一种广谱中和SARS-CoV-2的中和抗体P186-1H2及其应用的制作方法

一种广谱中和sars-cov-2的中和抗体p186-1h2及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种广谱中和sars-cov-2的中和抗体p186-1h2及其应用。


背景技术：

2.新冠感染是由新型冠状病毒感染引起，主要症状是低热、乏力和干咳，少数患者还有鼻塞、流鼻涕、腹泻等上呼吸道和消化道的症状，重症患者会发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克，以及代谢性酸中毒、凝血功能障碍及多器官功能衰竭。新型冠状病毒(sars-cov-2)属于β属冠状病毒。
3.sars-cov-2在传播过程中产生了许多突变，增强了其传播力和免疫逃逸，目前主要的流行自然突变株包括英国发现的alpha株、南非发现的beta株、巴西发现的gamma株等。针对新型冠状病毒的疫苗免疫也受到了一定的影响，灭活疫苗免疫血清对南非突变株中和活性下降了一半，mrna疫苗免疫血清针对南非突变株的中和活性下降了10倍左右，许多单克隆抗体也对突变株中和减弱或失去了中和活性。
4.单克隆抗体可工业化大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。目前亟需应对新型冠状病毒自然突变株带来的挑战，开发广谱抗新型冠状病毒的人源单克隆抗体，将为新型冠状病毒自然突变株感染提供更有效的预防和治疗手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种广谱中和sars-cov-2的中和抗体p186-1h2及其应用。
6.本发明提供了一种igg抗体，命名为p186-1h2抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次如seq id no：1中第26-33位、第51-58位、第97-111位所示；所述轻链中的轻链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次如seq id no：4中第27-38位、第56-58位、第95-103位所示。
7.具体的，所述重链可变区如seq id no：1所示。
8.具体的，所述轻链可变区如seq id no：4所示。
9.具体的，所述重链为如下(a)或(b)：(a)seq id no：2中第20-471位所示的蛋白质；(b)seq id no：2所示的蛋白质。
10.具体的，所述轻链为如下(c)或(d)：(c)seq id no：5中第20-239位所示的蛋白质；(d)seq id no：5所示的蛋白质。
11.编码所述igg抗体的基因也属于本发明的保护范围。
12.具体的，编码所述重链的基因为如下(1)或(2)：
13.(1)seq id no：3中第949-2307位核苷酸所示的dna分子；
14.(2)seq id no：3中第892-2307位核苷酸所示的dna分子。
15.具体的，编码所述轻链的基因为如下(3)或(4)：
16.(3)seq id no：6中第1095-1757位核苷酸所示的dna分子；
17.(4)seq id no：6中第1038-1757位核苷酸所示的dna分子。
18.本发明还保护以上任一所述igg抗体在制备用于抑制新型冠状病毒的药物中的应用。
19.本发明还保护一种用于抑制新型冠状病毒的药物，其活性成分为以上任一所述igg抗体。
20.本发明还保护以上任一所述igg抗体在制备用于中和新型冠状病毒的药物中的应用。
21.本发明还保护一种用于中和新型冠状病毒的药物，其活性成分为以上任一所述igg抗体。
22.本发明还保护以上任一所述igg抗体在制备用于预防和/或治疗新冠感染的药物中的应用。
23.本发明还保护一种用于预防和/或治疗新冠感染的药物，其活性成分为以上任一所述igg抗体。
24.以上任一所述新冠感染为新型冠状病毒感染。
25.以上任一所述新型冠状病毒为野生型新型冠状病毒或野生型新型冠状病毒的自然变异株。
26.以上任一所述新型冠状病毒为新型冠状病毒d614g突变株。
27.以上任一所述新型冠状病毒为新型冠状病毒野生株、新型冠状病毒alpha毒株、新型冠状病毒beta毒株、新型冠状病毒gamma毒株、新型冠状病毒delta毒株、新型冠状病毒delta plus毒株、新型冠状病毒mu毒株或新型冠状病毒奥密克戎毒株。
28.具体的，所述新型冠状病毒奥密克戎毒株为新型冠状病毒奥密克戎ba.1毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.2.75毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.3毒株或新型冠状病毒奥密克戎ba.4/5毒株。
29.本发明利用新型冠状病毒的spike蛋白作为钓饵，从感染者的外周血单个核细胞中筛选抗体生成的记忆b细胞，得到可同spike蛋白特异结合的单克隆抗体，命名为p186-1h2抗体。本发明提供的p186-1h2抗体具有广谱中和sars-cov-2的效果，对野生型新型冠状病毒以及自然变异株均具有强中和能力。本发明对于新型冠状病毒的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意义。
附图说明
30.图1为p186-1h2抗体对新型冠状病毒假病毒的中和活性。
具体实施方式
31.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。293f细胞和293t细胞均为市售人胚肾上皮细胞。pmd18-t载体为市售质粒载体。pcdna3.1(+)载体：invitrogen公司，产品目录号v790-20。
