一种UDP-糖基转移酶及其在合成α-常春藤苷糖苷化合物中的应用

一种udp-糖基转移酶及其在合成
α-常春藤苷糖苷化合物中的应用
技术领域：
1.本发明涉及一种人工计算获得的udp-糖基转移酶及编码基因，同时涉及将该udp-糖基转移酶与甘草来源的蔗糖合酶、拟南芥来源的udp-鼠李糖(udp-rha)合酶和双功能鼠李糖合酶偶联合成多种α-常春藤苷糖苷衍生物的方法，属于生物工程与技术领域。


背景技术：

2.α-常春藤苷是一种来源于常春藤、预知子、白头翁等植物的五环三萜化合物，因其在治疗肝癌、肺癌、胃癌、大肠癌、食管癌的等多种癌症中具有诱导细胞凋亡、干扰细胞糖酵解、抑制细胞生长等药理活性而作为临床药物的候选分子。但是，α-常春藤苷碳骨架的强疏水性极大地影响其水溶性和生物利用度，限制了α-常春藤苷的进一步推广和应用。因此，以α-常春藤苷为前体开发低毒性、高药效的新型α-常春藤苷糖基衍生物类药物的策略受到广泛关注。糖基修饰作为一种天然产物改性的重要手段，通过在特定位点引入糖基，使其疏水部分具有更多的亲水性羧基和羟基，从而获得更有效的糖苷衍生物而成为近年来的研究热点。
3.相较于化学合成法实现α-常春藤苷存在反应步骤复杂、反应条件苛刻、涉及多种有毒有害的化学试剂等问题，生物酶法具有底物特异性强、反应条件温和及环境友好等优点。udp-糖基转移酶(udp-glycosyltransferase,ugt)作为一种高效的生物催化剂，可催化多种天然产物糖基修饰。然而，目前暂无报道可催化α-常春藤苷2"-oh位点糖基修饰的ugt。因此，挖掘对α-常春藤苷具有催化活性的ugt具有重要意义。
4.另一方面，糖基转移酶催化底物所需要的udp-糖基供体普遍价格昂贵，极大地限制了其在五环三萜糖苷衍生物合成中的大规模工业生产。偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶和糖基转移酶构建udp循环再生体系可实现利用廉价易获得的蔗糖作为初始糖基供体驱动udp-rha的持续供应，极大地降低鼠李糖糖苷衍生物的生产成本。类似的研究工作虽已逐渐引起越来越多的关注，但目前利用udp循环再生体系合成α-常春藤苷糖苷衍生物的研究尚无报道。
5.因此，寻找合适的ugt来实现α-常春藤苷糖基修饰将极大地丰富其化合物的分子结构，同时利用偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶、糖基转移酶的多酶体系催化α-常春藤苷生成α-常春藤苷鼠李糖糖基化衍生物，有利于推动α-常春藤苷糖苷化合物的规模化工业生产。


技术实现要素：

6.本发明的目的是计算合成并表征一种新型的udp-糖基转移酶，该udp-糖基转移酶能催化α-常春藤苷的2"-oh多种糖基修饰，同时提供一种偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶和udp-糖基转移酶的udp-rha循环再生体系用于低成本合成α-常春藤苷鼠李糖苷化合物。
7.第一方面，本发明提供一种通过计算合成的udp-糖基转移酶ugt91h_a1，它的氨基酸序列如序列表中seq id no.1所述；一种编码udp-糖基转移酶ugt91h_a1的基因，它是序列表中seq id no.2所述的核苷酸序列。
8.第二方面，本发明提供一种udp-糖基转移酶ugt91h_a1用于合成α-常春藤苷鼠李糖糖基化衍生物：常春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖(结构如式一所示)、α-常春藤苷木糖糖基化衍生物：常春藤苷元3-o-β-d木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖(结构如式二所示)、α-常春藤苷葡萄糖糖基化衍生物：常春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖(结构如式三所示)。
[0009][0010]
第三方面，本发明提供一种偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶和糖基转移酶的体外酶催化体系，用以低成本合成常春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖(结构如式一所示)。
[0011]
附图说明:
[0012]
图1为本发明实施例3、6中蔗糖合酶gusus1-δ9,udp-鼠李糖合酶atrhm2,双功能鼠李糖合酶atnrs/er,ugt91h_a1蛋白表达的sds-page图。图中从左到右泳道分别为蛋白marker(m)、gusus1-δ9(1),atrhm2(2),atnrs/er(3),ugt91h_a1(4)。
[0013]
