 (s, 1c), 126.82 (s, 1c), 126.77 (s, 1c). ei-ms m/z: 442.1[m+2]+, calcd for c25h16clf3o2: 440.9.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-(2-methoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j2).light yellow powder（浅黄色粉末）, 35% yield, mp120.3-122.1
°
c. 1h nmr (500 mhz, dmso-d6): δ 7.819 (dd, j = 18.5, 7.0 hz, 4h), 7.60 (d, j = 12.6 hz, 4h), 7.54 (s, 4h), 7.41 (t, j = 16.6 hz, 2h), 7.201 (d, j = 4.0 hz, 1h), 7.065(t, j = 7.0 hz, 1h), 3.868 (s, 3h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.55 (s, 1c), 192.49 (s, 1c), 158.27 (s, 1c), 144.90 (s, 1c), 141.56 (s, 1c), 139.01 (s, 1c), 137.61 (s, 1c), 136.09 (s, 1c), 133.24(s, 1c), 131.62 (s, 1c), 131.37 (s, 1c), 130.52 (s, 1c), 130.38 (s, 1c), 129.47 (s, 1c), 129.08 (s, 3c), 128.93 (s, 2c), 128.26 (s, 1c), 126.97 (s, 2c), 120.87(s, 1c), 111.71 (s, 1c), 55.82 (s, 1c). ei-ms m/z: 425.2[m+na]+, calcd forc25h19clo3: 402.8.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-oxo-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j3).light yellow powder（浅黄色粉末）, 95% yield, mp 163.2-164.7
°
c. 1h nmr (400 mhz, dmso-d6): δ 8.052 (d, j = 12.4 hz, 1h), 7.994 (d, j = 6.0 hz, 2h),7.885 (d, j = 6.0 hz, 2h), 7.774 (d, j = 12.4 hz, 1h), 7.624-7.566 (m, 3h), 7.515 (t, j = 4.0 hz, 1h), 7.461 (s, 3h), 7.418 (s, 1h), 3.926 (s, 6h), 3.792(s, 3h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.47 (s, 1c), 188.86 (s, 1c), 153.23 (s, 2c), 144.67 (s, 1c), 143.35 (s, 1c),142.74 (s, 1c), 138.96 (s, 1c), 137.22 (s, 1c), 136.42 (s, 1c), 133.30 (s, 1c), 131.67 (s, 1c), 131.37 (s, 1c), 130.39 (s, 1c), 129.49 (s, 2c), 129.13 (s, 2c),129.01 (s, 1c), 127.15 (s, 1c), 126.98 (s, 1c), 122.90 (s, 1c), 106.19 (s, 2c), 61.04 (s, 1c), 56.46 (s, 2c). ei-ms m/z: 463.1[m+1]+, calcd for c27h23clo5: 462.9.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-(3-methoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j4).red powder（红色粉末）, 49% yield, mp 134.2-136.7
°
c. 1h nmr (400 mhz, dmso-d6): δ 8.042-7.973 (m, 3h), 7.876 (d, j = 6.4 hz, 2h),7.808-7.749 (m, 2h), 7.639-7.579 (m, 4h), 7.521-7.505 (m, 2h), 7.505-7.415（m, 2h）, 7.257 (d, j = 6.4 hz, 1h), 3.863 (s, 3h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.56 (s, 1c), 192.50 (s, 1c), 158.27 (s, 1c), 144.90(s, 1c), 141.56 (s, 1c), 139.01 (s, 1c), 137.62 (s, 1c), 136.09 (s, 1c), 133.23 (s, 1c), 131.62 (s, 1c), 131.38 (s, 1c), 130.52 (s, 1c), 130.38 (s, 1c), 129.47(s, 1c), 129.08 (s, 3c), 128.93 (s, 2c), 128.26 (s, 1c), 126.97 (s, 2c), 120.87 (s, 1c), 111.70 (s, 1c), 55.82 (s, 1c). ei-ms m/z: 403.1[m+1]+, calcd for c25h19clo3: 402.8.
