具有增强的ADCC的抗CTLA-4抗体增强对疫苗的免疫应答的用途的制作方法

具有增强的adcc的抗ctla-4抗体增强对疫苗的免疫应答的用途
1.本技术是申请日为2018年2月27日、中国申请号为201880014676.2、发明名称为“具有增强的adcc的抗ctla-4抗体增强对疫苗的免疫应答的用途”的发明申请的分案申请。
发明领域
2.本技术公开了增强对疫苗的免疫应答的方法，具体地是免疫调节性抗体作为疫苗佐剂的用途。
3.发明背景
4.疫苗旨在引出对媒介物(agent)(诸如病原体或肿瘤细胞)的免疫应答。然而，疫苗并不总是引出免疫应答。佐剂是连同疫苗一起施用以增强免疫应答的化合物，但其通常增强体液免疫而非细胞免疫，而细胞免疫对癌症疫苗的有效性尤其重要。ikeda等(2004)cancer sci.95:697。已经提出将针对免疫调节性受体的抗体作为疫苗佐剂。参见keler等(2003)j.immunol.171:6251；ponte等(2010)immunol.130:231；kwek等(2012)nat.rev.cancer 12:289；wo2009/100140；wo 2014/089113。还参见临床试验nct00113984(其使用抗ctla-4抗体伊匹单抗作为前列腺癌的治疗性疫苗的潜在佐剂)。然而，现有的佐剂并不总是完全有效。
5.需要具有疫苗佐剂活性改善的药剂。此类改进的佐剂将理想地增强在给定剂量的疫苗下对疫苗的免疫应答的量级，减少实现期望水平的免疫应答所需的疫苗量，和/或增加免疫应答的持续时间。此类药剂将不仅优选地增强体液免疫应答，还增强细胞免疫应答。
6.发明概述
7.本发明提供了使用具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体来增强对疫苗的免疫应答的方法。本发明的具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体连同疫苗(诸如肿瘤疫苗)一起施用。
8.在一个实施方案中，该具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体分别包含seq id no:3
–
8的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3序列。在另一实施方案中，该具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体分别包含seq id no:9和10的vh和v
l
序列。在又一实施方案中，该具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体包含seq id no:11或12的hc序列，和seq idno:13的lc序列。
9.在可替换的实施方案中，该具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体分别包含seq id no:14
–
19的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3序列。在另一实施方案中，该具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体分别包含seq id no:20和21的vh和v
l
序列。在又一实施方案中，该具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体包含seq id no:22或23的hc序列，和seq id no:24的lc序列。
10.相对于伊匹单抗的adcc活性来量度增强的adcc。在多种实施方案中，本发明的抗ctla-4抗体与伊匹单抗相比，表现出2倍、10倍或更高的adcc。在一个实施方案中，通过在实施例2中所述的nk92细胞介导的裂解测定来测量adcc。在一个实施方案中，本发明的具有增
强的adcc的抗ctla-4抗体在实施例2中所述的测定中表现出比伊匹单抗的ec50低至少2倍的ec50。在另一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体在实施例2中所述的测定中表现出比伊匹单抗的ec50低至少10倍的ec50。
11.在其他实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体具有减少的岩藻糖基化，或是低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的。在又一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体包含i)fc区的一个或多个氨基酸突变以增强fcγr结合，且任选地ii)减少的或消除的岩藻糖基化。
12.在一个实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体是具有减少的岩藻糖基化的伊匹单抗。在另一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体是低岩藻糖基化的伊匹单抗。在又另一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体是非岩藻糖基化的伊匹单抗。
13.在另一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体是具有减少的岩藻糖基化的曲美木单抗(tremelimumab)。在另一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体是低岩藻糖基化的曲美木单抗。在又另一实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体是非岩藻糖基化的曲美木单抗。
14.在一些实施方案中，本发明的具有增强的adcc的抗ctla-4抗体包括至少一个增强与活化性fcγ受体(fcγr)结合的氨基酸突变(诸如突变或突变簇)，所述氨基酸突变选自下组：i)g236a，ii)s239d，iii)f243l，iv)e333a，v)g236a/i332e，vi)s239d/i332e，vii)s267e/h268f，viii)s267e/s324t，ix)h268f/s324t，x)g236a/s239d/i332e，xi)s239d/a330l/i332e，xii)s267e/h268f/s324t和xiii)g236a/s239d/a330l/i332e。在又一实施方案中，包含一个或多个增强adcc的氨基酸的具有增强的adcc活性的抗人ctla-4抗体具有减少的岩藻糖基化，或是低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的。
15.本发明还包括如下项：
16.1.一种增强用疫苗治疗的人受试者中对所述疫苗的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用具有伊匹单抗(ipilimumab)的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体。
17.2.项1的抗体，其中该抗体包含：
18.a.由序列seq id no:3组成的cdrh1；
19.b.由序列seq id no:4组成的cdrh2；
20.c.由序列seq id no:5组成的cdrh3；
21.d.由序列seq id no:6组成的cdrl1；
22.e.由序列seq id no:7组成的cdrl2；和
23.f.由序列seq id no:8组成的cdrl3。
24.3.项2的抗体，其中该抗体包含：
25.a.由序列seq id no:9组成的重链可变结构域；和
26.b.由序列seq id no:10组成的轻链可变结构域。
27.4.项3的抗体，其中该抗体包含：
28.a.由序列seq id no:12组成的重链；和
29.b.由序列seq id no:13组成的轻链。
30.5.项4的抗体，其中该抗体包含：
31.a.包含序列seq id no:11的重链；和
32.b.包含序列seq id no:13的轻链。
33.6.项1-5中任一项的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体在实施例2中详述的nk92细胞介导的裂解测定中表现出比伊匹单抗的细胞裂解的ec50低至少2倍的细胞裂解的ec50。
34.7.项6的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体在实施例2中详述的nk92细胞介导的裂解测定中表现出比伊匹单抗的细胞裂解的ec50低至少10倍的细胞裂解的ec50。
35.8.项1的抗体，其中该抗体包含：
36.a.由序列seq id no:14组成的cdrh1；
37.b.由序列seq id no:15组成的cdrh2；
38.c.由序列seq id no:16组成的cdrh3；
39.d.由序列seq id no:17组成的cdrl1；
40.e.由序列seq id no:18组成的cdrl2；和
41.f.由序列seq id no:19组成的cdrl3。
42.9.项8的抗体，其中该抗体包含：
43.a.由序列seq id no:20组成的重链可变结构域；和
44.b.由序列seq id no:21组成的轻链可变结构域。
45.10.项9的抗体，其中该抗体包含：
46.a.由序列seq id no:23组成的重链；和
47.b.由序列seq id no:24组成的轻链。
48.11.项9的抗体，其中该抗体包含：
49.a.包含序列seq id no:22的重链；和
50.b.包含序列seq id no:24的轻链。