图2为本发明实施例4中糖基转移酶ugt91h_a1催化α-常春藤苷分别生成常春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖、3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖、3-o-β-d-葡萄基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的高效液相色谱图。图中a：α-常春藤苷标准品；b:ugt91h_a1催化α-常春藤苷与udp-rha反应产物；c:ugt91h_a1催化α-常春藤苷与udp-木糖(udp-xyl)反应产物；d:ugt91h_a1催化α-常春藤苷与udp-葡萄糖(udp-glc)反应产物。
[0014]
图3为本发明实施例5中偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶和糖基转
移酶的多酶催化体系用以合成α-常春藤苷鼠李糖糖基化衍生物的过程原理示意图。
[0015]
图4为本发明实施例5中偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶和糖基转移酶的体外酶催化体系的高效液相色谱图。图中a:α-常春藤苷标准品；b:偶联催化体系反应产物。
[0016]
图5为本发明实施例6中合成的常春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的高效液相色谱-质谱联用仪鉴定结果。
[0017]
图6为本发明实施例6中合成的3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的高效液相色谱-质谱联用仪鉴定结果。
[0018]
图7为本发明实施例6中合成的3-o-β-d-葡萄基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的高效液相色谱-质谱联用仪鉴定结果。
[0019]
图8为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的1h谱图。
[0020]
图9为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的
13
c谱图。
[0021]
图10为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的dept-135谱图。
[0022]
图11为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的hsqc谱图。
[0023]
图12为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的hmbc谱图。
[0024]
图13为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的1h谱图。
[0025]
图14为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的
13
c谱图。
[0026]
图15为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的dept-135谱图。
[0027]
图16为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的hsqc谱图。
[0028]
图17为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的hmbc谱图。
[0029]
图18为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的1h谱图。
[0030]
图19为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的
13
c谱图。
[0031]
图20为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的dept-135谱图。
[0032]
图21为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的hsqc谱图。
[0033]
图22为本发明实施例6中合成的春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基
(1-2)-α-l-阿拉伯糖的hmbc谱图。
具体实施方式：
[0034]
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0035]
实施例1：糖基转移酶ugt91h_a1、蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2与双功能鼠李糖合酶atnrs/er的获取
[0036]
a.糖基转移酶ugt91h_a1基因的获取
[0037]
