五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法与检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析及药物质量控制技术领域，特别是涉及一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法与检测方法。


背景技术：

2.中药五灵脂(faeces trogopterori)为鼯鼠科动物复齿鼯鼠(trogopterus xanthipes milne-edwards)的干燥粪便，具有止痛与活血化瘀等功效，常用于淤血所致的痛经与心绞痛等症。在临床上，五灵脂可应用于妇科、心脑血管科及消化系统疾病的治疗。近代药理学研究证明其具有抗血小板凝聚、促进纤维蛋白溶解、抗炎抗溃疡、抗毒性抑制真菌和结核杆菌、提高免疫力以及清除自由基抗氧化等多方面的作用。五灵脂主产于陕西、河南、河北、山西与湖北等地，野生收集不易，目前多为人工饲养采集，是较为常用的中药。
3.目前关于五灵脂的化学成分研究报道较少，已有研究报道显示，五灵脂主含三萜、酚酸、简单单萜及含氮类化合物。由于五灵脂为复齿鼯鼠的排泄物，所以五灵脂所含成分与复齿鼯鼠的生活习性和环境关系密切，随意性较大，导致可控性较差。因此有必要进一步完善并统一五灵脂药材、饮片及其制剂的质量标准。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其充分反映了五灵脂的色谱峰信息，展示了五灵脂标准汤剂的主要化学成分，为快速、高效地分离、制备和鉴定五灵脂标准汤剂的主要化学成分奠定基础。
5.本发明通过如下技术方案实现。
6.一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
7.取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备供试品溶液；
8.将所述供试品溶液进行高效液相色谱分析，构建所述五灵脂标准汤剂的特征图谱；
9.其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％。
10.在其中一个实施例中，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，流速为0.20ml/min～0.30ml/min；和/或，波长为260nm～280nm。
11.在其中一个实施例中，所述色谱柱的规格包括：柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。
12.在其中一个实施例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
13.将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。
14.在其中一个实施例中，超声提取的条件包括：温度为25℃～35℃；功率为250w～350w；频率为35khz～45khz；时间为20min～40min。
15.在其中一个实施例中，所述特征图谱包含8个特征峰，以苯甲酸对照品所对应的峰6为参照物峰s，峰1的相对保留时间为0.269～0.329，峰2的相对保留时间为0.411～0.502，峰3的相对保留时间为0.504～0.617，峰4的相对保留时间为0.534～0.653，峰5的相对保留时间为0.767～0.938，峰7的相对保留时间为0.993～1.213，峰8的相对保留时间为1.146～1.400。
16.在其中一个实施例中，所述五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法还包括如下步骤：
17.取原儿茶酸对照品、对羟基苯甲酸对照品、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品、间羟基苯甲酸对照品、苯甲酸对照品、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品与五灵脂素a对照品，分别制备对照品溶液；
18.将所述对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，并与所述五灵脂标准汤剂的特征图谱中的共有峰进行比对；
19.其中，(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid的化学结构式如式(1)所示：
[0020][0021]
所述五灵脂素a的化学结构如式(2)所示：
[0022][0023]
在其中一个实施例中，分别制备对照品溶液包括如下步骤：
[0024]
分别将所述原儿茶酸对照品、对羟基苯甲酸对照品、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品、间羟基苯甲酸对照品、苯甲酸对照品、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品、五灵脂素a对照品与甲醇混合。
[0025]
在其中一个实施例中，峰1为原儿茶酸的峰；峰2为对羟基苯甲酸的峰；峰3为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸的峰；峰4为间羟基苯甲酸的峰；峰6为苯甲酸的峰；峰7为(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid的峰；峰8为五灵脂素a的峰。
[0026]
在其中一个实施例中，所述五灵脂标准汤剂的冻干粉的制备包括如下步骤：
[0027]
混合五灵脂饮片与水，浸泡20min～40min后第一次煎煮，第一次过滤，取滤饼与水混合，第二次煎煮，第二次过滤；
[0028]
合并第一次过滤的滤液与第二次过滤的滤液，减压浓缩，然后冷冻干燥。
[0029]
本发明还提供一种五灵脂标准汤剂的检测方法，包括如下步骤：
[0030]
取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备待测样品溶液；
[0031]
将所述待测样品溶液进行高效液相色谱检测；
[0032]
其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％。
[0033]
在其中一个实施例中，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，流速为0.20ml/min～0.30ml/min；和/或，波长为260nm～280nm。
[0034]
在其中一个实施例中，所述色谱柱的规格包括：柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。
[0035]
在其中一个实施例中，制备待测品溶液包括如下步骤：
[0036]
将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。
[0037]
与现有技术相比较，本发明所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法具有如下有益效果：
[0038]
本发明采用高效液相色谱法建立五灵脂标准汤剂的特征图谱，通过限定流动相以及梯度洗脱程序，成功展示了五灵脂标准汤剂的主要化学成分，为五灵脂标准汤剂质量标准的研究和提升提供依据，同时也为快速、高效地分离、制备和鉴定五灵脂标准汤剂的主要化学成分奠定基础。
[0039]
进一步地，本发明所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱构建方法操作简单并且重现性好。
附图说明
[0040]
图1为本发明提供的15批五灵脂标准汤剂的特征图谱；
[0041]
图2为本发明提供的五灵脂标准汤剂对照特征图谱；
[0042]
图3为本发明提供的对照品溶液与供试品溶液uplc对比图谱；
[0043]
图4为本发明提供的原儿茶酸对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0044]
图5为本发明提供的对羟基苯甲酸对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0045]
图6为本发明提供的3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0046]
图7为本发明提供的间羟基苯甲酸对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0047]
图8为本发明提供的苯甲酸对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0048]
图9为本发明提供的(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0049]
图10为本发明提供的五灵脂素a对照品溶液与供试品溶液特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比图；