6.4 hz, 7h), 7.741 (d, j = 6.4 hz, 6h), 7.624-7.582 (m, 1h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 194.36 (s, 1c),193.47 (s, 1c), 144.92 (s, 1c), 144.56 (s, 1c), 140.97 (s, 1c), 138.93 (s, 1c), 136.76 (s, 1c), 136.70 (s, 1c), 133.53 (s, 1c), 131.69 (s, 1c), 131.64 (s, 1c),131.38 (s, 1c), 130.39 (s, 1c), 129.49 (s, 1c), 129.30 (s, 1c), 129.13 (s, 4c), 127.49 (s, 1c), 127.33 (s, 1c), 127.16 (s, 1c), 126.98 (s, 1c), 119.56 (s, 1c).ei-ms m/z: 452.3[m+1]+, calcd for c24h16brclo2: 451.7.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j9).red powder（红色粉末）, 67% yield, mp 174.5-177.3
°
c. 1h nmr (500 mhz, dmso-d6): δ 7.98 (s, 1h), 7.84 (dd, j = 21.3, 8.2 hz, 4h), 7.66
ꢀ–ꢀ
7.59 (m, 5h), 7.53 (dd, j = 15.2, 8.3 hz, 2h), 7.46 (s,1h), 6.72 (s, 1h), 6.67 (d, j = 10.2 hz, 1h), 3.93 (s, 3h), 3.88 (s, 3h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.60 (s, 1c),190.00 (s, 1c), 164.47 (s, 1c), 160.58 (s, 1c), 145.05 (s, 1c), 140.45 (s, 1c), 139.04 (s, 1c), 138.02 (s, 1c), 135.81 (s, 1c), 133.08 (s, 1c), 131.59 (s, 1c),131.37 (s, 1c), 130.37 (s, 1c), 129.46 (s, 1c), 129.07 (s, 2c), 128.82 (s, 2c), 128.50 (s, 1c), 126.95 (s, 1c), 126.82 (s, 1c), 122.01 (s, 1c), 105.39 (s, 1c),98.66 (s, 1c), 55.82 (s, 1c), 55.62 (s, 1c). ei-ms m/z: 433.1[m+1]+, calcd forc26h21clo4: 432.9.(2e, 2'e)-3, 3'-(1, 4-phenylene) bis (1-(2-chlorophenyl)prop-2-en-1-one)(j10).white powder（白色粉末）, 89% yield, mp 151.3-152.6
°
c. 1h nmr (400 mhz, dmso-d6): δ 7.847 (s, 4h), 7.616-7.557 (m, 6h), 7.494 (q, j = 6.4hz, 3h), 7.441 (s, 1h), 7.404 (s, 1h), 7.372 (s, 1h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.44 (s, 2c), 144.57 (s, 2c), 138.94 (s, 2c), 136.73 (s, 2c), 131.68 (s, 2c), 131.38 (s, 2c), 130.39 (s, 2c), 129.49 (s, 2c), 129.13(s, 4c), 127.31 (s, 2c), 126.98 (s, 2c). ei-ms m/z: 409.0[m+2]+, calcd forc24h16cl2o2: 407.3.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-(2,5-dimethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j11).white powder（白色粉末）, 56% yield, mp 129.3-131.3
°
c. 1h nmr (400 mhz, dmso-d6): δ 7.845 (dd, j = 8.4, 7.2 hz, 4h), 7.622 (t, j = 7.6 hz,3h), 7.599-7.547 (m, 4h), 7.439 (d, j = 20.4 hz, 1h), 7.168 (s, 2h), 7.089 (s, 1h), 3.851 (s, 3h), 3.780 (s, 3h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 192.45 (s, 1c), 192.06 (s, 1c), 153.73 (s, 1c), 152.74(s, 1c), 143.28 (s, 1c), 141.92 (s, 1c), 137.00 (s, 1c), 132.88 (s, 1c), 129.54 (s, 1c), 128.89 (s, 4c), 128.53 (s, 1c), 128.19 (s, 1c), 127.77 (s, 1c), 126.28 (s, 1c), 120.86 (s, 1c), 119.49 (s, 1c), 118.95 (s, 1c), 114.50 (s, 1c), 113.83(s, 1c), 113.48 (s, 1c), 112.61 (s, 1c), 56.56 (s, 1c), 55.90 (s, 1c). ei-ms m/z: 433.1[m+1]+, calcd for c26h21clo4: 432.9.
