一种用于检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及荧光探针的制作方法

一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针。


背景技术：

3.华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件。除了代谢酶cyp2c9的基因多态性可以影响到华法林的疗效之外，其作用靶点维生素k环氧化物还原酶(vkorc1)(rs9923231，1639g》a)也在华法林需求剂量的个体差异中发挥着一定的作用。cyp2c9是细胞色素p450酶(cyp)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体p450蛋白总量的20％。cyp2c9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。cyp2c9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。cypc2c9*2(rs1799853，430c》t)和cyp2c9*3(rs1057910，1075a》c)均导致cyp2c9酶活性降低，cyp2c9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体的4～6％。维生素k氧化还原酶是抗凝药物华法林的作用靶点。维生素k环氧化物还原酶复合物1的编码基因vkorc1的遗传变异可通过影响vkorc1表达，从而影响华法林的敏感性。vkorc1基因突变导致其对华法林的敏感性发生变化，突变型的启动子活性高，vkorc的活性变高，低剂量的华法林在体内抗凝血作用强，高剂量易引起出血等副作用。
4.截止到目前，关于cyp2c9和vkorc1基因多态性检测方法涵盖：pcr-荧光探针法、荧光pcr法、pcr+导流杂交法、pcr-芯片杂交法、荧光pcr熔解曲线法、荧光pcr-毛细管电泳法、pcr-电化学基因芯片法等，然而这些方法对检测设备有一定要求，操作繁琐，检测时间长，不能进行快速检测。
5.cn110819709a公开了用于荧光定量pcr检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法，采用野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本，但此方法由于空间距离导致荧光基团和淬灭荧光基团之间无法达到零距离接触，无法实现零背景的荧光。
6.cn110184343a公开了检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用，所述方法通过提供一组用于检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物，组合物内的引物与探针互不干扰、且无交叉污染，可在单个pcr反应管内的进行多重检测，即在单个pcr反应管内实现对多个靶核酸的扩增反应与荧光信号采集，操作简单，但此方法由于空间距离导致荧光基团和淬灭荧光基团之间无法达到零距离接触，无法实现零背景的荧光。
7.综上所述，目前检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法存在操作复杂、检测周期长、易污染、易出现假阳性或假阴性、检测成本较高、通量小等问题。如何提供一种快速低成本且灵敏度高的vkorc1和cyp2c9基因多态性检测方法，已成为目前生物技术领域亟待解决
的问题之一。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针，解决了目前检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法存在的操作复杂、检测周期长、易污染、易出现假阳性或假阴性、检测成本较高、通量小等问题，实现了在一管中对vkorc1和cyp2c9基因多态性的检测，检测敏感性高(检出下限均可以达到1拷贝)，特异性好，高通量且成本低。
9.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供了一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.6所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括seq id no.7-seq id no.9所示的序列。
11.本发明创造性设计了用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针，在探针引物的5’端加入3’端的一定数量的反向互补序列，从而使解离的探针形成类似单链rna的茎环结构，使报告荧光基团和淬灭荧光基团在空间结构上达到无限接近的程度，进而达到完全淬灭背景荧光的目的，能够快速、简便、准确、高效、实用、经济地在一管中检测vkorc1和cyp2c9*2/*3的3个基因型别，通过信标熔解曲线法对病毒的各型别进行有效区分，能够满足临床检验实际工作中相关位点检测的要求。
12.seq id no.1：ctggcgtcgcagtacaa。
13.seq id no.2：gttgactggaatgacctgaga。
14.seq id no.3：gctggctcctgtcttcat。
15.seq id no.4：caatgtgacgttgaggtggag。
16.seq id no.5：gttccagaagagaacgaacg。
17.seq id no.6：acgtgaactccagtcctatc。
18.seq id no.7：gcaggagaacttgtgccaggagttaagc。
19.seq id no.8：cagtatgtaactggaagaggggtggtcgctct。
20.seq id no.9：cacactttttgttggtaaccgggccacgcgg。
21.优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
22.优选地，所述荧光基团包括fam、hex、vic、rox、tamra、joe、tet、cy3、cy5、texas red或lc red460中任意一种或至少两种的组合。
23.优选地，所述淬灭基团包括tamra、bhq1、bhq2、mgb、dabcyl、bhq3或tamra中任意一种或至少两种的组合。
24.第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针在制备用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的产品中的应用。
25.第三方面，本发明提供了一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针。