33.hace2-hela细胞(即文献中的“hela cell lines stably expressing the ace2molecules”)，记载于如下文献：wang,r.,zhang,q.,ge,j.,ren,w.,zhang,r.,lan,j.,ju,b.,su,b.,yu,f.,chen,p.,liao,h.,feng,y.,li,x.,shi,x.,zhang,z.,zhang,f.,ding,q.,zhang,t.,wang,x.&zhang,l.analysis of sars-cov-2variant mutations reveals neutralization escape mechanisms and the ability to use ace2 receptors from additional species.immunity 54,1611-1621.e1615,doi:10.1016/j.immuni.2021.06.003(2021).。
34.实施例1、p186-1h2抗体的发现和制备
35.一、p186-1h2抗体的发现
36.从sars-cov-2恢复期病人的外周血单个核细胞中分离记忆性b细胞，再扩增出记忆性b细胞的抗体基因得到抗体序列。通过大量比对、分析、制备和效果验证，本发明的发明人发现了1个新的具有优异活性的sars-cov-2igg抗体，将其命名为p186-1h2抗体。
37.p186-1h2抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：1所示(cdr1、cdr2和cdr3依次位于第26-33位、第51-58位、第97-111位；cdr1、cdr2和cdr3依次为gftfgdya、itwnsagi、akapkwggvdylfdy)。p186-1h2抗体的全长重链的氨基酸序列如seq id no：2所示；seq id no：2中，第1-19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20-141位氨基酸残基组成重链可变区，第142-471位氨基酸残基组成重链恒定区。
38.p186-1h2抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：4所示(cdr1、cdr2和cdr3依次位于第27-38位、第56-58位、第95-103位；cdr1、cdr2和cdr3依次为qsvlyssnnkny、was、qqyystpit)。p186-1h2抗体的全长轻链的氨基酸序列如seq id no：5所示；seq id no：5中，第1-19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20-132位氨基酸残基组成轻链可变区，第133-239位氨基酸残基组成轻链恒定区。
39.二、p186-1h2抗体的制备
40.(一)重组质粒的构建
41.重链dna分子为双链dna分子，如seq id no：3所示。seq id no：3中，第1-891位核苷酸组成启动子，第892-2307位核苷酸编码全长重链，第2308-2453位核苷酸组成终止子。将重链dna分子插入pmd18-t载体，得到重链表达载体。
42.轻链dna分子为双链dna分子，如seq id no：6所示。seq id no：6中，第1-1037位核苷酸组成启动子，第1038-1757位核苷酸编码全长轻链，第1758-1905位核苷酸组成终止子。将轻链dna分子插入pmd18-t载体，得到轻链表达载体。
43.(二)重组细胞的构建
44.将重链表达载体和轻链表达载体共转染293f细胞，得到重组细胞。
45.(三)抗体的制备
46.1、取步骤(二)得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的dmem培养基中培养72h，然后4℃、4000rpm离心30min，收集上清液。
47.2、亲和层析
48.亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；
49.亲和层析的柱填料：protein a beads(thermo，产品目录号10006d)；
50.操作步骤：
①
将300ml步骤1得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育16小时；
②
用60ml结合缓冲液洗涤柱子；
③
用30ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。
51.结合缓冲液：取甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，溶于水并用水定容至1l，用氢氧化钠调ph至8.0。
52.洗脱缓冲液：取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500ml，用盐酸调ph至3.0。
53.3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为pbs缓冲液(ph7.2、10mm)，得到p186-1h2抗体溶液(抗体浓度约为1mg/ml)。
54.实施例2、中和试验
55.一、新型冠状病毒假病毒的制备
56.表达新型冠状病毒膜蛋白的质粒和骨架质粒pnl4-3r-e-luciferase共转染293t细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的新型冠状病毒假病毒，其感染性同新型冠状病毒活病毒相似。骨架质粒pnl4-3r-e-luciferase，即含有luciferase的骨架质粒pnl4-3r-e(即文献中的vector with the luciferase gene containing backbone pnl4-3r-e)记载于如下文献：wang q,liu l,ren w,gettie a,wang h,liang q,shi x,montefiori dc,zhou t,zhang l.cell rep.2019。