(d, j = 8.8 hz,2h).3.070 (m, 6h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.60 (s, 1c), 187.34 (s, 1c), 153.57 (s, 1c), 145.07 (s, 1c), 141.14 (s, 1c),139.08 (s, 1c), 138.02 (s, 1c), 135.80 (s, 1c), 131.55 (s, 1c), 131.39 (s, 1c), 130.93 (s, 2c), 130.37 (s, 1c), 129.45 (s, 1c), 129.07 (s, 2c), 128.75 (s, 2c),126.93 (s, 1c), 126.86 (s, 1c), 125.86 (s, 1c), 123.58 (s, 1c), 110.90 (s, 2c), 40.07 (s, 2c). ei-ms m/z: 416.9[m+1]+, calcd for c26h22clno2: 415.9.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-(4-ethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j16).light yellow powder（浅黄色粉末）, 71% yield, mp 125.4-126.7
°
c. 1h nmr (500 mhz, dmso-d6): δ 8.175 (d, j = 6.0 hz, 2h), 8.308 (dd, j = 15.5, 2.5 hz,1h), 7.949 (d, j = 6.0 hz, 2h), 7.858 (d, j = 6 hz, 2h), 7.711 (d, j = 15.5 hz, 1h), 7.609-7.554 (m, 3h), 7.514-7.364 (m, 3h), 7.064 (d, j = 6.0 hz, 2h), 4.139(q, j = 7.0 hz, 2h), 1.354 (t, j = 7.0 hz, 3h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.56 (s, 1c), 188.34 (s, 1c), 163.07 (s, 1c), 144.87 (s, 1c), 142.58 (s, 1c), 142.49 (s, 1c), 139.01 (s, 1c), 137.50 (s, 1c), 136.18(s, 1c), 131.62 (s, 1c), 130.91 (s, 2c), 130.39 (s, 1c), 129.47 (s, 1c), 129.12 (s, 2c), 128.91 (s, 2c), 127.04 (s, 1c), 126.96 (s, 1c), 123.12 (s, 1c), 123.10(s, 1c), 114.39 (s, 1c), 113.96 (s, 1c), 63.86 (s, 1c), 14.73 (s, 1c). ei-ms m/z: 419.2[m+1]+, calcd for c26h21clo3: 417.9.(e)-1-(2-chlorophenyl)-3-(4-((e)-3-(4-nitrophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)prop-2-en-1-one(j17).yellow powder（黄色粉末）, 22% yield, mp 177.8-179.0
°
