一种具有过氧化氢酶活性用于肿瘤协同光疗的有机小分子化合物

1.本发明属于化学制药领域，涉及一类具有过氧化氢酶活性，具有协同光疗作用的七甲基川菁分子衍生物，其在水中可以进行超分子组装，尤其涉及一种在一个波段照射下即可产生光热，光动力效果，并且具有过氧化氢酶活性的有机小分子化合物。


背景技术：

2.近年来，随着癌症的发病率逐年上升，癌症已经成为威胁人类生命健康最严重的疾病，而癌症的治疗方式也在研究人员的努力下不断改变创新，其中激光光热治疗和光动力治疗逐渐发展，成为研究人员研究的热门方向。光热疗法(ptt)是用一束近红外光辐射肿瘤组织，药物在发光的同时会产生热量，升温可杀死癌细胞；光动力疗法(pdt)则是在近红外光辐射肿瘤组织后，光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致肿瘤细胞受损，乃至死亡。光热疗法和光动力疗法因其对肿瘤的高特异性、微创、低副作用而广泛受到关注。
3.单独的光热治疗常常因为光热剂分布不均匀，剩余的肿瘤细胞迅速产生耐热性，导致光热治疗效率低下，此外，光动力治疗又受到肿瘤部位缺氧微环境的影响，往往难以充分的杀死肿瘤细胞，而且目前出现的联合光疗大都是使用两种不同波段的激光辐射从而分别产生光热和光动力治疗的效果，这既影响了光疗的效率又增加了治疗技术的复杂性。
4.因此，开发单光触发的协同治疗平台并且解决肿瘤部位的缺氧微环境对癌症治疗具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了解决当前技术中存在的上述问题，本发明提出了一种具有过氧化氢酶活性用于肿瘤协同光疗的有机小分子化合物，该类化合物在单一波段的激光照射下，光敏剂在发光的同时可以同时产生热量和活性氧从而杀死肿瘤细胞，并且可以催化肿瘤微环境中的过氧化氢分解，产生氧气从而缓解肿瘤部位的缺氧情况，进一步增强光动力治疗的效果。
6.本发明的技术方案是：
7.一种具有过氧化氢酶活性用于肿瘤协同光疗的有机小分子化合物，所述化合物具有式(ⅰ)所示结构或其异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物在水溶液中自组装形成的微纳结构：
8.9.在上述式(i)中：
10.x1选自于n、o、s、se、te或-cr
20r20
’‑
，其中优选x1为o、s、se和te；
11.y1、y2、y3各自独立地选自于η、羟基、卤素原子、取代或非取代的氨基和烃氧基，优选y1、y3为h，y2为cl；
12.t1、t2、t3各自独立地选自0-5的整数，优选t1、t2均为1，t3为0；；
13.r1、r1’
、r2各自独立地选自于-cn，-cf3，f，-so2cf3，-no2，-cooet，-so2ph，优选r1、r1’
均为-cn，r2为-cn或
14.r3和r3’
各自独立地选自于h、卤素原子、取代或非取代的烃基、取代或非取代的环烃基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的杂芳基、取代或非取代的杂环基、取代或者非取代的醇基、取代或者非取代的醚基、取代或者非取代的醛基、取代或者非取代的羧基、取代或者非取代的酰胺基、取代或者非取代的酯基和取代或者非取代的氨基，；
15.r4为-(ch2)
m-、m为0～5的整数，优选m为3；
16.r5和r6共同形成如下之一的连接：或者r5、r6和x1共同形成如下连接其中，ra、rb、rc、rd、re、rf、rg各自独立地选自于h、卤素、取代或非取代的烃基、取代或非取代的羧基、取代或非取代的羟基和取代或非取代的氨基。
17.优选的，所述微纳结构由化合物
ⅰ‑
1、
ⅰ‑
2、
ⅰ‑
3、
ⅰ‑
4、
ⅰ‑
5、
ⅰ‑
6、
ⅰ‑
7、
ⅰ‑
8、
18.ⅰ‑
9、
ⅰ‑
10、
ⅰ‑
11、
ⅰ‑
12、
ⅰ‑
13、
ⅰ‑
14、
ⅰ‑
15、
ⅰ‑
16、
ⅰ‑
17、
ⅰ‑
18、
ⅰ‑
19、
ⅰ‑
20、
ⅰ‑
21、
ⅰ‑
22、
ⅰ‑
23、
ⅰ‑
24、
ⅰ‑
25、
ⅰ‑
26、
ⅰ‑
27、
ⅰ‑
28、
ⅰ‑
29、
ⅰ‑
30、
ⅰ‑
31、
ⅰ‑
32、
ⅰ‑
33、
ⅰ‑
34、
ⅰ‑
35、
ⅰ‑
36、
ⅰ‑
37、
ⅰ‑
38、
ⅰ‑
39或
ⅰ‑
40在水溶液中自组装形成。
19.所述微纳结构的粒径为1nm～500nm，优选的，为10nm～200nm，更优选的，为30nm～150nm。
20.优选，所述光治疗药物包括光热治疗(ptt)药物、光动力治疗(pdt)药物或光声治疗药物。所述癌症包括食道癌、非小细胞肺癌、胆道癌、头颈癌、巴雷特食管炎、膀胱癌、结肠