根据ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得ugt91h亚家族蛋白序列，利用祖先酶序列重构分析得到ugt91h_a1蛋白序列，通过密码子优化，化学合成优化后的糖基转移酶ugt91h_a1基因片段，如seq id no.2所示。seq id no.2所示片段表达蛋白质的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0038]
b.蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2、双功能鼠李糖合酶atnrs/er基因的获取
[0039]
根据蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2(ncbi gene id：841785)、双功能鼠李糖合酶atnrs/er(ncbi gene id：842603)的基因序列，通过密码子优化，化学合成优化后的蔗糖合酶gusus1-δ9基因片段，如seq id no.4所示，udp-rha合酶atrhm2基因片段，如seq id no.6所示，atnrs/er基因片段，如seq id no.8所示。seq id no.4所示片段表达的氨基酸序列如seq id no.3所示，seq id no.6所示片段表达的氨基酸序列如seq id no.5所示，seq id no.8所示片段表达的氨基酸序列如seq id no.7所示。
[0040]
实施例2：构建表达糖基转移酶ugt91h_a1、蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2、双功能鼠李糖合酶atnrs/er的大肠杆菌工程菌
[0041]
为构建表达糖基转移酶ugt91h_a1、蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2、双功能鼠李糖合酶atnrs/er基因的大肠杆菌工程菌，分别设计系列引物进行pcr扩增并分别得到糖基转移酶ugt91h_a1基因片段(seq id no.2所示)、蔗糖合酶gusus1-δ9基因片段(seq id no.4所示)、udp-rha合酶atrhm2基因片段(seq id no.6所示)、双功能鼠李糖合酶atnrs/er基因片段(seq id no.8所示)并加入酶切位点bamhi、xhoi和保护碱基。
[0042]
pcr(多聚酶链式反应)反应体系为：模板1μl，上下游引物各2μl，pcr聚合酶25μl，用双蒸水补足50μl。pcr反应条件：预变性98℃1min，变性98℃10s，退火55℃5s，延伸72℃2min 30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。
[0043]
将克隆得到的糖基转移酶ugt91h_a1基因、蔗糖合酶gusus1-δ9基因、udp-rha合酶atrhm2基因、双功能鼠李糖合酶atnrs/er基因分别使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(thermo公司)进行纯化回收。对原核表达载体pet28a用限制性内切酶bamhⅰ、xhoⅰ进行双酶切，酶切体系：bamhⅰ2μl和xhoⅰ2μl，10
×
消化缓冲液5μl，dna片段30μl，用双蒸水补足50μl的酶切体系,酶切条件为37℃，2h。酶切后使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收酶切产物。
[0044]
使用gibson组装法对糖基转移酶ugt91h_a1基因、蔗糖合酶gusus1-δ9基因、udp-rha合酶atrhm2基因、双功能鼠李糖合酶atnrs/er基因分别与线性化的载体pet28a进行无缝连接。将连接产物转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布于含有100mg/l卡那霉素的固体lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，20g/l琼脂糖)平板上，37℃过
夜培养。
[0045]
采用菌落pcr和测序方法鉴定转化子。菌落pcr体系：模板lb平板单菌落，上下游引物各1μl，2
×
taq mix(北京聚合美生物科技有限公司)10μl，用双蒸水补足20μl。pcr条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃2min 30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。经菌落pcr验证含有正确目标条带的转化子送dna测序(苏州金唯智生物科技有限公司)，确定重组质粒pet28a-ugt91h_a1、pet28a-gusus1-δ9、pet28a-atrhm2、pet28a-atnrs/er成功转化至大肠杆菌bl21(de3)。