c. 1h nmr (400 mhz, dmso-d6): δ 8.409 (s, 4h), 7.965 (qd, j = 34.0, 16.0 hz, 6h),7.618(t, j = 8.0 hz, 3h), 7.543-7.504 (m, 1h), 7.454 (d, j = 6.4 hz, 2h). 13c nmr (101 mhz, cdcl3) δ 193.42 (s, 1c),188.74 (s, 1c), 150.21 (s, 1c), 145.40 (s, 1c), 144.34 (s, 1c), 142.82 (s, 1c), 138.93 (s, 1c), 137.12 (s, 1c), 136.49 (s, 1c), 131.74 (s, 1c), 131.41 (s, 1c),130.42 (s, 1c), 129.52 (s, 1c), 129.48 (s, 2c), 129.26 (s, 2c), 129.22 (s, 2c), 127.52 (s, 1c), 127.01 (s, 1c), 123.97 (s, 2c), 122.32 (s, 1c). ei-ms m/z:418.1[m+1]+, calcd for c24h16clno4: 417.8.迄今为止，在双醛两侧具有不同苯环取代基的不对称化合物尚未见报道，在本发明实施例1中，我们在已知的单侧醛基保护方法的基础上进行了进一步的探索，利用原甲酸三乙酯保护对称二醛，通过四步反应成功合成了不对称双查尔酮化合物，该策略为这类化合物的合成提供了参考。
[0029]
实施例2.化合物体外生长抑制活性的评价：选择gc细胞系bgc-823、sgc-7901和ags，采用mtt法评价合成化合物的体外抗肿瘤活性。人胃癌细胞sgc-7901、bgc-823和ags均购自中国型培养馆藏（武汉大学）。所有细胞在含有100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素和10%胎牛血清（gibco，美国）的rpmi-1640培养基（gibco，美国）中培养，并在37℃、5%二氧化碳气氛下培养。取处于对数生长期的细胞进行下
一次实验。
[0030]
将sgc-7901、bgc-823和ags细胞以3
×
103细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24h。将肿瘤细胞与合成的化合物孵育72h。处理后，每孔加入浓度为5mg/ml（中国茄属）的mtt溶液，在培养箱中继续培养4h。然后用mtt液移液管，每孔加入150μldmso，摇10min，用酶标仪（spectramaxm2/m2e，分子器件，三星，加州，美国）(a).在490nm波长下测量每孔的吸光度通过与对照组的比较，计算生长抑制率。抑制率（%）=[(1-a实验组/a对照组）
×
100%]。每个化合物的半抑制浓度值由graphpad8.0（sandiego，ca）计算。
[0031]
如表1所示，在所有合成的化合物中，并非所有的不对称双查尔酮化合物均具有抗肿瘤活性，其中，仅化合物n2、n3、n4、n8、n9具有较好的抗肿瘤活性，进一步的可以发现，在苯环上2位含有卤素取代的化合物（n2、n3、n4）呈现更好的抗肿瘤活性。
[0032]
我们进一步选择了含2位氯原子取代基的化合物进行抗肿瘤活性实验。如表2所示，所有含有氯原子的化合物对三种肿瘤细胞系均表现出较好的抗肿瘤活性。可以发现，具有较强供电子基团的化合物j3的活性优于n3。bgc-823、sgc-7901和ags细胞中j3的半抑制浓度值分别为0.9
±
0.1、0.9
±
0.0和0.7
±
0.1μm。有意思的是，当硝基附着在“b环”（j17）上时，其生物活性显著降低。此外，不同电子供体基团内和不同受体基团内的活性也存在差异。综上所述，我们选择了化合物j3作为最佳化合物，并进一步研究了其生物活性。
[0033]