直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、脑肿瘤、乳腺癌或皮肤癌，所述皮肤癌包括黑色素瘤。
21.本发明还提供了所述微纳结构的制备方法，包括以下步骤：
22.1)将具有式(ⅰ)所示结构的化合物、其异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物利用有机溶剂溶解；
23.所选用的有机溶剂为烷烃、烯烃、芳烃、醇、酮、醛、羧酸、酯或醚中的一种或者多种的混合；具体的，有机溶剂为dmso、dmf、ch3oh、ch3ch2oh、乙二醇、正丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、正丁醇、异丁醇、丁二醇或聚乙二醇、丙酮、二氯甲烷或乙腈中的一种或者多种的混合；优选为乙醇。
24.2)将溶解得到的溶液加入水中，得到化合物的终浓度为1nm-1m的化合物溶液；
25.终浓度优选为100nm～500μm；最优选为0.3μm～150μm。
26.3)化合物在水溶液中自组装形成微纳结构。
27.上述制备方法简单、便捷，适宜规模化生产。
28.本发明还提供了微纳结构的药物组合物，包括：治疗有效剂量的所述微纳结构，和药学上可接受的载体。优选的，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、稳定剂或其组合。
29.本发明的微纳结构为纳米碟结构，其药物组合物还包括包封在微纳结构中的活性剂，活性剂为治疗剂或诊断剂，优选为化疗剂或放疗剂，包括小分子化疗药物、靶向治疗药物、化疗药物、抗体药物等。进一步的，微纳结构还包括靶向分子，优选抗体、肽、适体或叶酸等。
30.本发明所提供的药物组合物可以制成注射剂，注射剂包含治疗有效剂量的微纳结构和注射溶剂或附加剂或其组合；其中，注射溶剂为注射用水、乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇中的一种、两种或两种以上的混合溶剂。优选的，所述药物组合物可以制为注射液。
31.本发明还提供了一种在受试者的靶区域进行光热和光动力协同治疗的方法，包括：
32.1)提供所述的微纳结构；
33.2)将所述微纳结构通过静脉注射给予受试者；
34.3)等待所述微纳结构由于epr效应在靶区域富集；
35.4)采用808nm的光波对受试者的靶区域进行照射。
36.本发明的有益效果：
37.(1)本发明所提供的化合物，在水溶液中可以自组装形成微纳结构，可以通过epr效应使得光敏剂聚集在肿瘤区域，并且具有单波段辐射即可同时产生光热治疗和光动力治疗的效果，降低了联合光疗的复杂性和技术难度，提高了联合光疗的效率。
38.(2)本发明提供的化合物通过协同光疗，克服了单独光热治疗由于光敏剂分布不均匀导致的局部受热不均，肿瘤细胞产生耐热性从而使得光热治疗效率降低，同时克服了光动力治疗往往由于肿瘤部位的乏氧环境，严重影响光动力治疗的效率。因为本发明的化合物具有类过氧化氢酶的作用，可以很好的利用肿瘤部位富含过氧化氢的微环境，催化过氧化氢产生氧气，缓解肿瘤部位的乏氧环境，进而增强光动力治疗的效果。
39.(3)本发明还提供了式(ⅰ)所示化合物用于制备光治疗药物、诊断和治疗癌症药物或治疗皮肤病药物的用途，其治疗效果好、创伤小，具备极大的市场价值和广阔的经济前
景。
附图说明
40.图1为本发明提供的化合物
ⅰ‑
1的合成路线图；
41.图2为化合物
ⅰ‑
1在不同极性溶剂中的紫外吸收光谱图；
42.图3为化合物
ⅰ‑
1在不同极性溶剂中的荧光发射光谱图；
43.图4为化合物
ⅰ‑
1在水溶液中自组装形成纳米盘后所拍的透射电镜图；
44.图5为本发明化合物
ⅰ‑
1在水溶液中的粒径测试结果；
45.图6为本发明化合物
ⅰ‑
1的晶体结构；
46.图7为不同浓度的化合物
ⅰ‑
1在808nm激光照射下的升温曲线；
47.图8为不同浓度的化合物
ⅰ‑
1在808nm激光照射下的光热效率计算；
48.图9为化合物
ⅰ‑
1在水溶液中的光热稳定性图；
49.图10为化合物
ⅰ‑
1在808nm激光照射下，使用dpbf作为活性氧探针，检测活性氧产生的dpbf紫外吸收衰减光谱图；
50.图11为化合物
ⅰ‑
1在过氧化氢水溶液中，使用ta作为探针，测试化合物类过氧化氢酶活性的荧光发射光谱图；
51.图12为化合物
ⅰ‑
1在过氧化氢水溶液中，使用pt(ii)meso-tetra(pentafluorophenyl)porphine作为氧探针，测试氧气产生量的荧光发射光谱图；
52.图13为化合物
ⅰ‑
1被癌细胞吞噬后细胞共定位图像；
53.图14为化合物
ⅰ‑
1对hela细胞live-dead荧光成像图；
54.图15为化合物
ⅰ‑
1组装成的纳米盘以及活性氧探针dcfh-da进入hela细胞后，用808nm激光照射后的细胞内活性氧产生的荧光成像图；
