一种间充质干细胞亚群及其应用

1.本发明属于干细胞治疗技术领域，具体涉及一种间充质干细胞亚群及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(msc)是一种具有强大的自我更新修复能力的成体干细胞，在一定条件下可分化成机体所需的功能细胞，负责器官和组织系统的再生和修复，维持机体正常生命活动。msc在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用。
3.运用msc进行疾病治疗的研究及成果近些年也有很多报道。目前全球已经有19款干细胞治疗药物上市，广泛涉及到心血管疾病，神经性退化疾病，骨退化疾病，自身免疫性疾病及新冠病毒感染等疾病。据中国国家药品监督管理局药品审评中心cde官方公布，共有19个msc类产品获批临床试验默认许可进行新药临床试验，有13项属于wj-msc治疗药物。已有研究显示msc在系统性红斑狼疮这一自身免疫性疾病方面具有很好的疗效，但是并非所有患者都可治疗。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种间充质干细胞亚群。
5.本发明的另一目的在于提供上述间充质干细胞亚群的应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种间充质干细胞亚群，其细胞表面具有高表达的第一marker和低表达的第二marker，该第一marker包括公认的cd105、cd90、cd73及特有的cd201和cd49e，该第二marker包括cd34、cd45和hla-dr，其中，
8.表面高表达cd105的细胞占比为98.7-98.9％，表面高表达cd90的细胞占比为99.6-99.8％，表面高表达cd73的细胞占比为97.1-97.3％，表面高表达cd201的细胞占比为98.1-98.3％，表面高表达cd49e的细胞占比为97.85-97.9％，
9.其表达差异基因包括下表所示：
[0010][0011][0012]
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一marker由cd105、cd90、cd73、cd201和cd49e组成。
[0013]
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二marker由cd34、cd45和hla-dr组成。
[0014]
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一marker由cd105、cd90、cd73、cd201和cd49e组成，所述第二marker由cd34、cd45和hla-dr组成。
[0015]
在本发明的一个优选实施方案中，表面高表达cd105的细胞占比为98.8％，表面高表达cd90的细胞占比为99.7％，表面高表达cd73的细胞占比为97.2％，表面高表达cd201的细胞占比为98.2％，表面高表达cd49e的细胞占比为97.89％。
[0016]
上述间充质干细胞亚群作为免疫调控组合物的原料的应用。
[0017]
上述间充质干细胞亚群作为治疗自身免疫性疾病的组合物的原料的应用。
[0018]
一种免疫调控组合物，其原料包括上述间充质干细胞亚群。
[0019]
一种治疗自身免疫性疾病的组合物，其原料包括上述间充质干细胞亚群。
[0020]
本发明的有益效果是：本发明高表达免疫调控相关蛋白，对细胞及机体更具有免疫调控能力，可作为治疗自身免疫性疾病的开发原料，为这类疾病的药物开发提供新的原料和思路。
附图说明
[0021]
图1为本发明实施例1中单细胞测序细胞分群示意图。
[0022]
图2为本发明实施例1中前50个高表达基因箱型图。
[0023]
图3为本发明实施例1中流式分选cd201+cd49e+mscs细胞结果图。
[0024]
图4为本发明实施例1中immun-mscs和msc的生长状况照片。
[0025]
图5为本发明实施例1中差异表达基因火山图、kegg富集气泡图及go富集分析图。
[0026]
图6为本发明实施例1中干细胞对淋巴细胞增殖的抑制作用效果图。
具体实施方式
[0027]
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0028]
实施例1
[0029]
1、本发明间充质干细胞亚群的鉴定与富集
[0030]
将健康产妇的脐带样本利用酶解法分离富集原代msc并进行扩增培养。利用单细胞测序技术(10
×
genomics)对培养体系的msc进行单细胞转录组分析，以获得msc单细胞图谱，同时采用非线性降维法t-sne(t-distributed stochastic neighbor embedding)对msc功能亚群进行可视化，结合功能亚群上调表达基因、基因富集分析go(gene ontology)与基因代谢通路分析kegg(kyoto encyclopedia ofgenes and genomes)等生物信息学理论分析，来明确鉴定目标新功能亚群msc及其细胞表面所携带的特殊身份标记。
[0031]
结果如图1所示，该细胞被分为10个亚群，通过其中亚群4(c4)为本发明间充质干细胞亚群，该细胞亚群上调表达的前50个基因中有40个与免疫调控相关基因(cd63，itgb1，cd59，cd44，cd99等)，如图2所示。经kegg分析显示该亚群的细胞主要以tnf信号通路，il-17信号通路，p53信号通路为主，go富集分析显示表达蛋白涉及信号分子，趋化因子及cxcr等信号因子，提示其可能具有免疫调控的作用。分析表明该亚群的细胞高表达cd201和cd49e两个蛋白，故将它们用于筛选标记。
[0032]
2、具有免疫调控功能亚群间充质干细胞(immun-mscs)分选
[0033]
取培养的p5代次msc消化离心(300g，5min)，弃去上清，制成单细胞悬液(5
×
107/
ml)。pbs清洗后用封闭液封闭30min，加入pe-cd201及fitc-cd49e进行孵育，阴性对照组加入同型对照抗体，于4℃避光孵育，每隔10min混悬一次细胞，30min后用分选型流式细胞仪用cd201和cd49e设门进行分选。将分选出来的cd201，cd49e双阳性细胞命名为immun-mscs。分选结果如图3所示，结果显示该细胞占比为52.6％。
[0034]
3、本发明间充质干细胞亚群(immun-mscs)的培养及鉴定
[0035]
采用流式分选方法从人脐带间充质干细胞中分离得到cd201+cd49e+亚群细胞(immun-mscs)，应用倒置显微镜观察期生长情况，如图4所示，immu-mscs呈单层贴壁生长，纺锤形。
[0036]
4、表面marker鉴定
[0037]
将培养的上述immun-mscs细胞按5
×
104分成4管，分别加入抗体i(apc-cd105、fitc-cd90、pecy7-cd45)，抗体ii(apc-cd73、fitc-hladr，pecy7-cd34)，抗体ii(fitc-cd201，apc-cd49e)及同型对照。于4℃避光孵育，每隔10min混悬一次细胞，30min后用流式细胞仪检测细胞百分比。如图5所示，本发明间充质干细胞亚群中cd105占比98.8％，cd90占比99.7％，cd73占比97.2％，cd201占比98.2％，cd49e占比97.89％。低表达cd34，cd45和hla-dr。
[0038]
5、本发明间充质干细胞亚群的转录组学分析(cd201+cd49e+mscs)
[0039]
用trizol法提取总rna，利用磁珠富集mrna，经反转录试剂盒扩增构建cnda文库。库检合格后，用illumina平台进行测序。rna提取、建库和转录组测序均委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。计算msc(w)与immu-msc(c4)信号比值(fold change，fc)，并用log2fc》1为标准筛选差异表达基因。运用cluster profiler软件对差异表达基因进行go功能注释分析，根据kegg数据库对差异表达基因进行kegg通路富集分析。
[0040]
根据阈值(foldchange》2，t检验p≤0.05)进行筛选，共发现2499个差异基因，其中上调的有970个，下调的有1529个，部分见表1。然后进一步根据基因功能特点筛选获得与免疫调控相关的基因，其中ensg00000081041(cxcl2)、ensg00000169429(cxcl8)、ensg00000108342(csf3)、ensg00000163735(cxcl5)、ensg00000115009(ccl20)等上调，见图5a。
[0041]
kegg富集分析发现，这些差异表达基因分布在348条通路中。主要参与的信号转导途径分别是细胞周期、细胞因子受体相关作用、dna复制、铁死亡、hippo信号通路、jak-stat信号通路、mapk信号通路、p53信号通路、tnf信号通路等，见图5b。这些结果表明，本发明间充质干细胞亚群的细胞具有免疫调控的潜能。
[0042]
对差异表达基因进行go富集分析，以探究这些差异表达基因的生物学功能。在前30项显著富集中，有16项属于生物过程类，前3项中包括细胞分裂，炎症反应及免疫应答；10项属于细胞组分类(细胞质、质膜、细胞外空间、细胞外区域及细胞表面等)；4项属于分子功能类(生长因子活性、细胞外基质结构成分、细胞因子活性及细胞外基质结合)，见图5c。结果显示，差异表达基因与免疫调控密切相关。
[0043]
表1表达差异基因
[0044][0045]
6、功能亚群间充质干细胞(immun-mscs)对t细胞增殖的影响
[0046]
从健康人血中分离提取pbmc，用cfse进行染色，染色后的cfse-pbmc细胞用cd3/cd28 beads进行活化，活化的细胞接种至96孔板中。分别将immun-mscs及msc细胞与t细胞分别以1：20的比例进行共孵育。检测t细胞的增殖情况。
[0047]
如图6所示，随着时间增长，干细胞对t细胞的增殖有显著抑制作用，且immun-mscs相较于msc更强。
[0048]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