51.12.项8-11中任一项的的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体在实施例2中详述的nk92细胞介导的裂解测定中表现出比伊匹单抗的细胞裂解的ec50低至少2倍的细胞裂解的ec50。
52.13.项12的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体在实施例2中详述的nk92细胞介导的裂解测定中表现出比伊匹单抗的细胞裂解的ec50低至少10倍的细胞裂解的ec50。
53.14.项1-13中任一项的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体具有减少的岩藻糖基化。
54.15.项14的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体是低岩藻糖基化(hypofucosylated)或非岩藻糖基化的。
55.16.项15的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体是非岩藻糖基化的。
56.17.项1-13中任一项的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体包含igg1重链恒定区，该igg1重链恒定区包含选自下组的突变或突变簇：i)g236a；ii)s239d；iii)f243l；iv)e333a；v)g236a/i332e；vi)s239d/i332e；vii)s267e/
h268f；viii)s267e/s324t；ix)h268f/s324t；x)g236a/s239d/i332e；xi)s239d/a330l/i332e；xii)s267e/h268f/s324t；和xiii)g236a/s239d/a330l/i332e。
57.18.项17的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体具有减少的岩藻糖基化。
58.19.项18的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体是低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的。
59.20.项19的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体是非岩藻糖基化的。
60.附图简述
61.附图中提供的实验结果衍生自实施例1中描述的毛里求斯食蟹猴实验的3个独立重复(重复a、重复b和重复c)。重复a，其包括4只食蟹猴/组，提供用于获得图1a、2a、3a、4a、5a、7a、8a、和9a中显示的数据的样品。重复b，其包括6只食蟹猴/组，提供用于获得图1b、2b、3b、4b、5b、6a(无来自重复a的nef lt9数据)、7b、8b、9b和11中显示的数据的样品。重复c，其包括6只食蟹猴/组，提供用于获得图1c、2c、3c、4c、5c、6b(无来自重复a的nef lt9数据)、7c、8c、和9c中显示的数据的样品。尽管由于单独的实验方案中的微小差异(例如将重复a和b与重复c比较)，数据点的具体数值可在重复之间变化，但定性趋势以及因此相关的科学结论是相同的。
62.对于非岩藻糖基化的抗ctla-4抗体，重复b和c采用了抗人ctla-4mab伊匹单抗然而重复a采用了伊匹单抗的igg1f同种异型变体。两种同种异型在本文的实验中在功能上是等同的。
63.图1a-1c显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的全血中的facs分选的nef rm9特异性cd8
+
cd3
+
淋巴细胞的纵向追踪。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如实施例1中更详细描述的。基于其与rm9肽负载的mhc i类四聚体的结合来选择nef rm9
+
细胞。“惰性的”抗ctla-4是指去除了n连接的糖基化位点而生成缺乏效应子功能的非糖基化fc区的n297a重链序列变体。在此图中和报道使用“惰性的”抗ctla-4的每个其他图中，以10mg/kg施用该抗体。在所有图1a-1c中，10mg/kg抗ctla4-nf(向上指向的三角形)是最上面的曲线。
64.图2a-2c显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的全血中的facs分选的gag gw9特异性cd8
+
cd3
+
淋巴细胞的纵向追踪。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如实施例1更详细描述的。基于其与gw9肽负载的mhc i类四聚体的结合来选择gag gw9
+
细胞。在所有图2a-2c中，10mg/kg抗ctla4-nf(向上指向的三角形)是最上面的曲线。
65.图3a-3c显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的全血中的facs分选的nef lt9特异性cd8
+
cd3
+
淋巴细胞的纵向追踪。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如实施例1更详细描述的。基于其与lt9肽负载的mhc i类四聚体选择nef lt9
+
细胞。在所有图3a-3c中，10mg/kg抗ctla4-nf(向上指向的三角形)是最上面的曲线。
66.图4a-4c呈现elispot结果，其显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理后22天(图4a)、或22和43天(图4b和4c)的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的聚蔗糖分离的pbmc中nef rm9肽诱导的ifn-γ产生，将其呈现为背景减除后的斑点形成细胞(sfc)值。在此图和本文中的所有其他图中，在未指示剂量的情况下，抗体以10mg/kg施用。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如实施例1更详细描述的。用10μm nef rm9最小最佳肽刺激pbmc 18小时。
67.图5a-5c呈现elispot结果，其显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或载体处理后22天(图5a)、或22和43天(图5b和5c)的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的聚蔗糖分离的pbmc中的gag gw9肽诱导的ifn-γ产生，将其呈现为背景减除后的斑点形成细胞(sfc)值。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如在实施例1中更详细地描述的。用10μm gag gw9最小最佳肽刺激pbmc 18小时。
68.图6a-6b呈现elispot结果，其显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或载体处理后22和43天的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的ficoll分离的pbmc中的nef lt9肽诱导的ifn-γ产生，将其呈现为背景减除后的斑点形成细胞(sfc)值。此实验不包括来自重复a的数据，仅包括重复b和c。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如在实施例1中更详细地描述的。用最小最佳肽刺激pbmc 18小时。
69.图7a-7c显示在用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴的全血中循环的ki-67
+
cd4
+
cd3
+
淋巴细胞(如通过流式细胞术测量的)的纵向追踪。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如在实施例1中更详细地描述的。ki-67是增殖的细胞内标志物。图7c和8c中呈现的第43天的值显得异常高且有可能代表离群值。
70.图8a-8c显示在用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴的全血中循环的ki-67
+
cd8
+
cd3
+
淋巴细胞(如通过流式细胞术测量的)的纵向追踪。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如在实施例1中更详细地描述的。ki-67是增殖的细胞内标志物。在所有图8a-8c中，10mg/kg抗ctla4-nf(向上指向的三角形)是最上面的曲线。
71.图9a-9c呈现elispot结果，其显示从用指示量(10mg/kg或1mg/kg)的指示抗体或用载体处理后22和43天的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴中获得的聚蔗糖分离的pbmc中的ad5蛋白诱导的ifn-γ产生，将其呈现为背景减除后的斑点形成细胞(sfc)值。在未指示剂量的情况下，抗体以10mg/kg施用。所述动物还经过用两个重组ad5载体(一个表达siv nef蛋白，另一个表达siv gag蛋白)处理，如在实施例1中更详细地描述的。用5x 108个热灭活的ad5病毒颗粒刺激pbmc 18小时。
72.图10显示非岩藻糖基化的抗ctla-4抗体伊匹单抗对特异性nk细胞介导的靶细胞裂解的影响。它在细胞系nk92诱导来自人供体的活化t
reg