26.第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针在检测vkorc1和cyp2c9基因多态性中的应用。
27.第五方面，本发明提供了一种非疾病诊断和/或治疗为目的的检测vkorc1和
cyp2c9基因多态性的方法，所述方法包括：
28.以待测样本的核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针进行荧光pcr扩增，根据荧光pcr扩增结果进行判断。
29.优选地，所述待测样本包括全血、口腔拭子或口腔黏膜脱落细胞中任意一种或至少两种的组合。
30.优选地，所述荧光pcr扩增的体系还包括mix和dna聚合酶。
31.优选地，所述荧光pcr扩增的扩增程序包括：
32.(1)50-55℃，5-10min逆转录(2)93-95℃，4-5min预变性；(3)94-95℃，10-15s；58-60℃，30-60s；40-45个循环。
33.优选地，所述荧光pcr扩增的熔解曲线程序为：93-95℃，10-25s；30-45℃，60-120s；0.5％-1％速率升温至95℃。
34.上述50-55中的具体点值可以选择50、51、52、53、54、55等。
35.上述5-10中的具体点值可以选择5、6、7、8、9、10等。
36.上述93-95中的具体点值可以选择93、94、95等。
37.上述4-5中的具体点值可以选择4、5等。
38.上述94-95中的具体点值可以选择94、95等。
39.上述10-15中的具体点值可以选择10、11、12、13、14、15等。
40.上述58-60中的具体点值可以选择58、59、60等。
41.上述30-60中的具体点值可以选择30、35、40、45、50、57、58、59、60等。
42.上述40-45中的具体点值可以选择40、41、42、43、44、45等。
43.上述10-25中的具体点值可以选择10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25等。
44.上述30-45中的具体点值可以选择30、35、40、41、42、43、44、45等。
45.上述60-120中的具体点值可以选择60、65、70、75、80、90、100、110、115、120等。
46.上述0.5％-1％中的具体点值可以选择0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。
47.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
48.(1)本发明通过应用荧光定量pcr技术可以快速、准确且更加灵敏地对vkorc1和cyp2c9合计3个基因型别进行分型检测，检测敏感性高(检出下限均可以达到1ng)、特异性好，具有高通量、低成本等特点；
49.(2)荧光定量pcr反应程序一步完成，不需进行产物纯化测序等二次处理，操作极为简便，所需样品量小；
50.(3)本发明可以采用不对称+熔解曲线分析的方法，突破了传统检测体系一个通道只能检测一个靶标的局限；本发明中的一个荧光通道可以检测至少两个靶标；
51.(4)本发明所采用的分子信标在空间结构上能使报告荧光和淬灭荧光基团达到无限接近的程度从而使扩增的荧光值显著高于普通taqman探针。
附图说明
52.图1为同一管中，fam通道在65.5℃附近出现vkorc1野生型特异性熔解峰图；
53.图2为同一管中，fam通道在72℃附近出现vkorc1突变纯合型特异性熔解峰图；
54.图3为同一管中，fam通道分别在65.5℃和72℃附近出现vkorc1杂合型特异性熔解
峰图；
55.图4为同一管中，vic通道在72℃附近出现cyp2c9*2野生型特异性熔解峰图；
56.图5为同一管中，vic通道在65℃附近出现cyp2c9*2突变纯合型特异性熔解峰图；
57.图6为同一管中，vic通道分别在65℃和72℃附近出现cyp2c9*2杂合型特异性熔解峰图；
58.图7为同一管中，cy5通道在70℃附近出现cyp2c9*3突变纯合型特异性熔解峰图；
59.图8为同一管中，cy5通道在75℃附近出现cyp2c9*3野生型特异性熔解峰图；
60.图9为同一管中，cy5通道分别在75℃和70℃附近出现cyp2c9*3杂合型特异性熔解峰图；
61.图10为同一管中检测p450家族(cyp450)的cyp2c19、cyp2c8以及mthfr质粒的扩增结果，显示fam、vic、cy5三个通道均未出现特异性的熔解峰图。
具体实施方式
62.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
63.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
64.实施例1
65.信标法多重体系加合扩增曲线分析。
66.本发明采用信标-熔解曲线法同步检测并区分vkorc1和cyp2c9*2/*3，包括分别针对vkorc1和cyp2c9*2/*3的一组特异性引物以及根据tm值筛选的经过不同标记的分子信标，具体的基因序列及其标记方法如表1所示。
67.表1
solution至沉淀；过夜溶解后用nanodrop紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于等于20ng/μl且od260/od280为1.9
±
0.2视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀dna/rna，然后重新加dna/rnarehydration solution溶解核酸；在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护，保存核酸标本至4℃冰箱。
72.(2)在试剂准备区配制25μlpcr扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如表2所示。
73.表2
[0074][0075][0076]
在标本制备区对盛有gdna/rna模板短暂离心后添加2.0μl至扩增体系中，在pcr管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号，pcr管震荡混匀，桌面离心机上离心，设置程序后在将pcr管放入适配器，并安装到扩增仪内,并按照下表3设置反应程序，反应程序所选通道为(fam/vic/rox/cy5)，点击“start”开始仪器运行。
[0077]
表3
[0078][0079][0080]
(3)结果如表4所示。
[0081]
表4
[0082][0083]
结果：fam通道仅在65.5℃附近出现vkorc1野生型特异性熔解峰，如图1所示；仅在72℃附近出现vkorc1突变纯合型特异性熔解峰，如图2所示；分别在62.5℃和72℃附近各出现一个vkorc1杂合型特异性熔解峰，如图3所示；vic通道仅在72℃附近出现cyp2c9*2野生型特异性熔解峰，如图4所示；仅在65℃附近出现cyp2c9*2突变纯合型特异性熔解峰，如图5