技术特征：
1.一种间充质干细胞亚群，其特征在于：其细胞表面具有高表达的第一marker和低表达的第二marker，该第一marker包括cd105、cd90、cd73、cd201和cd49e，该第二marker包括cd34、cd45和hla-dr，其中，表面高表达cd105的细胞占比为98.7-98.9％，表面高表达cd90的细胞占比为99.6-99.8％，表面高表达cd73的细胞占比为97.1-97.3％，表面高表达cd201的细胞占比为98.1-98.3％，表面高表达cd49e的细胞占比为97.85-97.9％，其表达差异基因包括下表所示：2.如权利要求1所述的一种间充质干细胞亚群，其特征在于：所述第一marker由cd105、cd90、cd73、cd201和cd49e组成。3.如权利要求1所述的一种间充质干细胞亚群，其特征在于：所述第二marker由cd34、cd45和hla-dr组成。4.如权利要求1所述的一种间充质干细胞亚群，其特征在于：所述第一marker由cd105、cd90、cd73、cd201和cd49e组成，所述第二marker由cd34、cd45和hla-dr组成。5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的一种间充质干细胞亚群，其特征在于：表面高表达cd105的细胞占比为98.8％，表面高表达cd90的细胞占比为99.7％，表面高表达cd73的细胞占比为97.2％，表面高表达cd201的细胞占比为98.2％，表面高表达cd49e的细胞占比为97.89％。6.权利要求1至5中任一权利要求所述的间充质干细胞亚群作为免疫调控组合物的原料的应用。7.权利要求1至5中任一权利要求所述的间充质干细胞亚群作为治疗自身免疫性疾病的组合物的原料的应用。8.一种免疫调控组合物，其特征在于：其原料包括权利要求1至5中任一权利要求所述的间充质干细胞亚群。9.一种治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于：其原料包括权利要求1至5中任一权利要求所述的间充质干细胞亚群。

技术总结
本发明公开了一种间充质干细胞亚群及其应用，其细胞表面具有高表达的第一Marker和低表达的第二Marker，该第一Marker包括公认的CD105、CD90、CD73及特有的CD201和CD49e，该第二Marker包括CD34、CD45和HLA-DR。本发明高表达免疫调控相关蛋白，对细胞及机体更具有免疫调控能力，可作为治疗自身免疫性疾病的开发原料，为这类疾病的药物开发提供新的原料和思路。路。路。


技术研发人员：曾子晏 王薛婷 张凌娟 许韧
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/7/22