[0046]
实施例3：大肠杆菌基因工程菌的发酵及糖基转移酶的纯化
[0047]
a.大肠杆菌基因工程菌的发酵
[0048]
(1)挑取鉴定正确的大肠杆菌工程菌接种于50ml含有100mg/l卡那霉素的lb液体培养基(蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l)中37℃，200rpm过夜培养。
[0049]
(2)取过夜培养的菌液4ml接种于400ml含有100mg/l卡那霉素的lb液体培养基中培养2-3h至od
600
＝0.6，培养条件37℃，200rpm。
[0050]
(3)加入诱导剂iptg，使其终浓度为0.1mm,16℃，200rpm过夜培养。
[0051]
(4)将获得的发酵液9000rpm离心3min后，收集菌体。
[0052]
(5)15ml pbs缓冲液(50mm，ph 7.0)重悬菌体，用低温高压细胞破碎机裂解菌体。
[0053]
(6)将裂解的菌体在4℃，12000g离心10min，弃沉淀，收集上清，获得含有蔗糖合酶的粗酶液。
[0054]
b.酶的纯化
[0055]
用蛋白纯化系统akta purifier进行蛋白纯化。
[0056]
(1)样品前处理：将得到的粗酶液，经0.45μm孔径过滤器过滤后4℃保存留用。
[0057]
(2)镍柱前处理：使用不少于10倍柱体积的结合缓冲液(25mm咪唑，50mm pbs，ph 7.0)以1ml/min的流速冲洗平衡镍柱。
[0058]
(3)上样：样品以0.5ml/min的流速通过衡流泵抽送进镍柱中。
[0059]
(4)梯度洗脱：按照洗脱缓冲液(1m咪唑)与结合缓冲液不同梯度的比例洗脱镍柱，流速为1ml/min，并观察监测od
280
值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液并将通过sds-page检测后确定目的蛋白所在。
[0060]
(5)蛋白浓缩与浓度测定：用超滤管浓缩蛋白，使用nanodrop 2000检测蛋白浓度，sds-page确定目标蛋白分子量。
[0061]
实施例4：糖基转移酶ugt91h_a1催化α-常春藤苷糖基修饰的表征
[0062]
取20μg实施例3纯化的酶ugt91h_a1(50mm pbs缓冲液，ph 7.0)，1mm udp-糖(udp-rha，udp-xyl或udp-glc)的100μl体系在35℃金属浴中反应5h，然后加入400μl甲醇终止反应。反应产物使用岛津lc-30a型超高效液相色谱仪uhplc系统进行检测，色谱柱型号为shim-pack gist-hp c18(2.1
×
150，3μm)。uhplc条件如下：流动相a：乙腈(acn)，流动相b：1
‰
磷酸；0min，20％ acn；3min,35％ acn；4.0min,50％ acn；8.0min,65％ acn；12.0min,85％ acn；15.0min,95％ acn；16.0min,20％ acn；20min,80％ acn，检测波长为203nm。
[0063]
实施例5：偶联蔗糖合酶、udp-rha合酶、双功能鼠李糖合酶和糖基转移酶的udp-rha再生体系
[0064]
以α-常春藤苷为底物，同时加入蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2、双功
能鼠李糖合酶atnrs/er和糖基转移酶ugt91h_a1，添加尿苷二磷酸(udp)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)、蔗糖，35℃水浴反应5h，可实现α-常春藤苷的2"-oh鼠李糖基修饰，合成常春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖。
[0065]
具体地，配制200μl反应体系：gusus1-δ9纯酶液(终浓度1.5mg/ml)、atrhm2纯酶液(终浓度3mg/ml)、atnrs/er纯酶液(终浓度3mg/ml)、ugt91h_a1纯酶液(终浓度1mg/ml)、蔗糖(6mm)、udp(0.6mm)、nad
+
(1.2mm)、α-常春藤苷(200μm)以及pbs缓冲液(50mm，ph 7.0)。置于35℃水浴反应5h，加入300μl甲醇混匀，12000rpm离心10min去除沉淀，uhplc检测样品。
[0066]
实施例6：糖基化衍生物的制备及结构表征
[0067]
(1)a.常春藤苷元3-o-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的制备
[0068]
方法一：按实施例4的操作流程，在100μl反应体系中(50mm pbs缓冲液，ph 7.0)，加入20μg实施例3纯化的酶ugt91h_a1，1mm udp-rha和200μmα-常春藤苷，将200个相同反应体系在35℃金属浴中反应5h，然后将反应体系加至10ml甲醇终止反应。