55.图16为化合物
ⅰ‑
1组装成的纳米盘经尾静脉注射进入小鼠后，不同时间点的小鼠全身的光声成像图；
56.图17为化合物
ⅰ‑
1组装成的纳米碟经静脉注射进入小鼠后，不同时间点的小鼠全身的光声成像信号强度图；
57.图18为化合物
ⅰ‑
1小鼠实验体内光热治疗中的光热成像；
58.图19为化合物
ⅰ‑
1小鼠实验的光治疗实验图；
59.图20为荷瘤小鼠尾静脉注射化合物
ⅰ‑
1并给予治疗后的肿瘤体积-时间图；图21为荷瘤小鼠静脉注射化合物
ⅰ‑
1治疗后小鼠体重-时间图；
60.图22为荷瘤小鼠静脉注射化合物
ⅰ‑
1并给予治疗后小鼠的肝功能和血常规情况；
61.图23为荷瘤小鼠静脉注射化合物
ⅰ‑
1并给予治疗22天后，小鼠的心、肝、脾、肺、肾的切片h&e染色图片；
具体实施方式
62.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
63.本发明提供了化合物的某些具体实例，包括下述表1中所示的化合物
ⅰ‑
1到
ⅰ‑
40。
[0064][0065]
表1本发明的化合物实例
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071][0072]
上述化合物可通过以下反应通式进行合成：
[0073]
主要合成步骤包括：
[0074]
(1)分别提供化合物a、b、c的合成步骤；
[0075]
化合物a的合成：
[0076][0077]
将化合物1’和化合物2’和乙醇镁溶于乙醇中，60℃反应24小时。真空下蒸去溶剂，所得固体经柱层析纯化的目标化合物a。
[0078]
化合物b的合成：
[0079][0080]
将二氯甲烷和化合物4’冰浴下加入瓶中搅拌，恒压加入化合物5’搅拌，再加入化合物3’，80℃反应3小时；反应完全后将产物倒入碎冰中淬灭反应，在冰箱放置过夜。真空下蒸去溶剂得到粗产物化合物b，不进行提纯直接用于下一步反应。
[0081]
化合物c的合成：
[0082][0083]
化合物6’和化合物7’加入到乙腈中。加热到110℃回流反应24小时。真空下蒸去溶剂，所得固体用乙醚洗涤3次得到化合物c。
[0084]
(2)将化合物a和化合物b溶于乙醇中，加热回流，然后加入化合物c，加热回流，真空下蒸去溶剂，所得固体经柱层析纯化，得目标化合物ii。
[0085]
实施例1化合物
ⅰ‑
1的合成及其荧光性质
[0086]
如图1所示，化合物
ⅰ‑
1的合成包括以下步骤：
[0087]
(1)化合物1的合成：1.46g丙二腈和0.93g乙醇镁加到15ml乙醇中，然后加入0.75ml的3-羟基-3-甲基丁烷-2-酮，加热到60℃反应12小时。真空旋蒸除去溶剂，所得固体经柱层析纯化得到目标化合物1。1h nmr(400mhz，cdcl3):δ(ppm):2.36(s,3h),1.63(s,6h)。
[0088]
(2)化合物2的合成：将30mldcm和30ml dmf在冰浴下加入反应瓶中搅拌，恒压加入26.3mlpocl3搅拌，再加入7.95ml的环己酮，加热到80℃反应3小时。反应结束后将产物倒入碎冰中，使反应淬灭，然后放置在冰箱中过夜，真空旋蒸除去溶剂，得到粗产物化合物2,直接进行下一步合成反应。
[0089]
(3)化合物3的合成：4.5g的化合物1和3g的化合物2加入到50ml乙醇中。在90℃回流反应8小时。等冷却到室温后，抽滤获得粗产物化合物4，不进行提纯直接用于下一步反应。
[0090]
(4)化合物4的合成：5.0g的2-甲基苯并噻唑和15.67g的碘乙烷加入到20ml乙腈中。在110℃回流反应24小时。真空旋蒸除去溶剂，将固体用乙醚洗涤3次，然后得到产物4。
[0091]1h nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm):8.44(d,1h),8.33(d,1h),7.89(t,1h),7.79(t,1h),4.75(q,2h),3.20(s,3h),1.45(t,3h).
[0092]
(5)化合物i-1的合成：3.82g的化合物3和1.96g的化合物4溶于50ml乙醇中，加热到90℃回流9小时，真空旋蒸除去溶剂，所余固体经柱层析纯化得到目标化合物i-1。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):8.23(d,1h),8.14(d,1h),8.03(m,2h),7.75(t,1h),7.63(t,1h),7.00(d,1h),5.80(d,1h),4.73(q,2h),2.71(t,2h),2.61(t,2h),1.82(t,2h),1.53(s,6h),1.39(t,3h).