所示；分别在72℃和65℃附近各出现一个cyp2c9*2杂合型特异性熔解峰，如图6所示；cy5通道仅在75℃附近出现cyp2c9*3野生型特异性熔解峰，如图8所示；仅在70℃附近出现cyp2c9*3突变纯合型特异性熔解峰，如图7所示；分别在75℃和70℃附近各出现cyp2c9*3杂合型特异性熔解峰，如图9所示。
[0084]
(4)一代测序结果分析，在“experiment”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“gene scaning”，点击“calculate”键，对所有检测标本进行基因型分析，对样本检测结果进行判读。
[0085]
实验对比例
[0086]
将12例合作医院提供的临床样本的荧光定量pcr检测与一代测序进行对比实验。
[0087]
12例样本荧光定量pcr检测1.5h+结果分析0.5h，合计2h，而一代测序检测8h+结果分析1h，合计9h，且荧光定量pcr检测为闭管操作，不需进行产物纯化测序等二次处理，因而也不存在扩增产物污染的风险，12例样本荧光定量pcr与一代测序检测结果的对比，如表5所示。
[0088]
表5
[0089][0090][0091]
结果表明：本发明设计的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物探针组合特异性好，突破了传统检测体系一个通道只能检测一个靶标的局限。
[0092]
检出下限案例
[0093]
将待检测的各型样本采用nanodrop定量后，稀释至0.2ng/μl。对上述稀释比的病毒进行荧光定量pcr反应。
[0094]
结果：待检测各型的检测下限均为1ng，说明本发明设计的用于检测vkorc1和
cyp2c9基因多态性的引物探针组合检测敏感性高(检出下限均可以达到1拷贝)，特异性好。
[0095]
特异性案例
[0096]
将其它未检测p450家族(cyp450)的cyp2c19、cyp2c8、mthfr扩增子区域分布克隆到同一个质粒上，由上海复百澳生物科技有限公司完成合成并且进行质粒定量。将质粒按照108copies/μl参照实施例3对上述稀释度的病毒进行检测，结果如图10所示，这些扩增子在fam、vic、cy5通道质粒梯度图谱，均未出现明显的熔解峰，表明本发明检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法具备良好的特异性。
[0097]
综上所述，本发明创造性设计了用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针，在探针引物的5’端加入3’端的一定数量的反向互补序列，从而使解离的探针形成类似单链rna的茎环结构，使报告荧光基团和淬灭荧光基团在空间结构上达到无限接近的程度，进而达到完全淬灭背景荧光的目的，能够快速、简便、准确、高效、实用、经济地在一管中检测vkorc1和cyp2c9*2/*3的3个基因型别，通过信标熔解曲线法对病毒的各型别进行有效区分，能够满足临床检验实际工作中相关位点检测的要求。
[0098]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.6所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括seq id no.7-seq id no.9所示的序列。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；优选地，所述荧光基团包括fam、hex、vic、rox、tamra、joe、tet、cy3、cy5、texas red或lc red460中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述淬灭基团包括tamra、bhq1、bhq2、mgb、dabcyl、bhq3或tamra中任意一种或至少两种的组合。3.权利要求1或2所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针在制备用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的产品中的应用。4.一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针。5.权利要求1或2所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针在检测vkorc1和cyp2c9基因多态性中的应用。6.一种非疾病诊断和/或治疗为目的的检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样本的核酸为模板，利用权利要求1或2所述的用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及荧光探针进行荧光pcr扩增，根据荧光pcr扩增结果进行判断。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括全血、口腔拭子或口腔黏膜脱落细胞中任意一种或至少两种的组合。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述荧光pcr扩增的体系还包括mix和dna聚合酶。9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光pcr扩增的扩增程序包括：(1)50-55℃，5-10min逆转录(2)93-95℃，4-5min预变性；(3)94-95℃，10-15s；58-60℃，30-60s；40-45个循环。10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光pcr扩增的熔解曲线程序为：93-95℃，10-25s；30-45℃，60-120s；0.5％-1％速率升温至95℃。

技术总结
本发明公开了一种用于检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及荧光探针。所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示的序列。本发明创造性设计了用于检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及荧光探针，能够快速、简便、准确、高效、实用、经济地在一管中检测VKORC1和CYP2C9*2/*3的3个基因型别，通过信标熔解曲线法对病毒的各型别进行有效区分，能够满足临床检验实际工作中相关位点检测的要求。作中相关位点检测的要求。作中相关位点检测的要求。


技术研发人员：杨文文 林灵 楼敬伟 周凯月 陶维维 汪帅男 王博伟 何顺清 汪梦竹 吕芳 何小明
受保护的技术使用者：上海华藤生物科技有限公司 上海宝藤医学检验所有限公司
技术研发日：2023.01.16
技术公布日：2023/7/22