一种重组流感病毒基因治疗药物及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组流感病毒基因治疗药物及其应用。


背景技术：

2.肿瘤是世界上人类健康的主要威胁之一。现在肿瘤治疗的主要手段有外科治疗，化疗、放疗以及免疫治疗、靶向治疗等，虽然具有一定疗效，但仍然存在着副作用大、疗效有限、难以根治、耐药、复发等问题，对机体正常细胞也会造成巨大伤害。因此如何高效、特异地杀伤肿瘤细胞是当今肿瘤治疗的一大挑战。随着分子生物学的发展以及人们在基因水平对肿瘤的认识提高，近年来溶瘤病毒为肿瘤治疗提供了新的思路。
3.甲型流感病毒a/puerto rico/8/34(h1n1)(pr8)，属于正黏病毒科，流行性感冒病毒属的代表种；pr8是由8个单股负链、分节段rna组成；共编码10种蛋白；rna前3个节段分别编码聚合酶碱性蛋白2(polymerase basic protein 2，pb2)、聚合酶碱性蛋白1(polymerase basic protein 1，pb1)和聚合酶酸性蛋白(polymerase acid protein，pa)，后5个节段编码血凝素(hemagglutinin，ha)，核蛋白(np)，神经氨酸酶(neuraminidase，na)，基质蛋白(matrix protein，m1和m2)和非结构蛋白(nonstructural，ns1和ns2)。近年来发现它不仅具有溶瘤作用，还能激活机体免疫反应。
4.现有的肿瘤治疗的方法无论是靶向治疗还是免疫治疗都只能针对肿瘤细胞本身所表达的蛋白通过单抗封闭的手段抑制其功能从而达到杀伤肿瘤细胞的作用，并没有从基因表达层面上，通过干预基因表达，尤其是过表达抑癌基因的治疗方法和手段；而这些现有治疗方法不仅手段有限，主要缺点是人为屏蔽自身表达的基因导致副作用严重，亟需更好的方法作为治疗的补充。另外，既往的溶瘤病毒选择的都是腺病毒、单纯孢疹病毒、牛痘病毒等作为病毒载体，病毒载体的种类有待进一步丰富和拓展。


技术实现要素：

5.基于现有技术中存在的缺陷，本发明人通过长期研究和大量试验发现与现有技术中通常使用的病毒相比，流感病毒除了同样能杀伤肿瘤细胞外，还明确能引起肿瘤细胞坏死性凋亡，引起机体更强的免疫反应。本发明通过在流感病毒上变达坏死性凋亡的效应蛋白mlkl，使肿瘤细胞表达更多mlkl，进而细胞增加坏事性凋亡，从而使机体免疫反应更强烈。
6.混合谱系激酶区域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein，mlkl)是一种坏死性凋亡的效应蛋白，本发明通过将mlkl装载到甲型流感病毒基因，局部应用本基因递送系统，在病毒自身复制的同时表达mlkl，加强细胞坏死性凋亡，从而增加细胞免疫原性死亡比例，并进一步激活机体免疫反应，以达到杀伤肿瘤，激活抗肿瘤免疫的效果。从而完成了本发明，即本发明如下所述：
7.本发明在第一方面提供了一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒中包含甲型流感病毒的基因组片段和编码混合谱系激酶结构域样蛋白(mlkl)的基因。
8.在一些具体的实施方式中，将所述编码mlkl蛋白的基因装载到所述甲型流感病毒的基因组中。
9.在另外一些具体的实施方式中，所述甲型流感病毒的基因组片段包含编码聚合酶碱性蛋白2(pb2)、聚合酶碱性蛋白1(pb1)、聚合酶酸性蛋白(pa)、血凝素(ha)，核蛋白(np)，神经氨酸酶(na)、基质蛋白(m)和非结构蛋白(ns)的基因序列。
10.在一些具体的实施方式中，其中，(i)所述编码mlkl的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述mlkl的氨基酸序列如seq id no:2所示；或者(ii)所述编码mlkl的核苷酸序列与seq id no:1具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；所述mlkl的氨基酸序列与seq id no:2具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
11.在一些具体的实施方式中，其中所述甲型流感病病毒的毒株为a/puerto rico/8/34。
12.本发明在第二方面提供了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体和本发明在第一方面中所述的重组病毒。
13.本发明在第三方面提供了一种如本发明在第一方面中所述的重组病毒在作为rna/基因递送载体中的用途。
14.本发明在第四方面提供了一种如本发明在第一方面中所述的重组病毒或如本发明在第二方面中所述的药物组合物在制备抑制或杀死肿瘤细胞的药物中的用途；在一些优选的实施方案中，所述肿瘤是选自由头颈部、肺、乳腺、胰腺、肾、肝、胃、结肠、卵巢、子宫、前列腺、膀胱或血液组成的组中的任一项中的肿瘤。
15.本发明在第五方面提供了一种如本发明在第一方面中所述的重组病毒或如本发明在第二方面中所述的药物组合物在制备激活机体免疫系统能力的药物中的用途。
16.本发明的总流程为：将phw2000载体与流感病毒的pa基因连接，构成phw-pa重组载体，然后将phw-pa重组载体与mlkl基因连接构成phw-pa-mlkl重组质粒，再将所述重组质粒与其余的重组流感病毒质粒(即包含流感病毒基因组中其它基因片段的重组流感病毒质粒)共同转染到293t细胞制成重组流感病毒，并通过鸡胚扩增所述重组流感病毒后于体内、外验证所述重组流感病毒的杀伤作用(具体参见图1)。