[0069]
方法二：按实施例5的操作流程，先加入蔗糖合酶gusus1-δ9、udp-rha合酶atrhm2、双功能鼠李糖合酶atnrs/er和糖基转移酶ugt91h_a1，向混合酶液中加入蔗糖(6mm)、udp(0.6mm)、nad
+
(1.2mm)、α-常春藤苷(200μm)(分多次加入，反应后每隔2h取样uhplc检测，计算α-常春藤苷转化率，若被完全转化可补加α-常春藤苷)，35℃水浴摇床170rpm，反应10h。
[0070]
b.常春藤苷元3-o-β-d-木糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖与常春藤苷元3-o-β-d-葡萄糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的制备：按实施例4的操作流程，在100μl反应体系(50mm pbs缓冲液，ph 7.0)中加入20μg实施例3纯化的酶ugt91h_a1，1mm udp-xyl或udp-glc和200μmα-常春藤苷，将200个相同反应体系在35℃金属浴中反应5h，然后将反应体系加至10ml甲醇终止反应。
[0071]
(2)将反应产物15000rpm离心10min，用10ml甲醇将沉淀涡旋振荡充分重悬，并使用0.22μm孔径有机滤膜过滤制成样品。
[0072]
(3)用半制备液相分离纯化产物，方法如下：
[0073]
流动相配比，a：乙腈，b：1
‰
甲酸水溶液，a:b＝65:35；流动相溶液均需经过0.22μm孔径滤膜过滤并超声波震荡脱气。流速为3ml/min，检测波长为203nm。液相色谱柱为岛津c18硅胶柱(20
×
250mm，5μm)。取步骤1所得样品2ml，上机分离，对uv线中每个峰进行液体的收集，并用uhplc进行检测以判断不同α-常春藤苷糖基化衍生物对应的保留时间并判断纯度。收集完所有制备样品后，使用真空浓缩仪进行浓缩干燥成粉末，放于4℃保存。
[0074]
(4)三种α-常春藤苷糖基化衍生物粉末溶于甲醇中，使用高效液相色谱-质谱联用仪进行分子量鉴定，同时产物溶于氘代甲醇于bruker ascend 700m核磁共振波谱仪进行1h谱、
13
c谱、dept-135谱、hsqc谱、hmbc谱分析，并确定结构信息。

技术特征：
1.一种udp-糖基转移酶ugt91h_a1，其特征在于udp-糖基转移酶ugt91h_a1的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的udp-糖基转移酶，其特征在于编码udp-糖基转移酶ugt91h_a1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.如权利要求1所述的udp-糖基转移酶ugt91h_a1在合成α-常春藤苷糖苷化合物中的应用，其特征在于所述α-常春藤苷鼠李糖苷化合物为如式1所示的结构，α-常春藤苷木糖苷化合物为如式2所示的结构，α-常春藤苷葡萄糖苷化合物为如式3所示的结构。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于制备α-常春藤苷鼠李糖苷化合物(式1所示的结构)的反应体系包括蔗糖合酶、udp-糖基转移酶、udp-鼠李糖合酶、双功能鼠李糖合酶、蔗糖、尿苷二磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和α-常春藤苷。

技术总结
本发明涉及一种人工计算的UDP-糖基转移酶UGT91H_A1基因及其编码的蛋白。本发明通过对UDP-糖基转移酶UGT91H亚家族进行祖先酶序列重构，计算获得一种新型UDP-糖基转移酶的基因UGT91H_A1及其编码的蛋白，在大肠杆菌细胞中成功异源表达，并验证其催化合成常春藤苷元3-O-α-L-鼠李糖基(1-2)-α-L-鼠李糖基(1-2)-α-L-阿拉伯糖、常春藤苷元3-O-β-D木糖基(1-2)-α-L-鼠李糖基(1-2)-α-L-阿拉伯糖、常春藤苷元3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖基(1-2)-α-L-阿拉伯糖的功能，同时偶联蔗糖合酶GuSUS1-Δ9、UDP-Rha合酶AtRHM2、双功能鼠李糖合酶AtNRS/ER和UDP-糖基转移酶UGT91H_A1构建UDP-Rha循环再生系统，该系统可催化α-常春藤苷糖苷化合物合成。本发明填补了五环三萜α-常春藤苷C-3母核上2"-OH糖基化研究方面的空白，为后续合成具有潜在临床价值的新型α-常春藤苷糖苷化合物的相关研究提供了参考和依据，同时构建的UDP-Rha循环再生体系也极大降低了常春藤苷元3-O-α-L-鼠李糖基(1-2)-α-l-鼠李糖基(1-2)-α-l-阿拉伯糖的制备成本。本。本。


技术研发人员：冯旭东 简行 李春 孙秋艳 徐文涛
受保护的技术使用者：北京理工大学
技术研发日：2023.01.07
技术公布日：2023/7/22