一种用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物及其应用

1.本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物及其应用。


背景技术：

2.儿童性早熟是一种青春发育异常类疾病，是指男生在9岁前，女孩在8岁前出现第二性征发育，表现为骨骺关闭，月经早现，成年后身高低于正常人群，同时因患儿性征过早发育而智力和性心理尚不成熟，引发心理生理障碍，给家庭及社会带来严重的负面影响。因此，需要对儿童性早熟进行早期诊断或预防，来降低其临床发病率。
3.目前，临床上主要依据患者第二性征提前出现、影像学检查以及血清中性激素(如促卵泡生成素、促黄体生成素、泌乳素、雌二醇、睾酮及孕酮)分子诊断标志物等多种指标结合诊断，但是上述指标均是在儿童性早熟发生之后才开始出现，无法作为早期发病风险因子的筛选标志物。现有技术还可以采用手腕骨骨龄指数诊断儿童性早熟，但是骨龄指数可以有效诊断特发性中枢性性早熟，但对外周性性早熟诊断意义不大，因此该方法仅能覆盖较小一部分患者人群，难以用作发病风险因子的筛选。女孩雌激素受体基因位点多样性也与性早熟有关，突变基因增加了女孩性早熟的风险，但雌激素受体基因多态性并不是特异性导致儿童性早熟的原因，还会受到其他疾病因素的影响，因此筛查结果不完全准确。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物及其应用。本发明中，将环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞六种内分泌干扰物中的一种或多种组合作为筛查儿童性早熟风险的标志物，采用高效液相色谱串联质谱检测技术检测上述内分泌干扰物，并将其制备成试剂盒，用于儿童性早熟风险分析；所述试剂盒中加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶和儿茶素来提高试剂盒的灵敏度和准确性，调控质谱检测条件来降低试剂盒的检测限，进而能够及早的筛查儿童性早熟风险。
5.本发明中首先提供了一种用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物，包括：环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞中的一种或多种组合。
6.其中，所述儿童性早熟为由环境中的化学毒素引起的。
7.本发明中还提供了上述内分泌干扰物在制备筛查早期儿童性早熟的试剂或试剂盒中的应用，所述儿童性早熟为由环境中的化学毒素引起的。
8.本发明中还提供了一种用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒，包括：尿液样本前处理试剂组合、洗脱液、混合标准品工作液、稀释液、淋洗液/活化液、洗脱液/活化液、复溶液；所述尿液样本前处理试剂组合包括乙酸-乙酸钠缓冲液，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，儿茶素。
9.其中，所述乙酸-乙酸钠缓冲液，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，儿茶素的用量比为2ml:10μl:5mg；所述乙酸-乙酸钠缓冲液为0.2m乙酸水溶液和0.2m乙酸钠水溶液以1:6的
体积比混合而成。
10.其中，所述混合标准品工作液为含内分泌干扰物的乙腈溶液，所述内分泌干扰物为环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、镉和汞浓度均为1μg/ml，苯并芘浓度为1ng/ml；
11.所述稀释液为含2g/ml尿素和1g/ml氯化钠的水溶液；
12.所述淋洗液/活化液为水；
13.所述洗脱液/活化液为乙腈；
14.所述复溶液为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈水溶液，乙腈和水的体积比是1:9。
15.本发明中还提供了上述试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：
16.(1)收集正常儿童及性早熟儿童尿液样本，使用尿液样本前处理试剂组合进行尿液样本的处理；
17.(2)使用试剂盒中的混合标准品工作液，制备浓度梯度的混合标准品溶液；
18.(3)将准备好的待测样品和标准品溶液进行lc-ms/ms质谱进样上机检测；
19.(4)根据检测结果，绘制混合标准品溶液的标准曲线，对儿童性早熟发病风险进行筛查。
20.其中，所述环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘的采用液相色谱串联质谱联用仪检测，质谱条件为：
[0021][0022]
所述mrm参数为：
[0023]
[0024][0025]
所述镉和汞采用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)分析，质谱条件为：
[0026]
高频功率：1.2kw
[0027]
辅助气流速：1.1l/min
[0028]
采样深度：5.0mm
[0029]
等离子体气流速：8.0l/min
[0030]
载气流速：0.7l/min
[0031]
雾室温度：5℃
[0032]
高频频率：27.12mhz
[0033]
碰撞气种类：he
[0034]
池电压：-21v
[0035]
碰撞气流速：6.0ml/min
[0036]
能量过滤器电压：5.0v。
[0037]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0038]