实施例3.构效关系的定量评价定量构效关系（qsar）研究在药物开发中应用广泛，是指导药物设计的主要工具之一。近年来，基于机器学习的qsar建模得到了广泛的应用，而随机森林（rf）是建立qsar模型的较好的算法之一。rf是一种基于集成学习思想的集成多个决策树的算法。通过对总数据集进行采样，生成多个不同的子数据集，为每个子数据集训练一个决策树，然后将所有决策树集成到一个森林中，以预测最终结果。为了进一步证明这些化合物在抑制活性中的构效关系，我们采用rf算法构建了一个回归qsar模型。如图3所示，使用高平方回归系数和合适的射频获得了一个优秀的qsar模型（bgc-823细胞r2=0.851627，scg-7901细胞r2=0.830995，agc细胞r2=0.843420），该模型作为一定的指令函数供后续研究。
[0034]
实施例4.j3的抗胃癌活性测试4.1j3抑制gc细胞集落的形成我们使用bgc-823和sgc-7901细胞进一步测定了其对集落形成的抑制作用。具体操作方法为：将sgc-7901和bgc-823细胞接种于6孔板（每孔3
×
103细胞），与一定浓度的j3和dmso在37℃和5%二氧化碳培养箱中孵育。细胞培养14天，然后用4%多聚甲醛固定15min，然后在室温下用1%结晶紫染色15min。
[0035]
结果表明，j3以浓度依赖性的方式抑制了两种gc细胞系中菌落的形成，且在浓度为2.5μm时表现出极显著的活性（图4）。综上所述，j3对gc细胞的生长具有良好的抑制作用。
[0036]
诱导gc细胞凋亡细胞凋亡是一个由基因控制的程序性死亡过程。研究表明，细胞凋亡与肿瘤的发生和肿瘤发展有关。细胞凋亡的失调是癌症的一个标志，而细胞凋亡的破坏可以使癌细胞无限期地生长，因此，促进细胞凋亡可以达到抗肿瘤作用。
[0037]
具体操作为：将bgc-823细胞以每孔3x105个细胞的密度接种于6孔板中，用不同浓度的j3处理细胞24h。治疗后，使用凋亡检测试剂盒（bd，usa），用fitc-annexinv（早期凋
亡）和pi（晚期凋亡）双染色检测细胞凋亡。最后，收集细胞，用流式细胞术（facs calibur，bd，usa）分析样本。采用flowjo软件进行细胞凋亡的定量分析。细胞凋亡率=晚期凋亡率+早期凋亡率。
[0038]
蛋白印迹法处理：用含有1%磷酸酶抑制剂（p1260，solarbio，北京）的ripa缓冲液（boster，中国）裂解细胞。所有样品的蛋白浓度均采用布拉德福德蛋白检测试剂盒（bio-rad，harkles，ca）进行测定。裂解物经sds-page电泳分离，然后转移到pvdf膜上（密尔孔，比勒里卡，ma，usa）。用5%脱脂牛奶在室温下封闭细胞膜1.5 h，用tbst洗脱，并与一抗在4℃下孵育过夜。用tbst洗涤三次后，膜与过氧化物酶（hrp）偶联的二抗在室温下孵育1.5小时，用tbst洗脱3次，并暴露在暴露装置中。检测使用ecl试剂盒（bio-rad，harkles，ca），并使用image实验室软件（nih，bethesda，md，usa）分析条带。使用以下一抗：兔抗gapdh（1：10000,20536-1-ap，蛋白质公司，中国），兔抗切割-parp（1：1000，5625s，细胞信号技术，美国）。使用以下二抗：hrp偶联的亲和纯山羊抗兔igg（h+l）抗体(1：5000，sa00001-2，蛋白清，中国）。
[0039]
本实验采用流式细胞术和蛋白印迹法分析了化合物对gc细胞凋亡及促凋亡蛋白表达的影响。如图4所示，j3诱导bgc-823细胞凋亡，且呈浓度依赖性。当j3浓度为5μm时，bgc-823细胞的凋亡率超过50%（图5a、c）。由此可见，j3对gc细胞具有良好的促凋亡作用。然后评估该化合物对凋亡相关蛋白parp表达的影响。j3浓度依赖性地增强了bgc-823细胞中parp的表达（图5b，d）。综上所述，j3显著促进gc细胞凋亡。
[0040]
的体内抗肿瘤活性构建bgc-823裸鼠皮下移植肿瘤模型，研究j3在体内的抗肿瘤活性。
[0041]
姜黄素是一种与双查酮结构骨架相似且具有广泛的抗肿瘤活性的天然产物，因此选择其作为阳性对照，姜黄素（10 mg/kg）和j3（10 mg/kg），每日1次，连续14天，每天追踪裸鼠肿瘤体积和体重的变化。