的特异性裂解的能力的测定中提供了相比于同种型对照(三角形数据点，底部的曲线)的伊匹单抗(圆形数据点)的和伊匹单抗的非岩藻糖基化变体(正方形数据点，最上面的曲线)的滴定。参见实施例2。非岩藻糖基化的fc提高了伊匹单抗的溶解活性，使ec
50
从1.5μg/ml降低至0.0065μg/ml。
73.图11显示用10mg/kg伊匹单抗、10mg/kg伊匹单抗-nf或用载体处理的mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴的血液中调节性t细胞(treg)的频率。数据获自重复b的猴子。参见实施例1。伊匹单抗数据在虚线上以菱形呈现，其通常是最上面的曲线。伊匹单抗-nf数据在实线上以三角形呈现，其通常是中间的曲线。载体对照数据在点线上以圆形表示，其通常是最下面的曲线。数据点是6只动物的平均值，误差条代表一个标准偏差。
74.发明详述
75.定义
76.为了容易理解本公开，首先定义了某些术语。如本技术中所用的，除非在本文中另有明确提供，否则下列术语中的每一个应具有以下陈述的含义。在整个申请中阐述了另外的定义。
77.如本文所用的“佐剂”是指连同疫苗一起向受试者施用以增强对该疫苗的免疫应答(相比于施用疫苗而不施用佐剂引起的免疫应答)的药剂。本发明的佐剂是具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体。
[0078]“施用(administering、administer或administration)”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种向受试者物理引入包含治疗剂的组合物。施用本发明抗体的优选途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的，词组“肠胃外施用”意指除肠内和外用(topical)施用之外的施用方式，其通常通过注射，且包括，但不限于，静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。可替换地，本发明的抗体可经由非肠胃外途径施用，诸如外用、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用施用。施用还可以，例如，一次、多次、和/或在一个或多个延长的时间段内进行。
[0079]
具有增强的adcc抗ctla-4抗体“连同”疫苗一起施用包含任何顺序的施用或并行施用，其包括任何给药时间表和施用的数目，条件是具有增强的adcc的抗ctla-4抗体的施用旨在促进对该疫苗的免疫应答。
[0080]“抗体”(ab)应包括，但不限于，糖蛋白免疫球蛋白，其特异性结合抗原且包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(hc)和两条轻链(lc)。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，c
h1
、c
h2
和c
h3
。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域，c
l
。vh和v
l
区可进一步细分为高可变区(称为互补决定区(cdr))，其中散布更保守的区(称为框架区(fr))。每个vh和v
l
由3个cdr和4个fr组成，其按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0081]
如本文所用的，且依据常规解释，被描述为包含“一(a)”重链和/或“一(a)”轻链的抗体是指包含“至少一条”所述重和/或轻链的抗体，且因此将包括具有两条或多条重和/或轻链的抗体。具体地，如此描述的抗体将包括具有两条基本相同的重链和两条基本相同的轻链的常规抗体。如果抗体链因为翻译后修饰(诸如赖氨酸残基的c末端切割，可替换的糖基化模式等)而不同，则它们可以基本相同但不完全相同。然而，聚糖内的岩藻糖基化不同的抗体基本上不相同。
[0082]
除非另有指示或上下文中清楚可见，由其靶点特异性限定的抗体(例如“抗ctla-4
抗体”)是指可结合它的人靶标(例如人ctla-4)的抗体。此类抗体可或不可结合来自其他物种的ctla-4。
[0083]
免疫球蛋白可衍生自任何公知的同种型，包括但不限于iga、分泌型iga、igg和igm。igg同种型可分为某些物种的亚类：人的igg1、igg2、igg3和igg4，和小鼠的igg1、igg2a、igg2b和igg3。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类(例如，igm或igg1)。作为实例，“抗体”包括，两种天然存在的和非天然存在的抗体，包括同种异型变体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人或非人抗体；完全合成抗体；和单链抗体。除非另有指示或上下文中清楚可见，本文公开的抗体是人igg1抗体。igg1恒定结构域序列包括，但不限于，本文作为伊匹单抗恒定结构域提供的igg1同种异型变体(igg1fa，seq id no:11的残基119
–
448和seq id no:12的119
–
447)和igg1za(seq id no:28和29)。
[0084]“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合ctla-4的分离的抗体，其基本上不含特异性结合除ctla-4外的抗原的抗体)。然而，特异性结合ctla-4的分离的抗体可与其他抗原(诸如来自不同物种的ctla-4分子)交叉反应。而且，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。通过比较，“分离的”核酸是指与天然存在的核酸显著不同的物质的核酸组合物，即，具有独特的化学特性、性质和效用。例如，不同于天然dna，分离的dna是天然dna的独立部分，且不是自然界中发现的较大结构复合物(染色体)的整体部分。而且，不同于天然dna，分离的dna除了其他方面可用作pcr引物或杂交探针，以测量基因表达和检测生物标志物基因或突变，用于诊断疾病或预测治疗剂的功效。还可使用本领域公知的标准技术来纯化分离的核酸，以便基本上不含其他细胞组分或其他污染物，例如，其他细胞核酸或蛋白质。
[0085]
术语“单克隆抗体”(“mab”)是指单一分子组成的抗体分子的制剂，即，一级序列序列基本相同且针对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体分子。可通过杂交瘤技术、重组技术、转基因技术或本领域技术人员已知的其他技术产生单克隆抗体。
[0086]“人”抗体(humab)是指具有其中框架区和cdr区两者都衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外引入随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的cdr序列已经移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“全人”抗体同义使用。
[0087]“人源化”抗体是指具有衍生自非人动物(例如啮齿动物)免疫球蛋白种系序列的cdr区的抗体，其中在cdr结构域外的一些、大部分或全部的氨基酸被衍生自人免疫球蛋白的相应氨基酸代替。在人源化形式的抗体的一个实施方案中，在cdr结构域外的一些、大部分或全部的氨基酸已经被来自人免疫球蛋白的氨基酸代替，然而在一个或多个cdr区内的一些、大部分或全部氨基酸未变化。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。
[0088]“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自一个物种且恒定区衍生自另一物种的抗体，诸如其中可变区衍生自小鼠抗体且恒定区衍生自人抗体的抗体。
[0089]“抗体片段”是指完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的“抗原结合部分”(“抗原
结合片段”)，其保留特异性结合完整抗体所结合的抗原的能力，且保留介导fcr结合能力的抗体fc区。
[0090]“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(“adcc”)是指体外或体内的细胞介导的反应，其中表达fcr的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)识别与靶细胞上的表面抗原结合的抗体，且随后引起该靶细胞的裂解。原则上，可触发具有活化性fcr的任何效应细胞来介导adcc。
[0091]
如本文所用的关于本发明的抗ctla-4抗体的“增强的adcc”或“增强的adcc活性”，是指比未经修饰的伊匹单抗所诱导的adcc更高的adcc活性水平。本发明的具有增强的adcc的伊匹单抗，例如，是诱导比具有其天然igg1恒定结构域的伊匹单抗更高的adcc的伊匹单抗的修饰形式。至于曲美木单抗，同样相对于伊匹单抗来测量增强的adcc。如本文说明书和附图中所用的“伊匹单抗”、“ipi”和除非另有明确指定，否则是指包含seq id no:13的轻链和seq id no:12的重链(缺乏c端赖氨酸残基)的抗体。在仅有重复a的实验的背景中，“伊匹单抗”包含同种异型变体，其包含突变d357e和l359m(igg1f)。在一些实施方案中，adcc活性的增强水平被量度为在实施例2中描述的测定中的降低至少两倍且任选至少10倍的nk92细胞介导的细胞裂解的ec
50
。
[0092]“癌症”是指特征在于体内异常细胞的不受控制的生长的一大组多样的疾病。不受调控的细胞分裂和生长(分裂和生长)导致恶性肿瘤或细胞的形成，所述恶性肿瘤或细胞侵袭邻近组织，且还可通过淋巴系统或血流转移至人体的远端部分。