17.技术效果
18.1.本分发明所用甲型流感病毒与腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、柯萨基病毒、麻疹病毒等溶瘤病毒相比，具有毒性低，安全性较高，靶向性高的优点；并且其本身不仅能裂解肿瘤细胞，还能引起肿瘤细胞坏死性凋亡，激活机体免疫系统。
19.2.本发明在甲型流感病毒上表达mlkl蛋白，能进一步增强甲型流感病毒杀伤肿瘤细胞能力以及激活机体免疫系统能力。
20.3.本发明提供的基于a/puerto rico/8/34(h1n1)(pr8)甲流病毒的递送系统对人体无明显毒性，操作简单且能直接体内递送目的基因。
附图说明
21.图1为本发明总流程图；
22.图2为phw2000-pa-mlkl质粒图部分片段；
23.图3为mlkl rt-pcr电泳结构图；
qgyqvklagf elrktqtsms lgttrektdr vkstaylspq eledvfyqyd vkseiysfgi vlweiatgdipfqgcnseki rklvavkrqq eplgedcpse lreiidecra hdpsvrpsvd eilkklstfsk
36.将phw2000-pa(具体来源请参见hoffmann e,mrauss s,perez d,et.al.,eight plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines.vaccine,2002,20:3165-70)用q5 high-fidelity dna酶按实验条件为98℃30s；98℃5-10s；50-72℃10-30s；72℃20-30s/kb；72℃2min；4℃∞进行线性化，得到phw2000-pa线性化载体2。
37.将含有mlkl的dna分子线性化片段1与phw2000线性化载体2利用exoiii酶按实验条件37℃5-15min；65℃20min进行连接，得到重组载体，该重组载体命名为phw-pa-mlkl(质粒的结构图参见图2)，其可以表达seq id no:2所示的mlkl。
38.实施例2重组流感病毒的拯救
39.将phw2000(具体来源请参见hoffmann e,mrauss s,perez d,etal.eight plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines.vaccine,2002,20:3165-70)用q5 high-fidelity dna 酶进行线性化处理后，与流感病毒a/puerto rico/8/34(h1n1)(pr8)的ha基因、na基因、pb2基因、pb1基因、np基因、m基因和ns基因利用exoiii进行连接酶进行连接，得重组载体phw-ha、phw-na、phw-pb2、phw-pb1、phw-np、phw-m和phw-ns。其中，所述ha基因、na基因、pb2基因、pb1基因、np基因、m基因和ns基因的序列分别如seq id no：3-9所示。
40.将实施例1制备得到的重组载体phw-pa-mlkl与上述重组载体phw-na、phw-np、phw-pb1、phw-pb2、phw-ns、phw-ha和phw-m共8种载体以每种载体约250ng的量进行混合，并加入转染试剂室温孵育，转染到人肾细胞293t中，收集细胞上清液。具体操作为：将8个质粒，每个约250ng目的质粒，与opti-mem 50μl、脂质体4.5μl先孵育30min，再加200μl opti-mem混合后加入铺好的24孔293t细胞，孵育6小时换液，加入无血清含抗生素含有tpck胰酶(1μg/ml)的1ml mem，培养3天，收集细胞上清液。
41.将所述细胞上清液接种于spf鸡胚，收取鸡胚尿囊液并对其进行血凝(ha)试验。进一步经扩大培养、浓缩、纯化、得到重组流感病毒株flu-mlkl，-80℃冻存。其中所述扩大培养的具体操作为：给6-8天的鸡胚接种100-200μl初代病毒，于33℃培养3天后吸取尿囊液，-80℃长期保存或4℃短期保存。
42.实施例3、重组流感病毒的鉴定
43.(1)将实施例2制备获得的重组流感病毒株flu-mlkl经磷钨酸负染液负染后经透射电镜观察病毒形态，结果表明flu-mlkl符合流感病毒典型形态特征，有包膜，表面有刺突结构，病毒颗粒大小在80-120nm之间。
44.(2)将所述重组流感病毒株flu-mlkl接种spf鸡胚传代，提取病毒rna，经过rt-pcr，扩增出正确的mlkl基因(具体参见图3)。
45.具体操作为，给6-8天鸡胚接种100-200μl初代病毒，于33℃培养3天后吸取尿囊液，得到的病毒经过逆转后进行凝胶电泳以及测序验证基因无突变。
46.实施例4重组流感病毒flu-mlkl对肿瘤细胞的特异性作用
47.将h1975人肺腺癌细胞(购自美国典型培养生物典藏中心(atcc，中国上海))消化后用带有10％胎牛血清和相应dmem、1640培养基以5000个/孔铺于96孔板，每孔200μl，37℃培养12h。将重组流感病毒flu-mlkl分别对每种细胞接种(等体积dmem为空白对照，图4中标
注为nc)，于37℃、5％co2条件下进行培养24h、48h、72h，接着每孔加入10％cck8，37℃培养2h，采用酶标仪检测430nm下的吸光值。