57.将新型冠状病毒膜蛋白的编码基因插入pcdna3.1(+)载体的bamhii和ecori酶切位点之间，得到表达新型冠状病毒膜蛋白的质粒。将表达新型冠状病毒膜蛋白的质粒和骨架质粒pnl4-3r-e-luciferase共转染293t细胞，37℃静置孵育(采用含10％胎牛血清的dmem培养基)，转染60小时后收集细胞培养上清，即为含有新型冠状病毒假病毒的病毒液。分别制备12种新型冠状病毒毒株的假病毒的病毒液。12种新型冠状病毒毒株指的是新型冠状病毒d614g突变株、新型冠状病毒alpha毒株、新型冠状病毒beta毒株、新型冠状病毒gamma毒株、新型冠状病毒delta毒株、新型冠状病毒delta plus毒株、新型冠状病毒mu毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.1毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.2.75毒株、新型冠状病毒奥密克戎ba.3毒株和新型冠状病毒奥密克戎ba.4/5毒株。
58.新型冠状病毒野生株(wt)的膜蛋白如seq id no：7所示。新型冠状病毒野生株的膜蛋白的编码基因记载于genbank：mn908947.3(18-mar-2020)中的全基因组中的第21563-25384位。
59.新型冠状病毒d614g突变株的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：d614g。新型冠状病毒d614g突变株的膜蛋白的编码基因如seq id no：8所示。
60.新型冠状病毒alpha毒株(pango lineage b.1.1.7)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：69-70del(hv)、144del(y)、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h。新型冠状病毒alpha毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_601443。
61.新型冠状病毒beta毒株(pango lineage b.1.351)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：l18f、d80a、d215g、242-244del(lla)、s305t、k417n、e484k、n501y、
d614g、a701v。新型冠状病毒beta毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_700450。
62.新型冠状病毒gamma毒株(pango lineage p.1)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、d614g、h655y、t1027i、v1176f。新型冠状病毒gamma毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_792681。
63.新型冠状病毒delta毒株(pango lineage b.1.617.2)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：t19r、g142d、156-157del(ef)、r158g、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n。新型冠状病毒delta毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_1534938。
64.新型冠状病毒delta plus毒株(pango lineage ay.x)的膜蛋白相对于delta毒株的膜蛋白增加了如下突变：k417n。新型冠状病毒delta plus毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_3019629。
65.新型冠状病毒mu毒株(pango lineage b.1.621)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：t95i、y144t、y145s、ins146n、r346k、e484k、n501y、d614g、p681h、d950n。新型冠状病毒mu毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_3987640。
66.新型冠状病毒奥密克戎ba.1毒株(pango lineage ba.1)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：a67v、δ69-70(hv)、t95i、g142d、δ143-145(vyy)、δ211(n)、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k、l981f。新型冠状病毒奥密克戎ba.1毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_6752027。
67.新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1毒株(pango lineage ba.2.12.1)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：t19i、24-26del(lpp)、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452q、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_12560123。
68.新型冠状病毒奥密克戎ba.2.75毒株的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：t19i、del24-26(lpp)、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。新型冠状病毒奥密克戎ba.2.75毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_14393635。