[0093]
化合物
ⅰ‑
1在水和有机溶剂中的紫外吸收光谱图及荧光发射光谱图如图2和图3所示，可见化合物
ⅰ‑
1在两种溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱显著不同，其中
ⅰ‑
1在水
溶液中的吸收光谱分布更宽，发射光的荧光强度低，说明化合物
ⅰ‑
1在水溶液和有机溶剂中的物理特性不同。
[0094]
实施例2化合物
ⅰ‑
2至
ⅰ‑
15的合成
[0095]
采用与实施例1类似的方法可以制备化合物
ⅰ‑
2至
ⅰ‑
15。
[0096]
1、化合物
ⅰ‑
2的合成
[0097][0098]
以化合物5代替实施例1中的化合物1，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
2；
[0099]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.88(d,1h),7.86(s,2h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.29(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.46(d,1h),4.03(q,2h),3.18(t,2h),2.81(t,4h),1.58(t,2h),1.53(dt,2h),1.47(dt,2h),1.16(s,3h),1.13(t,3h)。
[0100]
2、化合物
ⅰ‑
3的合成
[0101][0102]
以化合物6代替实施例1中的化合物1，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
3；
[0103]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.29(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.78(d,2h),5.46(d,1h),4.63(t,1h),4.03(q,2h),3.18(t,2h),2.86(d,1h),2.81(t,4h),2.76(s,1h),1.58(t,2h),1.53(dt,2h),1.47(dt,2h),1.16(s,3h),1.13(t,3h),1.05(s,3h)。
[0104]
3、化合物
ⅰ‑
4的合成
[0105][0106]
以化合物7代替实施例1中的化合物1，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1
～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
4；
[0107]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.29(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.46(d,1h),4.14(s,1h),4.03(q,2h),3.80(t,2h),2.81(t,4h),1.58(t,2h),1.47(dt,2h),1.46(dt,2h),1.16(s,3h),1.13(t,3h)。
[0108]
4、化合物
ⅰ‑
5的合成
[0109][0110]
以化合物8代替实施例1中的化合物1，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
5；
[0111]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.29(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.46(d,1h),4.03(q,2h),2.81(t,4h),1.47(dt,2h),1.16(s,3h),1.13(t,3h)。
[0112]
5、化合物
ⅰ‑
6的合成
[0113][0114]
以化合物9代替实施例1中的化合物4，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
6；
[0115]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):8.43(d,1h),7.99(dt,3h),7.63(t,2h),6.78(d,1h),5.77(d,1h),4.58(q,2h),2.69(t,2h),2.61(t,2h),1.82(t,2h),1.53(s,6h),1.43(t,3h).
[0116]
6、化合物
ⅰ‑
7的合成
[0117][0118]
以化合物10代替实施例1中的化合物4，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
7；
[0119]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):8.23(d,1h),8.01(m,3h),7.69(t,1h),7.53(t,1h),6.97(d,1h),5.84(d,1h),4.67(q,2h),2.71(t,2h),2.60(t,2h),1.81(t,2h),1.54(s,6h),1.37(t,3h).
[0120]
7、化合物
ⅰ‑
8的合成
[0121][0122]
以化合物11代替实施例1中的化合物4，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
8；
[0123]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.23(m,2h),6.77(t,1h),6.67(d,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),6.02(d,1h),4.13(q,2h),2.81(t,4h),1.47(qt,2h),1.37(t,3h),1.16(s,6h).