本发明中，基于儿童性早熟的发病原因中环境中化学毒素占比较高的现状，将环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、双酚a、镉和汞六种内分泌干扰物中的一种或多种组合作为筛查由环境中的化学毒素引起得儿童性早熟风险的标志物，并将其制备成筛查早期儿童性早熟的试剂盒。本发明从病因学角度出发，在疾病发病之前就针对导致疾病的发病因素进行监测的标志物和诊断试剂盒，对早期筛查儿童性早熟风险具有重要临床价值。
[0039]
本发明中，提供一种能够在儿童性早熟的超早期中筛查儿童性早熟的试剂盒，所述试剂盒基于环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、双酚a、镉和汞六种内分泌干扰物中的一种或多种组合制备得到，该试剂盒具有样本获取简单，检出限低，重复性好，筛查灵敏度和特异性高等优点，克服了目前儿童性早熟临床筛查的片面性和滞后性、检测方法复杂以及样本获取难度大等局限。
[0040]
本发明中通过在尿液样本前处理试剂组合中加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶和儿茶素来提高试剂盒的灵敏度和准确性，调控质谱检测条件来降低试剂盒的检测限，进而能够及早的筛查儿童性早熟风险。
附图说明
[0041]
图1为环唑醇的标准曲线图。
[0042]
图2为乐果的标准曲线图。
[0043]
图3为氯苯嘧啶醇的标准曲线图。
[0044]
图4为苯并芘的标准曲线图。
[0045]
图5为镉的标准曲线图。
[0046]
图6为汞的标准曲线图。
[0047]
图7为环唑醇(a)、乐果(b)、氯苯嘧啶醇(c)、苯并芘(d)、镉(e)和汞(f)在正常对照组及儿童性早熟组尿液样本的检测结果。
[0048]
图8为性早熟的发病情况与环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞的spearman秩相关分析。
具体实施方式
[0049]
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0050]
实施例1：用于筛查儿童性早熟的试剂盒的制备
[0051]
筛查儿童性早熟的试剂盒的组分及制备：
[0052]
尿液样本前处理试剂组合：乙酸-乙酸钠缓冲液，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，儿茶素；其中，乙酸-乙酸钠缓冲液为0.2m乙酸水溶液和0.2m乙酸钠水溶液以1:6的体积比混合而成。
[0053]
混合标准品工作液：以乙腈为溶剂，溶质环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、镉和汞的浓度均为1μg/ml，苯并芘的浓度为1ng/ml。具体制备方法为：环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、镉、汞各10mg和苯并芘10ng用乙腈定容至5ml，分别得到6种标准品溶液，各取10μl混合，然后用乙腈稀释至相应浓度的混合标准品工作液。
[0054]
洗脱液：a相：0.1％甲酸的水溶液，b相：0.1％甲酸的乙腈溶液
[0055]
稀释液：尿液基质稀释液，具体含2g/ml尿素和1g/ml氯化钠的水溶液；
[0056]
淋洗液/活化液：水；
[0057]
洗脱液/活化液：乙腈；
[0058]
复溶液：含0.1％(v/v)甲酸的乙腈水溶液，乙腈和水的体积比是1:9。
[0059]
实施例2：儿童性早熟的试剂盒筛查的方法
[0060]
(1)待测溶液的处理：
[0061]
取尿样2ml先用0.22μm滤膜过滤，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，调节ph值至5.4，然后加入10μlβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，用以特异性地降解尿样中被葡萄糖醛酸化或磺基化的待测物质，接着加入5mg儿茶素，在室温下孵育过夜。酶解后的样品，用spe小柱(c18envi，0.25g)进行固相萃取，并将萃取物用2ml乙腈洗脱，氮气吹干，用100μl 0.1％甲酸的乙腈水溶液重溶，得到待测溶液。
[0062]
(2)标准曲线的绘制：
[0063]
从混合标准品工作液中分别移取适量标液，根据不同的检测指标，用尿液基质稀释液稀释成100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml(环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、镉和汞)；100pg/ml、50pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、5pg/ml、1pg/ml、0.5pg/ml(苯并芘)，然后在下列所述的色谱条件和质谱条件下进行检测，待标准曲线绘制完，可以利
用标准曲线对实际样品进行定量。
[0064]
环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇和苯并芘的分析，采用液相色谱串联质谱联用仪(lc-ms/ms)
[0065]
所述色谱条件为：
[0066]
流动相：a相：0.1％甲酸的水溶液，b相：0.1％甲酸的乙腈溶液；
[0067]
色谱柱：acquity uplc beh c18色谱柱；
[0068]
洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序表如表1所示。
[0069]
表1.梯度洗脱程序表