69.新型冠状病毒奥密克戎ba.3毒株(pango lineage ba.3)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：a67v、del69-70(hv)、t95i、g142d、del143-145(vyy)、211del(n)、l212i、g339d、s371f、s373p、s375f、d405n、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。新型冠状病毒奥密克戎ba.3毒株的膜蛋白的编码基因记载于gisaid:epi_isl_7740765。
70.新型冠状病毒奥密克戎ba.4/5毒株(pango lineage ba.4)的膜蛋白相对于野生株的膜蛋白发生了如下突变：t19i、24-26del(lpp)、a27s、del69-70(hv)、g142d、v213g、
g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。新型冠状病毒奥密克戎ba.4/5毒株的膜蛋白的编码基因记载于epi_isl_12559461。
71.二、抗体的中和活性检测
72.供试病毒液：分别为步骤一制备的12种新型冠状病毒毒株的假病毒的病毒液。
73.1、取实施例1制备的p186-1h2抗体溶液，用pbs缓冲液(ph7.2、10mm)进行稀释，得到多种浓度的抗体稀释液。
74.2、取96孔细胞培养板，每孔加入100微升抗体稀释液和50微升供试病毒液(50微升供试病毒液中的病毒浓度为1
×
104tcid50/ml)，37℃静置孵育1小时。用等体积pbs缓冲液(ph7.2、10mm)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用等体积含10％胎牛血清的dmem培养基代替供试病毒液，作为细胞对照。
75.3、完成步骤2后，取所述细胞培养板，每孔接种100微升hace2-hela细胞悬液(用于制备细胞悬液的溶剂为含10％胎牛血清的dmem培养基，细胞悬液中的hace2-hela细胞浓度为2
×
105个细胞/ml)，37℃静置孵育64小时。
76.4、完成步骤3后，取所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入150微升裂解液(微格拉斯生物技术，货号t003，按说明书操作)，37℃静置孵育5分钟。
77.5、完成步骤4后，取所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。
78.每个处理设置多个复孔。
79.中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧光强度-细胞对照的荧光强度)]
×
100％。
[0080]
中和活性结果见图1。图1中：纵坐标为中和活性(％)；横坐标为抗体浓度(μg/ml)以10为底的对数，该抗体浓度指的是步骤2中100微升抗体稀释液和50微升供试病毒液组成的混合体系中的抗体浓度。
[0081]
利用prism 5软件计算中和活性为50％时的抗体浓度，即抗体的ic50值。
[0082]
p186-1h2抗体对于12种新型冠状病毒毒株的假病毒的ic50值(单位为：ng/ml)见表1。
[0083]
表1
[0084][0085][0086]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]

技术特征：
1.一种igg抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次如seq id no：1中第26-33位、第51-58位、第97-111位所示；所述轻链中的轻链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次如seq id no：4中第27-38位、第56-58位、第95-103位所示。2.如权利要求1所述的igg抗体，其特征在于：所述重链可变区如seq id no：1所示；所述轻链可变区如seq id no：4所示。3.如权利要求2所述的igg抗体，其特征在于：所述重链为如下(a)或(b)：(a)seq id no：2中第20-471位所示的蛋白质；(b)seq id no：2所示的蛋白质；所述轻链为如下(c)或(d)：(c)seq id no：5中第20-239位所示的蛋白质；(d)seq id no：5所示的蛋白质。4.编码权利要求1至3中任一所述igg抗体的基因。5.权利要求1或2或3所述igg抗体在制备用于抑制新型冠状病毒的药物中的应用。6.一种用于抑制新型冠状病毒的药物，其活性成分为权利要求1或2或3所述igg抗体。7.权利要求1或2或3所述igg抗体在制备用于中和新型冠状病毒的药物中的应用。8.一种用于中和新型冠状病毒的药物，其活性成分为权利要求1或2或3所述igg抗体。9.权利要求1或2或3所述igg抗体在制备用于预防和/或治疗新冠感染的药物中的应用。10.一种用于预防和/或治疗新冠感染的药物，其活性成分为权利要求1或2或3所述igg抗体。

技术总结
本发明公开了一种广谱中和SARS-CoV-2的中和抗体P186-1H2及其应用。本发明提供了一种IgG抗体，命名为P186-1H2抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如SEQ ID NO：1中第26-33位、第51-58位、第97-111位所示；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次如SEQ ID NO：4中第27-38位、第56-58位、第95-103位所示。本发明提供的P186-1H2抗体具有广谱中和SARS-CoV-2的效果，对野生型新型冠状病毒以及自然变异株均具有强中和能力。本发明对于新型冠状病毒的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意义。义。


技术研发人员：张绮 张政 张林琦 鞠斌 史宣玲 周兵
受保护的技术使用者：深圳市第三人民医院
技术研发日：2023.02.01
技术公布日：2023/7/22