[0093]“细胞表面受体”是指能够接收信号并传递此类信号穿过质膜的分子和分子复合物。
[0094]“效应子功能”是指抗体fc区与fc受体或配体的相互作用，或由此产生的生物化学事件。示例性“效应子功能”包括clq结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、fcγr介导的效应子功能诸如adcc和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)、和细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的下调。此类效应子功能通常需要fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)联合。
[0095]“fc受体”或“fcr”是结合免疫球蛋白的fc区的受体。结合igg抗体的fcr包含fcγr家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替换地剪切形式。fcγr家族由3个活化性受体(小鼠中的fcγri、fcγriii、和fcγriv；人中的fcγria、fcγriia、和fcγriiia)和一个抑制性受体(fcγriib)组成。人fcγr的各种性质总结于表11中。大多数先天效应细胞类型共表达一种或多种活化性fcγr和抑制性fcγriib，然而自然杀伤(nk)细胞选择性表达一种活化性fc受体(小鼠中的fcγriii和人中的fcγriiia)而不表达小鼠和人中的抑制性fcγriib。
[0096]“fc区”(片段可结晶区)或“fc域”或“fc”是指抗体的重链的c端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括结合位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的fc受体或结合经典补体系统的第一成分(c1q)。因此，fc区是包含抗体的恒定区(除第一恒定区免疫球蛋白结构域外)的多肽。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区由衍生自抗体的两条重链的第二(c
h2
)和第三(c
h3
)恒定结构域的两个完全相同的蛋白质片段组成；igm和ige fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。对于igg，fc区包含免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3以及cγ1和cγ2之间的铰链。虽然免疫球蛋白重链的fc区的边界可
变化，但人igg重链fc区通常被定义为从位置c226或p230处的氨基酸残基延伸至重链的羧基末端，其中编号的根据是kabat中的eu索引。人igg fc区的c
h2
结构域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340，然而c
h3
结构域位于fc区中的c
h2
结构域的c末端侧，即，其从igg的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文所用的，fc区可以是天然序列fc或变体fc。fc还可指在单独情况下或在包含蛋白质多肽的fc的背景(诸如“包含fc区的结合蛋白”)中的这个区域，还指“fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。
[0097]
表11人fcγr的性质
[0098][0099][0100]
如本文所用的“岩藻糖基化”和“非岩藻糖基化”是指在抗体的位置n297处(eu编号)的n连接的聚糖上的核心岩藻糖残基的存在或不存在。
[0101]“免疫应答”是指在脊椎动物内针对外来媒介物(agent)的生物应答，所述应答保护生物体免受这些外来物或由其导致的疾病。免疫应答是通过免疫系统的细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞，树突细胞或中性粒细胞)的活动和由这些细胞或肝脏产生的可溶的大分子(包括抗体、细胞因子和补体)来介导的，所述应答导致选择性靶向、结合、损伤、破坏、和/或消除脊椎动物体的侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
[0102]“免疫调制剂(immunomodulator)”或“免疫调节剂(immunoregulator)”是指可能
涉及调控、调节或改变免疫应答的信号通路的组分。“调控”、“调节”或“改变”免疫应答是指免疫系统的细胞或此类细胞的活性的任何改变。此类调控包括刺激或抑制免疫系统，其可以表现为各种细胞类型的数目的增加或减少，这些细胞的活性的升高或降低，或免疫系统内可发生的任何其他变化。已经鉴定抑制性和刺激性免疫调节剂，其中一些免疫调节剂可在肿瘤微环境中具有增强的功能。在本发明公开的优选的实施方案中，免疫调节剂位于t细胞的表面上。“免疫调制性靶标(immunomodulatory target)”或“免疫调节性靶标(immunoregulatory target)”是物质、药剂、模块、化合物或分子靶向结合的或通过物质、药剂、模块、化合物或分子的结合而改变其活性的免疫调节剂。免疫调节性靶标包括，例如，细胞表面上的受体(“免疫调节性受体”)和受体配体(“免疫调节性配体”)。
[0103]“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗患有疾病或处于感染疾病风险或疾病复发风险的受试者。
[0104]“增强内源性免疫应答”意指增加受试者中现有免疫应答的有效性或效能。此有效性和效能的增加可以，例如，通过克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源性宿主免疫应答的机制来实现。
[0105]“蛋白质”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，链的长度无上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰诸如，但不限于，糖基化、磷酸化或二硫键形成。术语“蛋白质”在本文中与“多肽”可互换地使用。
[0106]“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括，但不限于，脊椎动物诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、兔子、啮齿类动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、鸟类(诸如鸡)、两栖动物、和爬行动物。在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、兔子、白鼬或啮齿类动物。在本发明公开的任何方面的更优选的实施方案中，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。
[0107]
药物或治疗剂(诸如本发明的fc融合蛋白)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当药物单独使用或与其他治疗剂组合使用时，促进由疾病症状的严重性的降低证明的疾病消退、无疾病症状期的频率或持续时间的增加、或预防由于疾病折磨造成的损伤或残疾的药物量。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，其是当药物单独或与其他治疗剂组合施用至处于发生疾病的风险或处于遭受疾病复发的风险的受试者时，抑制该疾病的发生或复发的药物量。可以诸如在临床试验期间的人受试者，在预测人中的功效的动物模型系统，或通过在体外测定中测定药剂的活性，使用本领域技术人员已知的多种方法来评估治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发生或复发的能力。
[0108]
举例而言，抗癌剂促进受试者中癌症消退。在优选的实施方案中，药物的治疗有效量促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独施用或与抗瘤药剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或大小的消减，肿瘤的坏死，至少一种疾病症状的严重程度降低，或无疾病症状期的频率或持续时间的增加，预防由于疾病折磨造成的损伤或残疾，或以其他方式改善患者中的疾病症状。此外，关于治疗的术语“有效”和“有效性”包括药理学有效性和生理安全性二者。药理有效性是指药物促进患者中的癌症消退的能力。生理安全性是指由施用药物引起的细胞、器官和/或生物体水平的毒性水平，或其他不良生理作用(不良反应)。
[0109]
作为治疗肿瘤的实例，相对于未经治疗的受试者，治疗有效量或剂量的药物优选
地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，且又更优选至少约80％。在最优选的实施方案中，治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤，即，优选抑制细胞生长或肿瘤生长的100％。可在动物模型(诸如ct26结肠腺癌、mc38结肠腺癌和sa1n纤维肉瘤小鼠肿瘤模型)中评估化合物抑制肿瘤生长的能力，所述动物模型预测在人肿瘤中的功效。可替换地，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评估组合物的这种性质，此类抑制可通过本领域技术人员已知的测定法来测量。在本发明的其他优选的实施方案中，可观察到肿瘤消退并持续至少约20天、更优选至少约40天、或甚至更优选至少约60天的时间。