48.以不同时间点为横坐标，生长抑制率为纵坐标，比较重组流感病毒flu-mlkl与普通甲型流感病毒a/puerto rico/8/34(h1n1)(pr8)(图4中标注为iav)，处理不同时间增殖程度，(参见图4)。
49.按照上述步骤，按照活细胞tcid50的感染系数moi替换为为0、0.1、0.5、1、5，对每种细胞接种flu-mlkl悬浮液，培养24h后检测吸光值。(h1975细胞生长抑制情况具体参见图5)
50.结果表明，flu-mlkl病毒液和iav病毒液均可以抑制肿瘤细胞增殖，flu-mlkl病毒液引起抑制作用比相同条件下iav病毒液引起的抑制作用更高，这种抑制作用具有时间依赖性与剂量依赖性(具体参见图4、5)。
51.实施例5重组流感病毒flu-mlkl对肿瘤细胞的杀伤作用
52.将h1975人肺腺癌细胞(购自美国典型培养生物典藏中心(atcc，中国上海))消化后用带有10％胎牛血清和相应dmem、1640培养基以5
×
105个/孔铺于6孔板，每孔加入2ml，37℃培养12h。将重组流感病毒flu-mlkl用不带血清的培养基重悬，按照活细胞tcid50的感染系数moi为0、0.1、0.5、1、5，分别对每种细胞接种flu-mlk悬浮液(每种细胞分别接种等体积的普通iav作为对照，等体积dmem为空白对照)，于37℃、5％co2下培养24h，接着将每孔细胞用0.25％胰酶消化下来，pbs洗两遍；然后用(bd pharmingen
tm fitc annexin v apoptosis detection kit i，556547)1ml的binding buffer(0.1mhepes/naoh(ph 7.4),1.4m nacl,25mm cacl2)重悬，最终使细胞浓度为1
×
106个/ml。取binding buffer重悬的肿瘤细胞悬浮液100μl，加入5μl荧光探针annexin-v，5μl pi(bd pharmingen
tm fitc annexin v apoptosis detection kit i，556547)，混匀，室温避光孵育15min；再加入400μl binding buffer，混匀。然后，立即用流式细胞仪定量检测。
53.图7：将不同moi(具体分别为0、0.1、0.5、1、5)的重组流感病毒flu-mlkl感染h1975肿瘤细胞，培养24h后，用0.25％胰酶消化后，用annexinv\pi染色后流式检测细胞死亡情况。
54.结果表明，包含flu-mlkl的病毒液和包含iav的病毒液均可以杀伤肿瘤细胞，但flu-mlkl病毒液引起肿瘤细胞的死亡率比相同条件下iav病毒液引起的肿瘤细胞的死亡率更高(参见图6)。
55.实施例6重组流感病毒flu-mlkl对肿瘤细胞的体内抑制作用
56.(1)制备小鼠皮下肿瘤模型
57.在每只4周龄的c57/bl小鼠于右侧后背部皮下接种1
×
106个a549细胞(购自美国典型培养生物典藏中心(atcc，中国上海))，分别于第7、9、11、13、15、17、19和21天，即每隔两天测量肿瘤长径和短径，并计算肿瘤体积。肿瘤体积＝(最长直径
×
最短直径2)/2。
58.(2)瘤内注射flu-mlkl处理
59.当肿瘤体积》100mm3，瘤内注射30μl重组流感病毒flu-mlkl，(对照组为iav普通病毒，pbs为空白对照)，隔天一次，总共四次；治疗后每隔两天观察小鼠体重、肿瘤体积变化以及小鼠生存期变化。
60.结果表明，与接受pbs注射的小鼠相比，用iav普通病毒治疗减缓了右侧后背部肿
瘤的生长；注射flu-mlkl的小鼠显示出肿瘤体积增长最慢(参见图7)。
61.实施例7：体外检测重组流感病毒flu-mlkl的递送效率
62.将重组流感病毒flu-mlkl(moi＝1)接种h1975细胞后，于37℃孵育24h，用1ml 0.25％胰酶消化细胞约3分钟，trizol法提取细胞rna，使用ⅲ1st strand cdna synthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)试剂盒加入5
×
gdna digester mix后42℃2分钟，再加入ⅲsupermix plus 25℃5min；55℃15min；85℃5min得到cdna，逆转录后用roche kapafast试剂盒，实验条件为95℃30s 95℃10s；60℃30s；65℃5s；95℃5min；进行q-pcr实验验证mlkl表达情况。(具体参见图8)
63.试验结果：在24h时，与pr8比，flu-mlkl感染后的细胞mlkl mrna含量显著增加。
64.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
65.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
66.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
67.附录
68.seq id no：3-9的核苷酸序列分别如下：
69.ha基因的核苷酸序列(seq id no：3)