[0124]
8、化合物
ⅰ‑
9的合成
[0125][0126]
以化合物12代替实施例1中的化合物1，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
9；
[0127]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):8.51(d,1h),7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.43(t,1h),7.41(t,1h),7.39(t,1h),7.29(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.46(d,1h),4.03(q,2h),2.81(t,4h),1.47(dt,2h),1.16(s,6h),1.13(t,3h)。
[0128]
9、化合物
ⅰ‑
10的合成
[0129][0130]
以化合物13代替实施例1中的化合物2，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
10；
[0131]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.29(t,1h),7.26(d,2h),6.79(d,2h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),6.06(q,1h),5.46(d,1h),5.43(d,1h),5.31(d,1h),4.67(d,2h),4.03(q,2h),2.84(qt,1h),2.36(d,2h),2.11(d,2h),1.16(s,6h),1.13(t,3h)。
[0132]
10、化合物
ⅰ‑
11的合成
[0133][0134]
以化合物14代替实施例1中的化合物2，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
11；
[0135]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.48(t,1h),7.39(d,2h),7.29(t,1h),6.86(d,2h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.46(d,1h),4.68(d,2h),4.03(q,2h),3.37(s,1h),2.84(qt,1h),2.36(d,2h),2.11(d,2h),1.16(s,6h),1.13(t,3h)。
[0136]
11、化合物
ⅰ‑
12的合成
[0137][0138]
以化合物5和化合物9分别代替实施例1中的化合物1和化合物4，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
12；
[0139]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.86(s,2h),7.57(d,1h),7.47(d,1h),7.33(t,1h),7.24(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.28(d,1h),4.13(q,2h),3.18(t,2h),2.81(t,4h),1.58(t,2h),1.53(dt,2h),1.47(dt,2h),,1.31(t,3h),1.16(s,3h)。
[0140]
12、化合物
ⅰ‑
13的合成
[0141][0142]
以化合物6和化合物9分别代替实施例1中的化合物1和化合物4，其余所需试剂、制
备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
13；
[0143]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.57(d,1h),7.47(d,1h),7.33(t,1h),7.24(t,1h),6.51(d,2h),6.23(d,1h),5.78(d,2h),5.28(d,1h),4.63(t,1h),4.13(q,2h),3.18(t,2h),2.86(d,1h),2.81(t,4h),2.76(s,1h),1.58(t,2h),1.53(dt,2h),1.47(dt,2h),1.31(t,3h),1.16(s,3h),1.05(s,3h)。
[0144]
13、化合物
ⅰ‑
14的合成
[0145][0146]
以化合物5和化合物10分别代替实施例1中的化合物1和化合物4，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
14；
[0147]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.86(s,2h),7.23(t,2h),6.77(t,2h),6.51(d,2h),6.25(d,1h),6.23(d,1h),4.13(q,2h),3.18(t,2h),2.81(t,4h),1.58(t,2h),1.53(dt,2h),1.47(dt,2h),,1.31(t,3h),1.16(s,3h)。
[0148]
14、化合物
ⅰ‑
15的合成
[0149][0150]
以化合物6和化合物10分别代替实施例1中的化合物1和化合物4，其余所需试剂、制备方法同实施例1的步骤1～5)，制备得到化合物
ⅰ‑
15；
[0151]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.23(t,2h),6.77(t,2h),6.51(d,2h),6.25(d,1h),6.23(d,1h),5.78(d,2h),4.63(t,1h),4.13(q,2h),3.18(t,2h),2.86(d,1h),2.81(t,4h),2.76(s,1h),1.58(t,2h),1.53(dt,2h),1.47(dt,2h),1.31(t,3h),1.16(s,3h),1.05(s,3h)。