[0110]
受试者的“治疗(treatment)”或“治疗(therapy)”是指在受试者上进行的任何类型的介入或过程，或向受试者施用活性药剂，目标是逆转、减轻、改善、抑制、减缓与疾病相关联的症状、并发症、病况或生物化学指标或预防与疾病相关联的症状、并发症、病况或生物化学指标的发作、进展、发展、严重性或复发。
[0111]
具有增强的adcc的抗ctla-4抗体作为佐剂更有效
[0112]
现在认识到ctla-4主要通过对cd4
+
t细胞的两个主要亚群的两种不同作用发挥其生理功能：(1)下调辅助性t细胞活性，和(2)增强调节性t细胞(t
reg
)的免疫抑制活性。lenschow等(1996)ann.rev.immunol.14:233；wing等(2008)science322:271；peggs等(2009)j.exp.med.206:1717。已知t
reg
组成性表达高水平的表面ctla-4，且已经表明此分子对于其调节性功能是不可或缺的。takahashi等(2000)j.exp.med.192:303；birebent等(2004)eur.j.immunol.34:3485。因此，t
reg
群可能最容易受到ctla-4阻断的影响。伊匹单抗患者的研究还显示不同于非应答者，应答者在治疗后表现出降低的t
reg
浸润，经由adcc机制并且由表达fcγriiia的非经典(cd14
+
cd16
++
)单核细胞介导而发生耗竭。romano等(2014)j.
[0113]
immunotherapy of cancer 2(suppl.3):o14。
[0114]
在一个方面，本发明提供通过施用经修饰以表现出增强的adcc的抗ctla-4抗体(诸如伊匹单抗)来增强对疫苗的免疫应答的改善方法。鉴于本文提供的实验结果，此类抗体表现出改善的疫苗佐剂活性。
[0115]
未曾预期具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体将会增强对疫苗的免疫应答。此类抗体治疗癌症的作用的先前实验已经显示，事实上，用具有或不具有增强的adcc的抗ctla4抗体的治疗实际上增加了外周(即肿瘤微环境之外)中的调节性t细胞(t
reg
)的群体，预期这会降低疫苗应答而非增强疫苗应答。参见selby等(2013)cancer immunol.res.1:32的摘要和附图2。
[0116]
此类具有增强的adcc的抗ctla-4抗体的使用可增强给定剂量的疫苗的疫苗功效，或可允许较少给药以达到任何给定水平的功效，和/或可以增加免疫应答的持久性。预期本发明的方法(涉及使用具有增强的adcc活性的抗ctla-4抗体)增强b细胞和t细胞免疫应答，针对自身和外来抗原，并且针对优势和亚优势表位。同样地，本发明的方法可增强预防性疫苗对初次接种疫苗抗原的受试者的有效性，且还可增强治疗性疫苗在受试者中的有效性，其中在所述受试者中预先存在的(接种前)抗抗原免疫应答已经耗尽。
[0117]
小鼠模型实验
[0118]
使用ova疫苗初免加强模型来测试增强的adcc活性对抗ctla-4抗体的佐剂活性的
影响。用抗小鼠抗ctla-4抗体9d9处理小鼠，所述抗体为小鼠igg1、igg2b、或igg1-d265a任一者(其导致非常差的fc相关的效应子功能-baudino等(2008)j.immunol.181:6664)或为小鼠igg2a(其表现出增强的adcc)。参见wo 2014/089113。实验还包括migg2a同种型对照、仅ova和初次接受试验的小鼠。相比于人igg1抗体伊匹单抗，小鼠igg2a抗体表现出增强的adcc。
[0119]
在第0天用ova肽皮下(sc)免疫小鼠，并在第14天用ova肽皮下激发。在第-1、1、13和15天腹膜内(ip)以0.1mg/剂量给予抗体，每组10只小鼠。在第21天，将小鼠放血以测定血清和血液中的抗ova滴度。
[0120]
用migg2a抗ctla-4mab(其具有增强的adcc)处理的小鼠的脾脏通常比其他组重约20％，所述其他组彼此相似。这些相同小鼠在第21天表现出增强的血清抗ova igg滴度，以及如通过elispot测量的脾脏中增强的ova特异性ifn-γ产生。
[0121]
其他实验证明，与其他同种型相比，用具有增强的adcc活性的9d9igg2a处理的小鼠的血液、脾脏或腹股沟淋巴结中foxp3
+
t
regs
(测量为cd45
+
细胞的百分比)的耗竭无增强。
[0122]
还在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)肽诱导的实验性自身免疫脑脊髓炎(eae)模型中测试这些相同抗体。在第0天皮下施用mog
35-55
/cfa至63只雌性c57bl/6小鼠(5只小鼠/组+3只初次接受试验的小鼠)。在第0天和第2天静脉内施用百日咳毒素。在第0、3和6天施用抗体(9d9 igg1-d265a、9d9 igg2a、migg1同种型对照、和非阻断性抗mctla-4mab 5g6-migg2a)，在第0天时，在mog和百日咳毒素之间施用抗体剂量。在第15天处死小鼠。相比于同种型对照，两种migg2a抗体显著提高了eae疾病评分，migg1-d265a提供更适度的提高。在此模型中提高的疾病评分与增强的抗mog免疫应答相关，且因此增强佐剂活性。与上述ova模型一样，增强的adcc mab(migg2a)未耗竭脾脏或淋巴结中的foxp3
+
t
reg
(测量为cd45
+
细胞的百分比)，并且也未耗竭中枢神经系统(cns)中的foxp3
+
t
reg
。
[0123]
在ova诱导的和mog诱导的免疫应答两种模型中，具有增强的adcc活性的抗ctla-4mab(migg2a)(阻断性抗体和非阻断性抗体两者)引出更强的免疫应答，但未引起t
reg
耗竭。
[0124]
食蟹猴实验
[0125]
如本文公开的，另外的实验使用抗人ctla-4抗体和非岩藻糖基化的伊匹单抗(ipi-nf，其具有增强的adcc)研究了在灵长类动物中增强的adcc活性对抗ctla-4抗体的佐剂活性的影响(图10)。
[0126]
如在多个附图和实施例中公开的，且与小鼠结果一致的，具有增强的adcc的抗ctla-4抗体引出了比无增强的adcc的其他方面等同的抗ctla-4抗体更强且更稳健的免疫应答，即伊匹单抗-nf对比伊匹单抗。此增强的免疫应答反映在疫苗抗原特异性cd8
+
t细胞应答(图1a-1c、2a-2c和3a-3c)、疫苗抗原诱导的ifn-γ产生(图4a-4c、5a-5c和6a-6b)和ad5诱导的ifn-γ产生(图9a-9c)。伊匹单抗-nf还增加了cd4
+
和cd8
+
t细胞增殖，如通过ki-67表达测量的(图7a-7c和8a-8c)。增强的adcc形式的伊匹单抗(伊匹单抗-nf)并不引起研究中的食蟹猴的血液中的t
reg
耗竭(图11)。
[0127]
改善的具有增强的效应子功能的抗ctla-4抗体
[0128]
已经显示对抗体的fc区的多种修饰增强效应子功能。在小鼠中，与活化性fcγ受体的结合增强以及与fcγ抑制性受体的结合降低遵循以下层次：migg2a》》migg2b》》migg1d265a。此层次遵循免疫球蛋白fc区与活化性fc受体的结合相对于与抑制性fc受体结
合的活性比率(称为a/i比率)，其通过nimmerjahn&ravetch(2005)science 310:1510定义，并且针对介导adcc功能的抗体加以确定。
[0129]
在某些方面，本发明的改进的抗ctla-4抗体是人igg1抗体。例如，可以通过在fc区中引入一个或多个氨基酸取代、改变n连接的聚糖处的糖基化模式或这两者来增强本发明的抗ctla-4抗体的adcc活性。
[0130]
增强效应子功能的fc突变
[0131]
在一些实施方案中，通过修饰fc区的氨基酸序列增加adcc活性，例如向天然存在的人igg1序列添加突变以增强adcc。关于adcc活性，人igg1≧igg3＞＞igg4≧igg2，因此可选择igg1恒定结构域而非igg2或igg4作为增强adcc的起始点。如本文所定义的，如在伊匹单抗中存在的未经修饰的人igg1不具有增强的adcc。可通过修饰在以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰fc区以增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或以增加对fcγ受体(fcγr)的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。参见wo 2012/142515；还参见wo 00/42072。示例性单独取代包括236a、239d、239e、268d、267e、268e、268f、324t、332d、和332e。示例性变体簇包括239d/332e、236a/332e、236a/239d/332e、268f/324t、267e/268f、267e/324t和267e/268f/324t。例如，已经显示包含g236a变体(其可任选地与i332e组合)的人igg1fc增加fcγiia/fcγiib结合亲和力比率大约15倍。richards等(2008)mol.cancer therap.7:2517；moore等(2010)mabs 2:181。增强fcyr与补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298a、333a、334a、326a、247i、339d、339q、280h、290s、298d、298v、243l、292p、300l、396l、305i和396l。这些修饰和其他修饰综述于strohl(2009)current opinion in biotechnology 20:685-691中。具体地，可通过igg1的位置e333处的变化(例如e333a)来增强adcc和cdc二者。shields等(2001)j.biol.chem.276:6591。在wo2006/020114中公开了使用p247i和a339d/q突变并且在wo 2004/074455中公开了d280h、k290s