[0070]
time(min)a相(％)b相(％)1955659575957.1653510stop [0071]
所述质谱条件为：
[0072][0073][0074]
扫描模式：mrm(mrm参数如表2所示)。
[0075]
表2.mrm参数
[0076]
[0077]
2镉和汞的分析，采用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)
[0078]
所述质谱条件为：
[0079]
高频功率：1.2kw
[0080]
辅助气流速：1.1l/min
[0081]
采样深度：5.0mm
[0082]
等离子体气流速：8.0l/min
[0083]
载气流速：0.7l/min
[0084]
雾室温度：5℃
[0085]
高频频率：27.12mhz
[0086]
碰撞气种类：he
[0087]
池电压：-21v
[0088]
碰撞气流速：6.0ml/min
[0089]
能量过滤器电压：5.0v
[0090]
表2中，前体离子是内分泌干扰物在一级质谱(ms)模式下，所产生的特征性离子，也叫母离子；产物离子是内分泌干扰物产生的母离子在二级(ms/ms)质谱模式下，经惰性气体(如氩气)碰撞后，所产生的特征性碎片离子，也叫子离子。
[0091]
根据上述检测结果绘制标准曲线，图1为环唑醇的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为y＝12103x+2588.1，r＝0.9992，检测限0.1ng/ml。
[0092]
图2为乐果的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为y＝58108x+4238.3，r＝0.9999，检测限0.1ng/ml。
[0093]
图3为氯苯嘧啶醇的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为y＝248x-49.4，r＝0.9997，检测限0.1ng/ml。
[0094]
图4为苯并芘的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为y＝236.11x+11.74，r＝0.9990，检测限0.1pg/ml。
[0095]
图5为镉的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为y＝1.9852x-0.2491，r＝0.9999，检测限0.1ng/ml。
[0096]
图6为汞的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为y＝0.6574x-0.1823，r＝0.9996，检测限0.1ng/ml。
[0097]
本实施例中还以三甲基硅烷化衍生结合gc-ms法为对照组、本发明中的检测方法为实验组分别检测理论浓度为100ng/ml的环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇和100pg/ml的苯并芘；以电感耦合等离子体发射光谱(icp-oes)法为对照组、本发明中的检测方法为实验组分别检测理论浓度为100ng/ml的镉和汞，来分别比较环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞的检测回收率，比较结果如表3所示。
[0098]
表3.不同检测方法下环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞的回收率
[0099] 对照组实验组环唑醇的浓度(ng/ml)84.85103.93环唑醇的回收率(％)85104乐果的浓度(ng/ml)91.28104.48乐果的回收率(％)91105
氯苯嘧啶醇的浓度(ng/ml)117.92107.90氯苯嘧啶醇的回收率(％)118108苯并芘的浓度(pg/ml)82.3291.38苯并芘的回收率(％)8291镉的浓度(ng/ml)114.49106.93镉的回收率(％)115107汞的浓度(ng/ml)86.9991.49汞的回收率(％)8792
[0100]
其中，回收率为实测浓度的平均值与理论浓度的比值，从上表中可以看出，相对于现有技术中的三甲基硅烷化衍生结合gc-ms法为对照组或icp-oes法分别检测环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞，本发明中的检测方法准确度更高。
[0101]
实施例3：检测结果对儿童性早熟发病风险的筛查作用的验证
[0102]
为验证上述检测方法以及6种化学毒素在体内的水平是否可以用于儿童性早熟的早期风险筛查，本实施例中收集了17例正常儿童的尿液样本(10ml)和20例儿童性早熟的尿液样本(10ml)，对样本进行了尿液前处理，然后质谱上机检测和数据分析，待测样品的处理方法和检测条件与实施例2中完全相同。
[0103]
本实施例中数据处理方法：通过计算spearman秩相关分析观察儿童性早熟发病概况与八项指标之间的相关性。利用graphpad绘制热力图，所有统计分析都是在spss(ibm，v26)软件的统计计算环境下完成的。
[0104]
图7为环唑醇(a)、乐果(b)、氯苯嘧啶醇(c)、苯并芘(d)、镉(e)和汞(f)在正常对照组及儿童性早熟组尿液样本的检测结果，对检测结果进行分析发现，儿童性早熟孕妇尿液中环唑醇的含量高于正常儿童6.82倍(p《0.001)，乐果的含量高于正常儿童6.81倍(p《0.001)，氯苯嘧啶醇的含量高于正常儿童7.06倍(p《0.001)，苯并芘的含量高于正常儿童2.88倍(p《0.001)，镉的含量高于正常儿童2.86倍(p《0.001)，汞的含量高于正常儿童1.78倍(p《0.001)。