70.atgaaggcaaacctactggtcctgttatgtgcacttgcagctgcagatgcagacacaatatgtataggctaccatgcgaacaattcaaccgacactgttgacacagtgctcgagaagaatgtgacagtgacacactctgttaacctgctcgaagacagccacaacggaaaactatgtagattaaaaggaatagccccactacaattggggaaatgtaacatcgccggatggctcttgggaaacccagaatgcgacccactgcttccagtgagatcatggtcctacattgtagaaacaccaaactctgagaatggaatatgttatccaggagatttcatcgactatgaggagctgagggagcaattgagctcagtgtcatcattcgaaagattcgaaatatttcccaaagaaagctcatggcccaaccacaacacaaccaaaggagtaacggcagcatgctcccatgcggggaaaagcagtttttacagaaatttgctatggctgacggagaaggagggctcatacccaaagctgaaaaattcttatgtgaacaagaaagggaaagaagtccttgtactgtggggtattcatcacccgtctaacagtaaggatcaacagaatatctatcagaatgaaaatgcttatgtctctgtagtgacttcaaattataacaggagatttaccccggaaatagcagaaagacccaaagtaagagatcaagctgggaggatgaactattactggaccttgctaaaacccggagacacaataatatttgaggcaaatggaaatctaatagcaccaaggtatgctttcgcactgagtagaggctttgggtccggcatcatcacctcaaacgcatcaatgcatgagtgtaacacgaagtgtcaaacacccctgggagctataaacagcagtctccctttccagaatatacacccagtcacaataggagagtgcccaaaatacgtcaggagtgccaaattgaggatggttacaggactaaggaacattccgtccattcaatccagaggtctatttggagccattgccggttttattgaagggggatggactggaatgatagatggatggtacggttatcatcatcagaatgaacagggatcaggctatgcagcggatcaaaaaagcacacaaaatgccattaacgggattacaaacaaggtgaactctgttatcgagaaaatgaacattcaattcacagctgtgggtaaagaattcaacaaattagaaaaaaggatggaaaatttaaataaaaaagttgatgatggatttctggacatttggacatataatgcagaattgttagttctactggaaaatgaaaggactctggatttccatgactcaaatgtgaagaatctgtatgagaaagtaaaaagccaattaaagaataatgccaaagaaatcggaaatggatgttttgagttctac
cacaagtgtgacaatgaatgcatggaaagtgtaagaaatgggacttatgattatcccaaatattcagaagagtcaaagttgaacagggaaaaggtagatggagtgaaattggaatcaatggggatctatcagattctggcgatctactcaactgtcgccagttcactggtgcttttggtctccctgggggcaatcagtttctggatgtgttctaatggatctttgcagtgcagaatatgcatctga
71.na基因的核苷酸序列(seq id no：4)
72.atgaatccaaatcagaaaataataaccattggatcaatctgtctggtagtcggactaattagcctaatattgcaaatagggaatataatctcaatatggattagccattcaattcaaactggaagtcaaaaccatactggaatatgcaaccaaaacatcattacctataaaaatagcacctgggtaaaggacacaacttcagtgatattaaccggcaattcatctctttgtcccatccgtgggtgggctatatacagcaaagacaatagcataagaattggttccaaaggagacgtttttgtcataagagagccctttatttcatgttctcacttggaatgcaggaccttttttctgacccaaggtgccttactgaatgacaggcattcaaatgggactgttaaggacagaagcccttatagggccttaatgagctgccctgtcggtgaagctccgtccccgtacaattcaagatttgaatcggttgcttggtcagcaagtgcatgtcatgatggcatgggctggctaacaatcggaatttcaggtccagataatggagcagtggctgtattaaaatacaacggcataataactgaaaccataaaaagttggaggaagaaaatattgaggacacaagagtctgaatgtgcctgtgtaaatggttcatgttttactataatgactgatggcccgagtgatgggctggcctcgtacaaaattttcaagatcgaaaaggggaaggttactaaatcaatagagttgaatgcacctaattctcactatgaggaatgttcctgttaccctgataccggcaaagtgatgtgtgtgtgcagagacaattggcatggttcgaaccggccatgggtgtctttcgatcaaaacctggattatcaaataggatacatctgcagtggggttttcggtgacaacccgcgtcccaaagatggaacaggcagctgtggtccagtgtatgttgatggagcaaacggagtaaagggattttcatataggtatggtaatggtgtttggataggaaggaccaaaagtcacagttccagacatgggtttgagatgatttgggatcctaatggatggacagagactgatagtaagttctctgtgaggcaagatgttgtggcaatgactgattggtcagggtatagcgggagtttcgttcaacatcctgagctaacagggctagactgtataaggccgtgcttctgggttgaattaatcaggggacgacctaaagaaaaaacaatctggactagtgcgagcagcatttctttttgtggcgtgaatagtgatactgtagattggtcttggccagacggtgctgagttgccattcaccattgacaagtag
73.pb2基因的核苷酸序列(seq id no：5)
74.atggaaagaataaaagaactaagaaatctaatgtcgcagtctcgcacccgcgagatactcacaaaaaccaccgtggaccatatggccataatcaagaagtacacatcaggaagacaggagaagaacccagcacttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatatccaattacagcagacaagaggataacggaaatgattcctgagagaaatgagcaaggacaaactttatggagtaaaatgaatgatgccggatcagaccgagtgatggtatcacctctggctgtgacatggtggaataggaatggaccaatgacaaatacagttcattatccaaaaatctacaaaacttattttgaaagagtcgaaaggctaaagcatggaacctttggccctgtccattttagaaaccaagtcaaaatacgtcggagagttgacataaatcctggtcatgcagatctcagtgccaaggaggcacaggatgtaatcatggaagttgttttccctaacgaagtgggagccaggatactaacatcggaatcgcaactaacgataaccaaagagaagaaagaagaactccaggattgcaaaatttctcctttgatggttgcatacatgttggagagagaactggtccgcaaaacgagattcctcccagtggctggtggaacaagcagtgtgtacattgaagtgttgcatttgactcaaggaacatgctgggaacagatgtatactccaggaggggaagtgaagaatgatgatgttgatcaaagcttgattattgctgctaggaacatagtgagaagagctgcagtatcagcagacccactagcatctttattggagatgtgccacagcacacagattggtggaattaggatggtagacatccttaagcagaacccaacagaagagcaagccgtgggtatatgcaaggctgcaatgggactgagaattagctcatccttcagttttggtggattcacatttaagagaacaagcggatcatcagtcaagagagaggaagaggtgcttacgggcaatcttcaaacattgaagataagagtgcatgagggatatgaagagttcacaatggttgggagaagagcaacagccatactcagaaaagcaaccaggagattgattc
agctgatagtgagtgggagagacgaacagtcgattgccgaagcaataattgtggccatggtattttcacaagaggattgtatgataaaagcagttagaggtgatctgaatttcgtcaatagggcgaatcagcgactgaatcctatgcatcaacttttaagacattttcagaaggatgcgaaagtgctttttcaaaattggggagttgaacctatcgacaatgtgatgggaatgattgggatattgcccgacatgactccaagcatcgagatgtcaatgagaggagtgagaatcagcaaaatgggtgtagatgagtactccagcacggagagggtagtggtgagcattgaccggttcttgagagtccgggaccaacgaggaaatgtactactgtctcccgaggaggtcagtgaaacacagggaacagagaaactgacaataacttactcatcgtcaatgatgtgggagattaatggtcctgaatcagtgttggtcaatacctatcaatggatcatcagaaactgggaaactgttaaaattcagtggtcccagaaccctacaatgctatacaataaaatggaatttgaaccatttcagtctttagtacctaaggccattagaggccaatacagtgggtttgtgagaactctgttccaacaaatgagggatgtgcttgggacatttgataccgcacagataataaaacttcttcccttcgcagccgctccaccaaagcaaagtagaatgcagttctcctcatttactgtgaatgtgaggggatcaggaatgagaatacttgtaaggggcaattctcctgtattcaactacaacaaggccacgaagagactcacagttctcggaaaggatgctggcactttaaccgaagacccagatgaaggcacagctggagtggagtccgctgttctgaggggattcctcattctgggcaaagaagacaggagatatgggccagcattaagcatcaatgaactgagcaaccttgcgaaaggagagaaggctaatgtgctaattgggcaaggagacgtggtgttggtaatgaaacgaaaacgggactctagcatacttactgacagccagacagcgaccaaaagaattcggatggccatcaattag
75.pb1基因的核苷酸序列(seq id no：6)
76.atggatgtcaatccgaccttacttttcttaaaagtgccagcacaaaatgctataagcacaactttcccttataccggagaccctccttacagccatgggacaggaacaggatacaccatggatactgtcaacaggacacatcagtactcagaaaaggcaagatggacaacaaacaccgaaactggagcaccgcaactcaacccgattgatgggccactgccagaagacaatgaaccaagtggttatgcccaaacagattgtgtattggaagcaatggctttccttgaggaatcccatcctggtatttttgaaaactcgtgtattgaaacgatggaggttgttcagcaaacacgagtagacaagctgacacaaggccgacagacctatgactggactttaaatagaaaccagcctgctgcaacagcattggccaacacaatagaagtgttcagatcaaatggcctcacggccaatgagtctggaaggctcatagacttccttaaggatgtaatggagtcaatgaaaaaagaagaaatggggatcacaactcattttcagagaaagagacgggtgagagacaatatgactaagaaaatgataacacagagaacaataggtaaaaggaaacagagattgaacaaaaggagttatctaattagagcattgaccctgaacacaatgaccaaagatgctgagagagggaagctaaaacggagagcaattgcaaccccagggatgcaaataagggggtttgtatactttgttgagacactggcaaggagtatatgtgagaaacttgaacaatcagggttgccagttggaggcaatgagaagaaagcaaagttggcaaatgttgtaaggaagatgatgaccaattctcaggacaccgaactttctttgaccatcactggagataacaccaaatggaacgaaaatcagaatcctcggatgtttttggccatgatcacatatatgaccagaaatcagcccgaatggttcagaaatgttctaagtattgctccaataatgttctcaaacaaaatggcgagactgggaaaagggtatatgtttgagagcaagagtatgaaacttagaactcaaatacctgcagaaatgctagcaagcattgatttgaaatatttcaatgattcaacaagaaagaagattgaaaaaatccgaccgctcttaatagaggggactgcatcattgagccctggaatgatgatgggcatgttcaatatgttaagcactgtattaggcgtctccatcctgaatcttggacaaaagagatacaccaagactacttactggtgggatggtcttcaatcctctgacgattttgctctgattgtgaatgcacccaatcatgaagggattcaagccggagtcgacaggttttatcgaacctgtaagctacatggaatcaatatgagcaagaaaaagtcttacataaacagaacaggtacatttgaattcacaagttttttctatcgttatgggtttgttgccaatttcagcatggagcttcccagttttggtgtgtctgggagcaacgagtcagcggacatgagtattggagttactgtcatcaaaaacaatatgataaacaatgatcttggtccagcaacagctcaaatggcccttcagttgttcatcaaagattacaggtacacgtaccgatgccatagaggtgacacacaaatacaaacccgaagatcatttgaaataaagaaactgtgggagcaaacccgttccaaagctgg