±
s298d/v来增强igg1的效应子功能。已经显示k326a/w和e333a/s变体增加人igg1的效应子功能，并且e333s增加igg2的效应子功能。idusogie等(2001)j.immunol.166:2571。其他实验已经显示g236a/s239d/a330l/i332e导致与fcriia和fcriiia结合增强。smith等(2012)proc.nat’l acad.sci.(usa)109:6181；bournazos等(2014)cell158:1243。
[0132]
除非另有指示，或上下文中清楚可见，抗体的fc区中的氨基酸残基编号的根据是eu编号惯例(如kabat等(1991)sequences of proteins of immunological interest,national institutes of health,bethesda,md中的eu索引；还参见美国专利申请公开号2008/0248028的图3c-3f)，除了特别提及序列表中序列中的残基之外，在此情况下编号必须是连续的。例如，关于fc区中氨基酸取代的影响的文献参考将通常使用eu编号，其允许以相同的数字提及抗体fc区中的任何给定残基，而不论其所附接的可变结构域的长度。在极少数情况下，可能需要参考所引用的文件来确认所提及的精确fc残基。
[0133]
具体地说，已经映射了人在igg1上的对fcγr、fcγrii、fcγriii和fcrn的结合位点，且已经描述了具有改善的结合的变体。shields等(2001)j.biol.chem.276:6591-6604。
在位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变显示出改善与fcγriii结合，包括组合突变体t256a/s298a、s298a/e333a、s298a/k224a和s298a/e333a/k334a(具有增强的fcγriiia结合和adcc活性)。已经鉴定了具有强烈增强的与fcγriiia结合的其他igg1变体，包括具有s239d/i332e和s239d/i332e/a330l突变的变体，其显示对fcγriiia亲和力的最大增加、fcγriib结合的减少和在食蟹猴中的强细胞毒活性。lazar等(2006)proc.nat’l acad.sci.(usa)103:4005；awan等(2010)blood 115:1204；desjarlais&lazar(2011)exp.cell res.317:1278。将三重突变引入到抗体诸如阿仑单抗(alemtuzumab)(cd52特异性)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(her2/neu特异性)、利妥昔单抗(rituximab)(cd20特异性)、和西妥昔单抗(cetuximab)(egfr特异性)中使其转化为具有大大增强的体外adcc活性，且s239d/i332e变体在猕猴中显示增强耗竭b细胞的能力。lazar等(2006)proc.nat’l acad.sci.(usa)103:4005。此外，已经鉴定了含有l235v、f243l、r292p、y300l、v305i和p396l突变的igg1突变体，其在b细胞恶性肿瘤和乳腺癌的模型中在表达人fcγriiia的转基因小鼠中表现出与fcγriiia结合增强，且伴随着增强的adcc活性。stavenhagen等(2007)cancer res.67:8882；美国专利号8,652,466；nordstrom等(2011)breast cancer res.13:r123。
[0134]
不同igg同种型也表现出有差异的cdc活性(igg3》igg1》》igg2≈igg4)。dangl等(1988)embo j.7:1989。对于期望的cdc增强的用途，还可以引入增加与c1q结合的突变。可通过igg2中k326和/或e333处的突变(诸如k326w(其降低adcc活性)和e333s)以增加与c1q(补体级联的第一补体)的结合来增强募集补体(cdc)的能力。idusogie等(2001)j.immunol.166:2571。引入s267e/h268f/s324t(单独或以任何组合的形式)至人igg1增强c1q结合。moore等(2010)mabs2:181。natsume等(2008)cancer res.68:3863(其图1)的igg1/igg3杂交同种型抗体“113f”的fc区也赋予增强的cdc。还参见michaelsen等(2009)scand.j.immunol.70:553和redpath等(1998)immunology 93:595。
[0135]
在dall’acqua等(2006)j.immunol.177:1129中公开了可提高或降低效应子功能的另外的突变。还参见carter(2006)nat.rev.immunol.6:343；presta(2008)curr.op.immunol.20:460。
[0136]
在一些实施方案中，可在各种igg1同种异型中进行fc区中的氨基酸取代以增强adcc，包括但不限于伊匹单抗的igg1fa同种异型(seq id no:11的残基119
–
448和seq id no:12的119
–
447)和igg1za(seq id no:28和29)。
[0137]
具有增强的adcc的非岩藻糖基化的抗ctla-4抗体
[0138]
比较非岩藻糖基化的在其他方面未经修饰的igg1f抗体实验显示与活化性fcγ受体结合增强，如表12中所示的，证明了它们适用于本发明的增强的抗ctla-4抗体。同种异型igg1f具有相对于伊匹单抗同种异型igg1fa(seq id no:11和12)的d357e和l359m突变。igg1f具有相对于同种异型igg1za(seq id no:28和29)的k97r、d239e和l241m突变，所述突变等同于相对于seq id no:11和12的伊匹单抗序列编号的k215r、d357e和l359m突变。
[0139]
表12
[0140]
非岩藻糖基化igg1f fc区与fc受体结合的kd值(nm)
[0141]
fcγ受体igg1figg1f-nfcd16-v158(fcγriiia)9711
cd32-h131(fcγriia)530560cd32-r131(fcγriia)960710cd32b(fcγriib)
––
cd64(fcγria)0.20.1
[0142]
减少的岩藻糖基化、非岩藻糖基化和低岩藻糖基化
[0143]
还可通过修饰在n297残基处与每个fc片段附接的聚糖模块来增强抗体与fcγr的相互作用。特别地，核心岩藻糖残基的缺乏经由改善igg与活化性fcγriiia的结合来强烈增强adcc，而不改变抗原结合或cdc。natsume等(2009)drug des.devel.ther.3:7。有令人信服的证据表明，非岩藻糖基化的肿瘤特异性抗体在小鼠模型中在体内转化为具有增强的治疗活性。nimmerjahn&ravetch(2005)science 310:1510；mossner等(2010)blood115:4393。
[0144]
可通过，例如，在改变了糖基化机制的宿主细胞中表达抗体，完成抗体糖基化的修饰。减少或消除了岩藻糖基化的抗体(其表现出增强的adcc)在本发明的方法中特别有用。改变了糖基化机制的细胞已经在本领域中描述，且可用作表达本公开的重组抗体的宿主细胞，以便由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系ms704、ms705、和ms709缺乏岩藻糖转移酶基因，即，fut8(α-(1,6)岩藻糖转移酶(参见美国专利申请公开号20040110704；yamane-ohnuki等(2004)biotechnol.bioeng.87:614)，使得在这些细胞系中表达的抗体在其糖类上缺乏岩藻糖。作为另一实例，ep 1176195还描述了具有功能上经破坏的fut8基因的细胞系以及具有很小或没有添加岩藻糖至n-乙酰葡萄糖胺(其结合抗体的fc区)的活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcccrl 1662)。pct公开wo 03/035835描述了具有使岩藻糖附接至asn(297)连接的糖类的能力降低的变体cho细胞系，lec13，也导致在宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化。还参见shields等(2002)j.biol.chem.277:26733。还可在鸡蛋中产生具有经修饰的糖基化模式的抗体，如在pct公开号wo 2006/089231中描述的。可替换地，可在植物细胞(诸如浮萍属(lemna))中产生具有经修饰的糖基化模式的抗体。参见例如美国公开号2012/0276086。pct公开号wo 99/54342描述了以下细胞系，其经构建以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰葡萄糖胺转移酶iii(gntiii))，使得在经构建的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分glcnac结构，导致抗体的adcc活性增加。还参见等(1999)nat.biotech.17:176。可替换地，可使用岩藻糖苷酶切割抗体的岩藻糖残基。例如，酶α-l-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖残基。tarentino等(1975)biochem.14:5516。具有减少的岩藻糖基化的抗体还可在携带编码使用gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己糖作为底物的酶(诸如gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己糖还原酶(rmd))的重组基因细胞中产生，如在美国专利号8,642,292中描述的。可替换地，细胞可在含有岩藻糖类似物的培养基中生长，所述岩藻糖类似物阻断将岩藻糖残基添加至由培养基中生长的细胞产生的n-连接的聚糖或糖蛋白(诸如抗体)。美国专利号8,163,551；wo 09/135181。