[0152]
实施例3微纳结构的制备以及表征方法
[0153]
以化合物
ⅰ‑
1自组装形成的微纳结构为例，将化合物
ⅰ‑
1溶于dmso中，配制成浓度为2mm的存储液，取10μl存储液加入到2ml去离子水中即可制备成测试所用的工作液。用dls测试粒径，如图5所示，微纳结构的粒径分布在40-160nm之间。取10μl工作液滴在铜网上，用透射电子显微镜观察拍照，如图4所示，可以明显观察到圆盘形的微纳结构。我们也解析了
ⅰ‑
1的晶体结构，结果显示其每个晶胞由8个
ⅰ‑
1分子组成的。如图6所示。
[0154]
实施例4化合物
ⅰ‑
1量子产率的计算
[0155]
如上说述，从2mm的dmso存储液中取10μl加入到不同极性的溶剂中，测试其紫外吸
收光谱，找出最大紫外吸收波长，用最大吸收波长激发，测试其荧光发射光谱，并用origin软件作图计算其荧光发射光谱的积分面积。通过所得数据计算荧光量子产率φ
x
，φ
x
＝φs(f
x
/fs)(as/a
x
)(λ
exs
/λ
exx
)(n
x
/ns)2。
[0156][0157]
由表可以看出化合物
ⅰ‑
1在不同极性溶液中特征参数不同，在水中的最大紫外吸收波长与最大荧光发射波长和有机溶剂中明显不同，量子产率明显低于在有机溶剂中的产率，这主要是因为化合物
ⅰ‑
1在水中自组装生成微纳结构，结构上的变化导致各项特性和参数发生改变，这种变化也有助于提高其光热效果和光稳定性。同时，本发明的其他化合物也具有类似的性质，可以在水溶液中自组装形成微纳结构。
[0158]
试验例1化合物
ⅰ‑
1体外光热效应及光热稳定性
[0159]
共4组样品分别取3ml加到比色皿中，加盖并用密封膜封好。
[0160]
1号样品是3ml去离子水；
[0161]
2号样品是浓度为10μm的
ⅰ‑
1，具体配置方法为3ml去离子水加15μl的
ⅰ‑
1存储液液(2mm，溶于dmso)；
[0162]
3号样品是20μm的
ⅰ‑
1，具体配置方法为3ml去离子水加30μl的
ⅰ‑
1存储液；
[0163]
4号样品是40μm的
ⅰ‑
1，具体配置方法为3ml去离子水加60μl的
ⅰ‑
1存储液。
[0164]
用808nm激光器分别照射各组样品10分钟，同时用热成像仪每10秒记录一次温度，最后将时间-温度的数据在origin里作图，如图7。1号样品在10分钟内温度基本不变，仅上升1.6℃；2号样品温度从20.1℃上升至34.4℃，升温为14.3℃；3号样品从20.1℃上升至40℃，温度上升19.9℃；4号样品温度从20.1℃上升至47.5℃，升温27.4℃。我们也计算了化合物
ⅰ‑
1的光热转换效率，如图8，其光热转换效率为56.38％，这都说明了化合物
ⅰ‑
1具有极其优异的光热效应。
[0165]
选取2号样品进行光热稳定性测试。图9表明2号样品在808nm激光照射10分钟后温度从21.4℃升至35.6℃，然后关闭激光器，使其自然降温冷却15分钟，然后再次打开激光器
照射10分钟，自然降温，这样重复5次。在这5次光热升降温测试中1号样品每次都可从室温升到35℃左右，最小升温幅度为12.9℃，这表明化合物
ⅰ‑
1具有优异的光热稳定性。
[0166]
试验例2化合物
ⅰ‑
1体外光动力效应及类过氧化氢酶活性
[0167]
在测试前首先配制浓度为20mm的dpbf存储液，溶于dmf；浓度为2mm的icg存储液，溶于dmso；浓度为20mm的对苯二甲酸(ta)存储液，溶于dmf；浓度为20mm的过氧化氢工作液，现配现用，溶于去离子水；浓度为2mm的铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液，溶于dmso。
[0168]
共16组样品，1-3号分别取3ml加到比色皿中，加盖并用密封膜封好，4-16号样品分别取2ml加到比色皿中，加盖密封好
[0169]
1号样品加3ml去离子水和7.5μl的dpbf存储液(20mm，溶于dmf)；
[0170]
2号样品加3ml去离子水，7.5μl的dpbf存储液(20mm，溶于dmf)以及15μl的icg存储液(2mm，溶于dmso)；
[0171]
3号样品加3ml去离子水，7.5μl的dpbf存储液(20mm，溶于dmf)以及15μl的
ⅰ‑
1存储液(2mm，溶于dmso)；
[0172]
4号样品加2ml磷酸盐缓冲液(ph为7.4)以及10μl的过氧化氢工作液；
[0173]
5号样品加2ml磷酸盐缓冲液(ph为7.4)，10μl的过氧化氢工作液以及1μl的
ⅰ‑
1存储液；
[0174]
6号样品加2ml磷酸盐缓冲液(ph为7.4)，10μl的过氧化氢工作液以及5μl的
ⅰ‑
1存储液；
[0175]
7号样品加2ml磷酸盐缓冲液(ph为7.4)，10μl的过氧化氢工作液以及10μl的
ⅰ‑
1存储液；
[0176]
8号样品加2ml磷酸盐缓冲液(ph为7.4)，10μl的过氧化氢工作液以及20μl的
ⅰ‑
1存储液；
[0177]
9号样品加2ml磷酸盐缓冲液(ph为7.4)，10μl的过氧化氢工作液以及40μl的
ⅰ‑
1存储液；
[0178]
10-16号样品分别加入2ml去离子水后，向每组样品中充入氮气，将体系中的空气排出。
[0179]
10号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液；
[0180]
11号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液；
[0181]
12号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液，5μl的
ⅰ‑
1存储液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液；
[0182]
13号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液，10μl的
ⅰ‑