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77.np基因的核苷酸序列(seq id no：7)
78.atggcgtcccaaggcaccaaacggtcttacgaacagatggagactgatggagaacgccagaatgccactgaaatcagagcatccgtcggaaaaatgattggtggaattggacgattctacatccaaatgtgcacagaacttaaactcagtgattatgagggacggttgatccaaaacagcttaacaatagagagaatggtgctctctgcttttgacgaaaggagaaataaatacctggaagaacatcccagtgcggggaaggatcctaagaaaactggaggacctatatacagaagagtaaacggaaagtggatgagagaactcatcctttatgacaaagaagaaataaggcgaatctggcgccaagctaataatggtgacgatgcaacggctggtctgactcacatgatgatctggcattccaatttgaatgatgcaacttatcagaggacaagggctcttgttcgcaccggaatggatcccaggatgtgctctctgatgcaaggttcaactctccctaggaggtctggagccgcaggtgctgcagtcaaaggagttggaacaatggtgatggaattggtcaggatgatcaaacgtgggatcaatgatcggaacttctggaggggtgagaatggacgaaaaacaagaattgcttatgaaagaatgtgcaacattctcaaagggaaatttcaaactgctgcacaaaaagcaatgatggatcaagtgagagagagccgggacccagggaatgctgagttcgaagatctcacttttctagcacggtctgcactcatattgagagggtcggttgctcacaagtcctgcctgcctgcctgtgtgtatggacctgccgtagccagtgggtacgactttgaaagagagggatactctctagtcggaatagaccctttcagactgcttcaaaacagccaagtgtacagcctaatcagaccaaatgagaatccagcacacaagagtcaactggtgtggatggcatgccattctgccgcatttgaagatctaagagtattgagcttcatcaaagggacgaaggtggtcccaagagggaagctttccactagaggagttcaaattgcttccaatgaaaatatggagactatggaatcaagtacacttgaactgagaagcaggtactgggccataaggaccagaagtggaggaaacaccaatcaacagagggcatctgcgggccaaatcagcatacaacctacgttctcagtacagagaaatctcccttttgacagaacaaccgttatggcagcattcactgggaatacagaggggagaacatctgacatgaggaccgaaatcataaggatgatggaaagtgcaagaccagaagatgtgtctttccaggggcggggagtcttcgagctctcggacgaaaaggcagcgagcccgatcgtgccttcctttgacatgagtaatgaaggatcttatttcttcggagacaatgcagaggagtacgacaattaa
79.m基因的核苷酸序列(seq id no：8)
80.atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcatcccgtcaggccccctcaaagccgagatcgcacagagacttgaagatgtctttgcagggaagaacaccgatcttgaggttctcatggaatggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgcccttaatgggaacggggatccaaataacatggacaaagcagttaaactgtataggaagctcaagagggagataacattccatggggccaaagaaatctcactcagttattctgctggtgcacttgccagttgtatgggcctcatatacaacaggatgggggctgtgaccactgaagtggcatttggcctggtatgtgcaacctgtgaacagattgctgactcccagcatcggtctcataggcaaatggtgacaacaaccaacccactaatcagacatgagaacagaatggttttagccagcactacagctaaggctatggagcaaatggctggatcgagtgagcaagcagcagaggccatggaggttgctagtcaggctaggcaaatggtgcaagcgatgagaaccattgggactcatcctagctccagtgctggtctgaaaaatgatcttcttgaaaatttgcaggcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgatcc
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81.ns基因的核苷酸序列(seqidno：9)
82.atggatccaaacactgtgtcaagctttcaggtagattgctttctttggcatgtccgcaaacgagttgcagaccaagaactaggtgatgccccattccttgatcggcttcgccgagatcagaaatccctaagaggaaggggcagcactcttggtctggacatcgagacagccacacgtgctggaaagcagatagtggagcggattctgaaagaagaatccgatgaggcacttaaaatgaccatggcctctgtacctgcgtcgcgttacctaaccgacatgactcttgaggaaatgtcaagggaatggtccatgctcatacccaagcagaaagtggcaggccctctttgtatcagaatggaccaggcgatcatggataaaaacatcatactgaaagcgaacttcagtgtgatttttgaccggctggagactctaatattgctaagggctttcaccgaagagggagcaattgttggcgaaatttcaccattgccttctcttccaggacatactgctgaggatgtcaaaaatgcagttggagtcctcatcggaggacttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaactctacagagattcgcttggagaagcagtaatgagaatgggagacctccactcactccaaaacagaaacgagaaatggcgggaacaattaggtcagaagtttgaagaaataagatggttgattgaagaagtgagacacaaactgaaggtaacagagaatagttttgagcaaataacatttatgcaagccttacatctattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcatttcagcttatttaa。

技术特征：
1.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒中包含甲型流感病毒的基因组片段和编码混合谱系激酶结构域样蛋白(mlkl)的基因。2.如权利要求1所述重组病毒，其中，将所述编码mlkl蛋白的基因装载到所述甲型流感病毒的基因组中。3.如权利要求1所述重组病毒，其中，所述甲型流感病毒的基因组片段包含编码聚合酶碱性蛋白2(pb2)、聚合酶碱性蛋白1(pb1)、聚合酶酸性蛋白(pa)、血凝素(ha)，核蛋白(np)，神经氨酸酶(na)、基质蛋白(m)和非结构蛋白(ns)的基因序列。4.如权利要求1所述的重组病毒，其中，(i)所述编码mlkl的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述mlkl的氨基酸序列如seq id no:2所示；或者(ii)所述编码mlkl的核苷酸序列与seq id no:1具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；所述mlkl的氨基酸序列与seq id no:2具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。5.如权利要求1-4中任一项所述的重组病毒，其中所述甲型流感病病毒的毒株为a/puerto rico/8/34。6.一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体和如权利要求1-5中任一项所述的重组病毒。7.如权利要求1-5中任一项所述的重组病毒在作为rna/基因递送载体中的用途。8.如权利要求1-5中任一项所述的重组病毒或如权利要求6所述的药物组合物在制备抑制或杀死肿瘤细胞的药物中的用途；优选的，所述肿瘤是选自由头颈部、肺、乳腺、胰腺、肾、肝、胃、结肠、卵巢、子宫、前列腺、膀胱或血液组成的组中的任一项中的肿瘤。9.如权利要求1-5中任一项所述的重组病毒或如权利要求6所述的药物组合物在制备激活机体免疫系统能力的药物中的用途。

技术总结
本发明提供了一种体内基因递送系统及其应用。本发明涉及一种重组病毒，其中包含甲型流感病毒和编码人混合谱系激酶结构域样(MLKL)蛋白的基因。通过将MLKL装载到甲型流感病毒基因，局部应用本基因递送系统，在病毒自身复制的同时表达MLKL，加强细胞坏死性凋亡，从而增加细胞免疫原性死亡比例，并进一步激活机体免疫反应，以达到杀伤肿瘤，激活抗肿瘤免疫的效果。本发明提供了一种靶向杀伤肿瘤细胞的重组溶瘤病毒，而对正常宿主细胞无明显影响，可用于肿瘤的靶向治疗。可用于肿瘤的靶向治疗。可用于肿瘤的靶向治疗。


技术研发人员：李谨 宋文俊 张振辉
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）
技术研发日：2022.08.30
技术公布日：2023/7/22