[0145]
因为非岩藻糖基化的抗体相比于岩藻糖基化的抗体表现出大大增强的adcc，所以抗体制剂不需要完全不含岩藻糖基化的重链以有用于本发明的方法。残余水平的岩藻糖基化的重链将不会显著干扰基本上非岩藻糖基化的重链的制剂的adcc活性。然而，在常规cho细胞中产生的抗体(其完全有能力将核心岩藻糖添加到n-聚糖中)可以包含几个百分比至多15％的非岩藻糖基化抗体。非岩藻糖基化抗体可表现出高10倍的对cd16的亲和力，以及
增强adcc活性至多30倍-100倍，因此，即使非岩藻糖基化抗体比例的小幅增加也可能显著增加制剂的adcc活性。包含比在培养物中的正常cho细胞中产生的非岩藻糖基化抗体更多的非岩藻糖基化抗体的任何制剂可表现出一定水平的增强的adcc。此类抗体制剂在本文中是指具有减少的岩藻糖基化的制剂。取决于获自正常cho细胞非岩藻糖基化的原始水平，减少的岩藻糖基化制剂可包括仅仅50％、30％、20％、10％和甚至5％非岩藻糖基化抗体。将减少的岩藻糖基化在功能上定义为，相比于正常cho细胞中制备的抗体(而不是参考任何固定百分比的非岩藻糖基化种类)，表现出adcc增强2倍或更多的制剂。
[0146]
在其他实施方案中，在结构上定义了非岩藻糖基化的水平。如本文所用的，非岩藻糖基化(nonfucosylated)或无岩藻糖基化(afucosylated)(术语同义使用)抗体制剂是包含大于95％(包括100％)非岩藻糖基化抗体重链的抗体制剂。低岩藻糖基化抗体制剂是包含少于或等于95％缺乏岩藻糖的重链的抗体制剂，例如其中80-95％(诸如85-95％，和90-95％)的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂。除非另有指示，否则低岩藻糖基化是指其中80-95％的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂，非岩藻糖基化是指其中超过95％的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂，且“低岩藻糖基化或非岩藻糖基化”是指其中80％或更多的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂。
[0147]
在一些实施方案中，低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体在缺乏岩藻糖基化所必需的酶(诸如fut8)的细胞中(例如美国专利号7,214,775)产生，或在外源酶部分地耗尽岩藻糖基化的代谢前体库的细胞中(例如美国专利号8,642,292)产生，或在涉及岩藻糖基化的酶的小分子抑制剂的存在下培养的细胞中(例如wo 09/135181)产生。
[0148]
可通过本领域中已知的任何方法测定抗体制剂中的岩藻糖基化的水平，所述方法包括但不限于凝胶电泳、液相色谱法、和质谱分析法。除非另有指示，否则出于本发明的目的，通过亲水性相互作用色谱法(或亲水性相互作用液相色谱法，hilic)测定抗体制剂中的岩藻糖基化的水平，其基本上如实施例3中描述。为了测定抗体制剂的岩藻糖基化的水平，用肽-n-聚糖酶f对样品进行处理变性以切割n-连接的聚糖，然后分析n-连接的聚糖的岩藻糖含量。全长抗体链的lc/ms是检测抗体制剂的岩藻糖基化的可替换的方法，但质谱分析法本质上较少定量。
[0149]
非岩藻糖基化伊匹单抗表现出增强的adcc
[0150]
非岩藻糖基化形式的伊匹单抗显示更有效地引出基于nk92细胞的来自人供体的活化t
reg
的裂解，将ec
50
从1.5μg/ml降低至6.5ng/ml。参见图10。
[0151]
另外的潜在fc修饰
[0152]
fc区可经突变以增加igg对新生fc受体(fcrn)的亲和力，其延长抗体的体内半衰期并导致增加的抗肿瘤活性。例如，引入m428l/n434s突变至贝伐单抗(bevacizumab)(vegf特异性)和西妥昔单抗(egfr特异性)的fc区中延长了抗体在猴子中的半衰期，并改善小鼠中的抗肿瘤应答。
[0153]
zalevsky等(2010)nat.biotechnol.28:157。
[0154]
抗ctla-4抗体
[0155]
在某些实施方案中，有待修饰以增强adcc的起始抗ctla-4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗，或共享它们的可变结构域序列的抗体。在美国专利号5,977,318中公开了识别并结合ctla-4的细胞外结构域的单克隆抗体。可使用多种方法生成本公开的人单克隆抗体，例
如，使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠，或使用体外展示技术诸如噬菌体或酵母展示。参见例如bradbury等(2011)nat.biotechnol.29(3):245。转基因或转染色体小鼠包括分别在本文中称为humab(lonberg等(1994)nature 368:856)和(wo 02/43478)的小鼠。在美国专利号6,984,720和7,605,238中详述了本公开的示例性人抗人ctla-4抗体的产生。在这些专利中鉴定为10d1的人igg1抗ctla-4抗体也称为伊匹单抗(以前也称为mdx-010和bms-734016)，其以销售。在美国专利号6,682,736和7,109,003中描述了本公开的其他示例性人抗ctla-4抗体，包括曲美木单抗(以前称为替西木单抗(ticilimumab)；cp-675，206)，一种人igg2抗人ctla-4抗体。
[0156]
已经批准伊匹单抗(一种人抗人ctla-4单克隆抗体)用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤且用于iii期黑色素瘤的辅助治疗，且正在进行其他癌症的临床测试，通常与其他药物组合使用。hoos等(2010)semin.oncol.37:533；hodi等(2010)n.engl.j.med.363:711；pardoll(2012)nat.immunol.13(12):1129。伊匹单抗具有人igg1同种型，其最佳地与大多数人fc受体结合(bruhns等(2009)blood 113:3716)。
[0157]
相反地，曲美木单抗是igg2同种型，其并不有效结合除了fcγriia变体h131外的fc受体。bruhns等(2009)blood 113:3716。曲美木单抗是igg2同种型且因此表现出比伊匹单抗低的adcc，伊匹单抗为igg1。预期通过取代重链恒定结构域将曲美木单抗转换为igg1以创建“treme-igg1”来增加adcc至与伊匹单抗相似的水平。在一些实施方案中，本发明的方法涉及具有比伊匹单抗更强的adcc的曲美木单抗的变体或treme-igg1作为疫苗佐剂的用途。
[0158]
另外的抗ctla-4抗体
[0159]
另外的抗ctla-4抗体相关的发明在以下共同指定的专利申请中公开，其公开内容通过提述以其整体并入本文：wo 1993/000431；wo 97/020574；wo 00/032231；wo 2001/014424；wo 2003/086459；wo 2005/003298；wo 2006/121168；wo 2007/056540；wo 2007/067959；wo 2008/109075；wo 2009/148915；wo 2010/014784；wo 2011/011027；wo 2010/042433；wo 2011/146382；wo 2012/027536；wo 2013/138702；wo 2009/089260；wo 2013/142796；和wo 2013/169971。这些具有增强的adcc(即比伊匹单抗的adcc强的adcc)的抗体变体可用于本发明的方法中。
[0160]
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制性的。此申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过提述明确并入本文。
[0161]
实施例1
[0162]
食蟹猴中的抗ctla-4疫苗佐剂实验
[0163]
在mafa-a1*063+毛里求斯食蟹猴(macaca fascicularis；mcm)中进行实验以追踪adcc活性不同的抗ctla-4抗体变体随时间对疫苗诱导的抗原特异性t细胞应答的免疫调节的作用。对3种不同抗ctla-4单克隆抗体进行研究：伊匹单抗(ipi)、非岩藻糖基化的伊匹单抗(ipi-nf)、和具有n297a突变(ipi-n297a)的伊匹单抗(其完全阻断n-连接的糖基化)。相比于伊匹单抗，非岩藻糖基化的伊匹单抗表现出增强的adcc，然而n297a伊匹单抗表现出减少的/消除的adcc。
[0164]
通过将猿猴免疫缺陷病毒(siv)gag和nef蛋白的基因引入腺病毒血清型5(ad5)载
体构建病毒疫苗免疫原。nef基因序列经修饰去除第二和第三氨基酸残基(gly
–