1存储液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液；
[0183]
14号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液，20μl的
ⅰ‑
1存储液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液；
[0184]
15号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液，40μl的
ⅰ‑
1存储液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)存储液；
[0185]
16号样品加2ml去离子水，10μl的过氧化氢工作液以及20μl铂(ⅱ)meso-四(五氟
苯卟吩)存储液；
[0186]
打开激光器，用808nm激光分别照射1-3号每组样品5分钟，并且每30秒记录一次样品的紫外吸收光谱图，最后将每组样品的紫外吸收光谱图在origin软件中作图查看dpbf紫外吸收的衰减情况。如图10所示，1号样品和2号样品dpbf的紫外吸收曲线衰减程度很小，而3号样品在808nm激光照射后，dpbf的紫外吸收随时间延长出现明显的衰减。这说明样品中产生了活性氧，并且将icg作为参比物(单线态氧产率为0.2％)，经过计算，其单线态氧产生率为1.27％，表明化合物
ⅰ‑
1具有优异的光动力效果。
[0187]
将4-9号样品先在37℃的水浴中加热静置1h，然后向每组样品中加入50μl的ta存储液(20mm，溶于dmf)，反应半小时后用荧光分度计测试每组样品的荧光发射光谱。用origin软件对其作图，如图11所示，随着化合物
ⅰ‑
1浓度的升高，ta的荧光发射峰强度明显降低，这表明了化合物
ⅰ‑
1具有良好的类过氧化氢酶活性。
[0188]
向10号样品中通入氮气，11-15号样品加盖密封好，16号样品通入氧气，然后将10-16号样品放置在37℃的水浴中加热1h。然后测试每组样品的荧光发射光谱图，用origin软件对其作图，如图12所示，铂(ⅱ)meso-四(五氟苯卟吩)的荧光发射峰强度随体系中化合物
ⅰ‑
1浓度的升高而明显降低，表明体系中随化合物
ⅰ‑
1浓度的升高，氧气产生量不断增加，进一步表明化合物
ⅰ‑
1有优异的过氧化氢酶活性。
[0189]
试验例3细胞成像实验
[0190]
将细胞核染料hoechst33342(100nm)、溶酶体染料lyso-green(75nm)和
ⅰ‑
1(10μm)加入到细胞培养基中进行细胞染色，30分钟后，用pbs冲洗两遍后在共聚焦荧光显微镜下观察拍照，如图13所示，化合物
ⅰ‑
1进入细胞后，与溶酶体部分几乎完全重合，说明化合物
ⅰ‑
1能有效的被细胞摄入。
[0191]
试验例4细胞内光热效果和光动力效果检测实验
[0192]
将hela细胞培养在96孔板中，每个孔1
×
104细胞，24h后向每个孔中加入不同浓度的
ⅰ‑
1(0.2μm～100μm)，检测暗毒性的细胞孔板在培养箱中放置24小时后，加入活细胞染料calcein-am和死细胞染料ethd-i染色30分钟。随后在荧光显微镜下观察，发现细胞几乎全部存活，证明化合物
ⅰ‑
1本身的毒性极小。
[0193]
如图14所示，检测光毒性的细胞孔板分为3组，分别对应单独的光热治疗，单独的光动力治疗和光热光动力联合治疗。检测单独光热治疗效果的细胞孔板中加入l-抗坏血酸钠，每组细胞于808nm激光器下照射6分钟，检测单独光动力效果的细胞孔板放置于冰浴中抑制温度上升。激光照射完后，在荧光显微镜下观察拍照，结果当
ⅰ‑
1的浓度大于12.5μm时细胞已100％死亡，并且联合光疗的癌细胞杀伤率要明显高于单独的光热治疗或者光动力治疗，这表明化合物
ⅰ‑
1在单波段照射下不仅能同时产生光热治疗和光动力治疗的效果，还对癌细胞有较强的杀伤力。
[0194]
如图15所示，检测细胞内活性氧生成的细胞孔板分为3组，使用dcfh-da作为细胞内的活性氧检测剂，这三组分别加入5μm的dcfh-da；5μm的dcfh-da和40μm化合物
ⅰ‑
1；5μm的dcfh-da，l-抗坏血酸钠和40μm化合物
ⅰ‑
1。用808nm激光照射6分钟，然后在荧光显微镜下观察拍照，加入5μm的dcfh-da和40μm化合物
ⅰ‑
1的细胞孔板在激光照射后荧光强度明显高于其他两组。对比表明化合物
ⅰ‑
1被hela细胞吞噬后经过808nm激光照射，能显著生成活性氧，这也进一步说明化合物
ⅰ‑
1具有优异的光动力效果。
[0195]
试验例5小鼠光声成像测试
[0196]
首先构建小鼠肿瘤模型。向6周龄雌性裸鼠的胸前注射4
×
10
6 4t1细胞，等肿瘤体积生长到75mm3，通过尾静脉注射将200μg化合物
ⅰ‑
1注射进小鼠体内。在不同的时间用三维光声层析成像系统监测。如图16所示，注射后，2-8h内小鼠肿瘤部位荧光随时间增加逐渐增强。如图17的柱状图所示，随时间的延长，在24小时内，肿瘤部位一直有光声信号。此实施例证明化合物
ⅰ‑
1有优异的肿瘤靶向性，以及具有优异的光声信号。而且，在24小时之内裸鼠身体没有发生痉挛、抽搐等异常，证明化合物
ⅰ‑
1几乎没有毒性，安全性极高。
[0197]
试验例6小鼠体内光热治疗中的光热成像实验
[0198]
实验组小鼠尾静脉注射200μl化合物
ⅰ‑
1(200μg)，用808nm激光器照射小鼠肿瘤部位10分钟，同时用光热成像仪持续拍照。从图18可以看出，肿瘤部位温度可以上升到57℃，并且肿瘤周围组织温度并没有升高，说明说明化合物
ⅰ‑
1在光治疗中具有对肿瘤附近组织损伤低的优点。
[0199]
试验例7小鼠体内联合光疗实验
[0200]
将裸鼠分为4组。第1组裸鼠注射生理盐水，不加激光照射；第2组裸鼠注射生理盐水并使用808nm激光照射10分钟；第3组裸鼠注射200μl化合物
ⅰ‑
1(200μg)，不加激光照射；第4组裸鼠将200μl化合物
ⅰ‑
1(200μg)通过尾静脉注射进小鼠体内，用808nm激光器照射小鼠肿瘤部位10分钟。每天用游标卡尺测量每组裸鼠的肿瘤体积，持续记录22天。