[0042]
对于bgc-823异种移植瘤模型，将小鼠置于特定的无病原体（spf）条件下，温度18-23℃，湿度50-60%。将处于对数生长期的bgc-823细胞重悬在无血清的1640培养基中，并调整其密度至1.5
×
10^7 cells/ml。然后在每只裸鼠的右腋窝注射0.2 ml的细胞悬液。
[0043]
具体操作为：当平均肿瘤大小达50 mm3时，裸鼠随机分为3组，用j3（10 mg/kg i.p.）治疗，或姜黄素（10 mg/kg i.p.）治疗，每天一次。每天测量肿瘤大小，并根据公式计算：肿瘤大小=长度
×
宽度2/2。治疗14天后，小鼠被颈椎脱位安乐死。取肿瘤和重要器官，用液氮速冻或4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋、切片和he染色。所有实验程序均经温州医科大学伦理委员会批准进行。
[0044]
结果表明，与载体相比，j3能明显抑制肿瘤生长（p《0.01），其肿瘤抑制效果优于姜黄素（p《0.01，图6a-c）。重要的是，在治疗剂量下，j3对裸鼠的体重没有影响（图6d），器官系数（器官重量/体重
×
100%）表明，j3对裸鼠的主要器官没有明显的毒性（图6e）。综上所述，j3在体内具有良好的抑制肿瘤生长的能力和良好的安全性。上述实验所有结果均以平均
±
标准差（sd）表示。所有实验至少重复3次。我们使用graphpad 8.0（graphpad，圣地亚哥，加州，美国）的t检验来比较统计数据。p值小于0.05时考虑差异有统计学意义（p《0.05）。
[0045]
上述实验表明，本发明提供的新型不对称双查尔酮化合物，大部分能够强烈抑制gc细胞的生长。采用rf方法建立了该化合物对三种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性的qsar模型，
模型具有较好的拟合和性能，回归系数均超过0.8。最佳化合物j3在bgc-823、sgc-7901和ags细胞中的半抑制浓度值分别为0.9
±
0.1、0.9
±
0.0和0.7
±
0.1μm。实验证实，化合物j3以浓度依赖性的方式抑制gc细胞的集落形成，并诱导凋亡蛋白切割parp的表达，同时促进gc细胞的凋亡。裸鼠皮下肿瘤转移实验表明，化合物j3剂量为10 mg/kg可抑制约70%的肿瘤生长，显著抑制gc细胞的肿瘤发生。此外，在给药剂量范围内没有观察到明显的毒性和副作用。综上所述，本发明设计并合成了新型不对称双查尔酮化合物，部分化合物体外抗胃癌活性良好，例如n2、n3、n4、n8、n9、j1-j16，其中，最佳活性化合物j3具有十分显著的体内外抗胃癌活性，有望作为一种具有抗肿瘤活性的新型候选药物进一步研究。
[0046]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

技术特征：
och3，所述抗肿瘤产品为用于治疗胃癌的药物组合物。10.如权利要求7-9任一项所述的用于抗肿瘤的产品，其特征在于：所述抗肿瘤产品为用于治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物的制剂形式选自注射剂、片剂、栓剂、膜剂、胶囊剂、软膏剂、气雾剂、滴丸剂、控释或缓释剂和纳米制剂的一种。

技术总结
本发明提供一种新型不对称双查尔酮化合物、合成方法及其应用，本发明成功合成了一系列新型的不对称双查尔酮化合物，并且提供了具体的合成方法，这些新型的不对称双查尔酮化合物表现出良好的抗肿瘤活性。物表现出良好的抗肿瘤活性。物表现出良好的抗肿瘤活性。


技术研发人员：吴建章 粘春惠 刘群鹏 甘欣 董昭俊 李校堃 何文斐
受保护的技术使用者：瓯江实验室 温州医科大学
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/7/22