gly)以去除豆蔻酰化位点。在相对的后肢肌肉内施用gag-ad5和nef-ad5病毒(3x109个病毒颗粒/mcm)以帮助避免免疫显性。3x109个病毒颗粒/mcm代表次佳给药，其经筛选以最大化观察到增强的佐剂活性的机会。然后，立即用i)盐水，ii)ipi(1mg/kg或10mg/kg)，iii)ipi-nf(1mg/kg和10mg/kg)，或iv)ipi-n297a(10mg/kg)(静脉内)处理动物。在第4、8、15、22、36、和43天取得血液样品。重复实验两次以上，在随后的实验中除了在每组中有6只动物而不是4只外，不使用1mg/kg剂量。随后的实验包括在第3天的样品，且使用第36天而非第35天的样品。此外，第一实验，而非第二和第三实验，使用包含d357e和l359m变化(相对于伊匹单抗的重链(seq id no:11))的ipi-nf抗体的伊匹单抗的同种异型变体。
[0165]
用于检测抗原特异性t细胞的全血facs
[0166]
在第8(仅在重复a中的第8天)、15、22、36和43天使用肽负载的i类mhc四聚体，使用全血荧光激活细胞分选(facs)测定法来测定对ad5疫苗内的几个siv特异性表位(nef rm9、nef lt9、gag gw9)特异的t细胞应答。nef rm9＝rpkvplrtm＝seq id no:25；nef lt9＝lnmadkket＝seq id no:26；gag gw9＝gprkpikcw＝seq id no:27。使用肽(rm9/gw9/lt9)负载的mhc-i四聚体通过全血facs检测抗原特异性t细胞。结果提供于图1a-1c、2a-2c和3a-3c中，其分别提供针对siv表位nef rm9、gag gw9和nef lt9的结果。在每个重复中，且针对每个表位，10mg/kg的ipi-nf生成最高百分比的抗原特异性cd8
+
t细胞。对nef lt9特异的cd8
+
t细胞相比于对表位nef rm9和gag gw9特异的cd8
+
t细胞(其达到高峰大约在第22天至第36天)更快地达到高峰且更快地开始消退。
[0167]
用于检测pbmc中的抗原诱导的ifn-γ产生的elispot测定
[0168]
对从第22天和第43天的血液样品中分离的聚蔗糖分离的外周血单核细胞(pbmc)进行酶联免疫斑点(elispot)测定以确定针对抗原刺激的应答表达的ifn-γ的水平。用10μm最小最佳siv表位肽刺激pbmc 18小时。测量斑点形成细胞(sfc)值，并减除背景值。
[0169]
结果提供于图4a-4c、5a-5c和6a-6b中，其分别提供用siv表位nef rm9、gag gw9和nef lt9刺激的结果。elispot测定证实了10mg/kg ipi-nf处理在所有重复中针对所有siv表位引出最高的ifn-γ产生。
[0170]
大量t细胞增殖
[0171]
还在流式细胞术中测量cd8
+
t细胞和cd4
+
t细胞的ki-67表达以测量细胞增殖。结果提供于图7a-7c和8a-8c中。10mg/kg ipi-nf处理在所有重复中增强了增殖。
[0172]
用于检测pbmc中的ad5诱导的ifn-γ产生的elispot测定
[0173]
与上述类似的elispot测定用于测量ad5诱导的ifn-γ产生。热灭活的ad5病毒体(5x108个病毒颗粒)与第22天pbmc或第43天pbmc温育18小时。测量斑点形成细胞(sfc)值，并减除背景值。结果提供于图9a-9c中。与图4a-4c、5a-5c和6a-6b中所示的用siv抗原获得的结果相似，10mg/kg抗ctla-4-nf处理在所有重复中在22天和43天一致地引出了最高的ifn-γ产生。
[0174]
在测试的所有测定中，抗ctla-4-nf通常在食蟹猴疫苗模型中增强针对三种不同siv抗原和针对ad5抗原的免疫应答。相比于在伊匹单抗情况下观察到的免疫应答，非岩藻糖基化抗体一致地产生了在量级上更高且更稳健的免疫应答。
[0175]
t
reg
耗竭
[0176]
通过全血facs测定法确定食蟹猴的血液中循环t
reg
的频率。根据已施用的抗体对来自重复b的动物的样品分选以确定随时间的t
reg
的频率。结果提供于图11中。具有增强的adcc的抗ctla-4mab(伊匹单抗-nf)相比于伊匹单抗未表现出增强的t
reg
耗竭，并且在事实上与载体对照无显著差异。
[0177]
实施例2
[0178]
通过使用原代人细胞促进nk介导的细胞裂解
[0179]
来测量具有增强的adcc的抗ctla-4抗体
[0180]
如下测试非岩藻糖基化的伊匹单抗促进nk细胞介导的裂解来自人供体的t
reg
的能力。简要地，通过使用磁珠的阴性选择来分离用作靶细胞的t
reg
，并活化72小时。通过使用磁珠的阴性选择来分离来自人供体的用作效应子的nk细胞，并用il-2活化24小时。用不同浓度的伊匹单抗、伊匹单抗-nf或igg1将钙黄绿素标记的活化t
reg
(供体leukopak ac8196)对照包被30分钟，然后以10:1的比率与nk效应细胞温育2小时。通过使用envision读板仪(perkin elmer)读取培养基的荧光强度来测量钙黄绿素的释放，且基于平均荧光强度(mfi)用下列公式来计算抗体依赖性细胞裂解的百分比：[(测试mfi
–
平均背景)/(平均最大值
–
平均背景)]
×
100。结果呈现在图10中。非岩藻糖基化的伊匹单抗以显著低于伊匹单抗(1.5μg/ml)的ec
50
(0.0065μg/ml)诱导了活化t
reg
的裂解。
[0181]
实施例3
[0182]
确定抗ctla-4抗体的样品中非岩藻糖基化百分比的测定
[0183]
如下分析非岩藻糖基化的抗ctla-4mab制剂以便基本上确定非岩藻糖基化百分比。
[0184]
首先使用尿素使抗体变性，然后使用dtt(二硫苏糖醇)还原抗体。用肽-n-聚糖酶f在37℃过夜消化样品以去除n连接的聚糖。释放的聚糖经收集、过滤、干燥并用2-氨基苯甲酸(2-aa)或2-氨基苯甲酰胺(2-ab)衍生化。然后将得到的标记的聚糖在hilic柱上解析，并通过荧光定量洗脱的级分并干燥。然后，用糖苷外切酶(诸如α(1-2,3,4,6)岩藻糖苷酶(bkf)处理该级分，以释放核心α(1,6)-连接的岩藻糖残基。然后通过液相色谱法分析未经处理的样品和bkf处理的样品。包含α(1,6)-连接的岩藻糖残基的聚糖在bkf处理后表现出改变的洗脱，然而非岩藻糖基化聚糖无变化。还通过质谱分析法确定了低聚糖组成。参见，例如，zhu等(2014)mabs 6:1474。
[0185]
非岩藻糖基化百分比计算为100乘以(缺乏在抗体重链的n297(eu编号)处的n连接的聚糖处与第一glcnac残基通过α1,6连接的岩藻糖的聚糖)与(与在该位置处的所有聚糖(缺乏岩藻糖的聚糖和具有α1,6-连接的岩藻糖的聚糖)的总计)的摩尔比。
[0186]
表3序列表概要
[0187]
[0188][0189]
关于抗体序列，序列表提供了成熟的可变区以及重链和轻链的序列，即序列不包括信号肽。
[0190]
等同物：
[0191]
本领域技术人员将认识到，或只需使用常规的实验就能够确定本文公开的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案预期被所附权利要求书涵盖。

技术特征：
1.一种增强用疫苗治疗的人受试者中对所述疫苗的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用具有伊匹单抗(ipilimumab)的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体。2.权利要求1的抗体，其中该抗体包含：a.由序列seq id no:3组成的cdrh1；b.由序列seq id no:4组成的cdrh2；c.由序列seq id no:5组成的cdrh3；d.由序列seq id no:6组成的cdrl1；e.由序列seq id no:7组成的cdrl2；和f.由序列seq id no:8组成的cdrl3。3.权利要求2的抗体，其中该抗体包含：a.由序列seq id no:9组成的重链可变结构域；和b.由序列seq id no:10组成的轻链可变结构域。4.权利要求3的抗体，其中该抗体包含：a.由序列seq id no:12组成的重链；和b.由序列seq id no:13组成的轻链。5.权利要求4的抗体，其中该抗体包含：a.包含序列seq id no:11的重链；和b.包含序列seq id no:13的轻链。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体在实施例2中详述的nk92细胞介导的裂解测定中表现出比伊匹单抗的细胞裂解的ec50低至少2倍的细胞裂解的ec50。7.权利要求6的方法，其中该具有伊匹单抗的至少两倍adcc活性的抗人ctla-4抗体在实施例2中详述的nk92细胞介导的裂解测定中表现出比伊匹单抗的细胞裂解的ec50低至少10倍的细胞裂解的ec50。8.权利要求1的抗体，其中该抗体包含：a.由序列seq id no:14组成的cdrh1；b.由序列seq id no:15组成的cdrh2；c.由序列seq id no:16组成的cdrh3；d.由序列seq id no:17组成的cdrl1；e.由序列seq id no:18组成的cdrl2；和f.由序列seq id no:19组成的cdrl3。9.权利要求8的抗体，其中该抗体包含：a.由序列seq id no:20组成的重链可变结构域；和b.由序列seq id no:21组成的轻链可变结构域。10.权利要求9的抗体，其中该抗体包含：a.由序列seq id no:23组成的重链；和b.由序列seq id no:24组成的轻链。

技术总结
本发明提供了使用具有增强的ADCC活性的抗CTLA-4抗体的变体形式来增强对疫苗的免疫应答的方法。供在本发明中使用的变体抗CTLA-4抗体包括非岩藻糖基化的伊匹单抗(ipilimumab)。(ipilimumab)。


技术研发人员：T
受保护的技术使用者：百时美施贵宝公司
技术研发日：2018.02.27
技术公布日：2023/7/22