[0201]
如图19，第4组激光照射进行联合光疗后的裸鼠，治疗前肿瘤体积为50mm3左右，对其进行治疗后，第二天肿瘤破溃，随着时间增长，未见明显的肿瘤生长，并且肿瘤破溃处开始愈合，第18天时破溃处已完全愈合，有一个小伤疤。肿瘤体积变化情况如图20，实验组(第4组)小鼠在激光照射后肿瘤消除，而对照组(第1、2、3组)小鼠肿瘤的体积持续上升。小鼠体重变化情况如图21，实验组和对照组小鼠体重皆未有异常变化，未见
ⅱ‑
1的明显副作用。如图22，将实验22天后的实验组小鼠进行解剖，将肿瘤、心、肝、脾、肺、肾进行切片h&e染色观察。发现肿瘤细胞发生凋亡，其余器官未见明显损伤。证明化合物
ⅰ‑
1有优异的光治疗能力，并且不损伤内脏，副作用小，相对安全可靠。
[0202]
以上实验说明化合物
ⅰ‑
1在808nm激光照射下，产生的光热和光动力效果对肿瘤具有非常优异的杀伤作用，且安全性高，在临床癌症光疗中有着广阔的应用前景。经验证本发明的其他化合物也有类似的光热治疗效果。
[0203]
试验例8化合物
ⅰ‑
1在小鼠体内安全性实验
[0204]
选用10只雌性裸鼠，5只通过尾静脉注射200μl化合物
ⅰ‑
1(200μg)，另外5只尾静脉注射生理盐水，24小时后取小鼠的血液进行血常规和肝功能的检测。如图23所示，红细胞分布宽度，平均血小板体积和淋巴细胞数目这些血常规指标均在正常范围之内，白蛋白、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和血糖这些肝功能指标均在正常范围之内。结果表明，化合物
ⅰ‑
1有较高的安全性，短期内不损伤肝脏，相对安全可靠。
[0205]
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有过氧化氢酶活性用于肿瘤协同光疗的有机小分子化合物，所述化合物具有式(ⅰ)所示结构或其异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物在水溶液中自组装形成的微纳结构：在上述式(i)中：x1选自于n、o、s、se、te或-cr
20
r
20
’‑
；y1、y2、y3各自独立地选自于η、羟基、卤素原子、取代或非取代的氨基和烃氧基；t1、t2、t3各自独立地选自0-5的整数；r1、r1’
、r2各自独立地选自于-cn，-cf3，f，-so2cf3，-no2，-cooet，-so2ph，ph，r3和r3’
各自独立地选自于h、卤素原子、取代或非取代的烃基、取代或非取代的环烃基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的杂芳基、取代或非取代的杂环基、取代或者非取代的醇基、取代或者非取代的醚基、取代或者非取代的醛基、取代或者非取代的羧基、取代或者非取代的酰胺基、取代或者非取代的酯基和取代或者非取代的氨基，；r4为-(ch2)
m-、m为0～5的整数；r5和r6共同形成如下之一的连接：或者r5、r6和x1共同形成如下连接其中，r
a
、r
b
、r
c
、r
d
、r
e
、r
f
、r
g
各自独立地选自于h、卤素、取代或非取代的烃基、取代或非取代的羧基、取代或非取代的羟基和取代或非取代的氨基。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，式(ⅰ)中，所述t1和t2均为1，t3为0；所述y1和y3均为h，y2为cl；所述x1为o、s、se、te；
所述r1，r1’
均为cn，r2为-cn或3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为化合物
ⅰ‑
1、
ⅰ‑
2、
ⅰ‑
3、
ⅰ‑
4、
ⅰ‑
5、
ⅰ‑
6、
ⅰ‑
7、
ⅰ‑
8、
ⅰ‑
9、
ⅰ‑
10、
ⅰ‑
11、
ⅰ‑
12、
ⅰ‑
13、
ⅰ‑
14、
ⅰ‑
15、
ⅰ‑
16、
ⅰ‑
17、
ⅰ‑
18、
ⅰ‑
19、
ⅰ‑
20、
ⅰ‑
21、
ⅰ‑
22、
ⅰ‑
23、
ⅰ‑
24、
ⅰ‑
25、
ⅰ‑
26、
ⅰ‑
27、
ⅰ‑
28、
ⅰ‑
29、
ⅰ‑
30、
ⅰ‑
31、
ⅰ‑
32、
ⅰ‑
33、
ⅰ‑
34、
ⅰ‑
35、
ⅰ‑
36、
ⅰ‑
37、
ⅰ‑
38、
ⅰ‑
39、
ⅰ‑
40。4.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的化合物，和药学上可接受的载体。5.权利要求1～3任一项所述的化合物在制备用于肿瘤光热光动力协同光疗、具有过氧化氢酶活性制备诊断和/或治疗癌症的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述癌症包括食道癌、非小细胞肺癌、胆道癌、头颈癌、巴雷特食管炎、膀胱癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、脑肿瘤、乳腺癌或皮肤癌；所述光治疗药物为光热治疗药物、光动力治疗药物，光热光动力协同治疗药物、类过氧化氢酶药物、光声治疗药物。

技术总结
本发明提供一种在单波段激光照射下即可同时产生光热和光动力效果，并且具有类过氧化氢酶性质的纳米材料的制备方法和应用。提供了具有式(Ⅰ)所示结构或其异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物在水溶液中自组装形成的微纳结构，以及药物组合物的制备及其在肿瘤协同光疗方面的应用。本发明所提供的化合物可以在肿瘤部位蓄积，并且在808nm激光照射下既具有高光热转换效率产生大量热量，实现肿瘤细胞的热消融，同时又能产生活性氧对肿瘤细胞产生细胞毒性。其具有的类过氧化氢酶性质可以催化肿瘤部位的过氧化氢分解产生氧气，缓解肿瘤部位的缺氧环境，进一步增强了协同光疗的治疗效果。效果。效果。


技术研发人员：周现锋 卢迎习 牟雪璐尔 梁明晨
受保护的技术使用者：青岛科技大学
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/7/22