[0105]
图8为性早熟的发病情况与环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞相关性，对检测结果进行spearman秩相关分析，结果显示，尿液中环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞与儿童性早熟的发病呈正相关，相关系数分别为：0.86、0.86、0.86、0.83、0.83和0.70，具有统计学意义(见图8)。上述结果整体说明了环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞这六种内分泌干扰物在正常儿童和性早熟儿童的尿液中的残留情况，并能够作为儿童性早熟风险的筛查指标。
[0106]
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物，其特征在于，包括：环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞中的一种或多种组合。2.根据权利要求1所述的用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物，其特征在于，所述儿童性早熟为由环境中的化学毒素引起的。3.权利要求1所述的内分泌干扰物在制备筛查早期儿童性早熟的试剂或试剂盒中的应用。4.一种用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒，其特征在于，包括：尿液样本前处理试剂组合、洗脱液、混合标准品工作液、稀释液、淋洗液/活化液、洗脱液/活化液、复溶液；所述尿液样本前处理试剂组合包括乙酸-乙酸钠缓冲液，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，儿茶素。5.根据权利要求4所述的用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒，其特征在于，所述乙酸-乙酸钠缓冲液，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，儿茶素的用量比为2ml:10μl:5mg；所述乙酸-乙酸钠缓冲液为0.2m乙酸水溶液和0.2m乙酸钠水溶液以1:6的体积比混合而成。6.根据权利要求4所述的用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒，其特征在于，所述混合标准品工作液为含内分泌干扰物的乙腈溶液，所述内分泌干扰物为环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞中的一种或多种组合，其中环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、镉和汞的浓度均为1μg/ml，苯并芘浓度为1ng/ml；所述稀释液为含2g/ml尿素和1g/ml氯化钠的水溶液；所述淋洗液/活化液为水；所述洗脱液/活化液为乙腈；所述复溶液为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈水溶液，乙腈和水的体积比是1:9。7.权利要求4所述的用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：(1)收集正常儿童及性早熟儿童尿液样本，使用尿液样本前处理试剂组合进行尿液样本的处理；(2)使用试剂盒中的混合标准品工作液，制备浓度梯度的混合标准品溶液；(3)将准备好的待测样品和标准品溶液进行lc-ms/ms质谱进样上机检测；(4)根据检测结果，绘制混合标准品溶液的标准曲线，对儿童性早熟发病风险进行筛查。8.根据权利要求7所述的用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中，所述环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘的采用液相色谱串联质谱联用仪检测，质谱条件为：
所述mrm参数为：9.根据权利要求7所述的用于筛查早期儿童性早熟的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中，所述镉和汞采用电感耦合等离子体质谱仪分析，质谱条件为：高频功率：1.2kw辅助气流速：1.1l/min采样深度：5.0mm等离子体气流速：8.0l/min载气流速：0.7l/min雾室温度：5℃高频频率：27.12mhz碰撞气种类：he池电压：-21v碰撞气流速：6.0ml/min能量过滤器电压：5.0v。

技术总结
本发明提供了一种用于筛查儿童性早熟风险的内分泌干扰物及其应用，属于生化检测技术领域；本发明中，将环唑醇、乐果、氯苯嘧啶醇、苯并芘、镉和汞六种内分泌干扰物中的一种或多种组合作为筛查儿童性早熟风险的标志物，采用高效液相色谱串联质谱检测技术检测上述内分泌干扰物，并将其制备成试剂盒，用于儿童性早熟风险分析；所述试剂盒中加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶和儿茶素来提高试剂盒的灵敏度和准确性，调控质谱检测条件来降低试剂盒的检测限，进而能够及早的筛查儿童性早熟风险。进而能够及早的筛查儿童性早熟风险。进而能够及早的筛查儿童性早熟风险。


技术研发人员：薛斌 覃健 殷梓晨 李妍 袁玉山 沈宁 徐滔 马培旗
受保护的技术使用者：南京医科大学附属逸夫医院
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/7/22