[0050]
图11为本发明提供的对照品参照物溶液与供试品溶液的特征图谱。
具体实施方式
[0051]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0052]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
[0053]
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
[0054]
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
[0055]
除非另外指明，在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。
[0056]
除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在30℃的环境。
[0057]
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由
…
组成”和“基本上由
…
组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组份、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。
[0058]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个
相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0059]
本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0060]
取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备供试品溶液；
[0061]
将供试品溶液进行高效液相色谱分析，构建五灵脂标准汤剂的特征图谱；
[0062]
其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％。
[0063]
可以理解地，在本发明中，磷酸水溶液的质量分数包括但不限于0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％。
[0064]
本发明采用高效液相色谱法建立五灵脂标准汤剂的特征图谱，通过筛选出流动相为乙腈与磷酸水溶液，并限定了梯度洗脱程序，成功展示了五灵脂标准汤剂的主要化学成分。
[0065]
在一个具体的示例中，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
[0066]
在一个具体的示例中，高效液相色谱分析的条件还包括：柱温为25℃～35℃。
[0067]
可以理解地，在本发明中，柱温包括但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。
[0068]
在一个具体的示例中，高效液相色谱分析的条件还包括：流速为0.2ml/min～0.3ml/min。
[0069]
可以理解地，在本发明中，流速包括但不限于0.2ml/min、0.21ml/min、0.22ml/min、0.23ml/min、0.24ml/min、0.25ml/min、0.26ml/min、0.27ml/min、0.28ml/min、0.29ml/min、0.3ml/min。
[0070]
在一个具体的示例中，高效液相色谱分析的条件还包括：波长为260nm～280nm。
[0071]
可以理解地，波长包括但不限于260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm。
[0072]
更具体地，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；和/或，柱温为30℃；和/或，流速为0.25ml/min；和/或，波长为270nm。
[0073]
在一个具体的示例中，色谱柱的规格包括：柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。
[0074]
更具体地，色谱柱的规格包括：柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm。
[0075]
在一个具体的示例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
[0076]
将五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。
[0077]
更具体地，将五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为70％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。
[0078]
在一个具体的示例中，超声提取的条件包括：温度为25℃～35℃；功率为250w～
350w；频率为35khz～45khz；时间为20min～40min。
[0079]
可以理解地，超声的温度包括但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。
[0080]
可以理解地，超声的功率包括但不限于250w、260w、270w、280w、290w、300w、310w、320w、330w、340w、350w。
[0081]
可以理解地，超声的频率包括但不限于35khz、36khz、37khz、38khz、39khz、40khz、41khz、42khz、43khz、44khz、45khz。
[0082]
可以理解地，超声的时间包括但不限于20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min。
[0083]
更具体地，超声提取的条件包括：温度为30℃；功率为300w；频率为40khz；时间为30min。
[0084]
在一个具体的示例中，特征图谱包含8个特征峰，以苯甲酸对照品所对应的峰6为参照物峰s，峰1的相对保留时间为0.269～0.329，峰2的相对保留时间为0.411～0.502，峰3的相对保留时间为0.504～0.617，峰4的相对保留时间为0.534～0.653，峰5的相对保留时间为0.767～0.938，峰7的相对保留时间为0.993～1.213，峰8的相对保留时间为1.146～1.400。
[0085]
在一个具体的示例中，五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法还包括如下步骤：
[0086]
取原儿茶酸对照品、对羟基苯甲酸对照品、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品、间羟基苯甲酸对照品、苯甲酸对照品、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品与五灵脂素a对照品，分别制备对照品溶液；
[0087]
将对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，并与五灵脂标准汤剂的特征图谱中的共有峰进行比对；
[0088]
其中，(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid的化学结构式如式(1)所示：
[0089][0090]
五灵脂素a的化学结构如式(2)所示：
[0091]
[0092]
可以理解地，对照品溶液进行高效液相色谱分析的条件与供试品溶液的高效液相色谱分析的条件一致：高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％；和/或
[0093]
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，流速为0.20ml/min～0.30ml/min；和/或，波长为260nm～280nm；和/或
[0094]
柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。
[0095]
在一个具体的示例中，分别制备对照品溶液包括如下步骤：
[0096]
分别将原儿茶酸对照品、对羟基苯甲酸对照品、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品、间羟基苯甲酸对照品、苯甲酸对照品、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品、五灵脂素a对照品与甲醇混合。
[0097]
在一个具体的示例中，峰1为原儿茶酸的峰；峰2为对羟基苯甲酸的峰；峰3为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸的峰；峰4为间羟基苯甲酸的峰；峰6为苯甲酸的峰；峰7为(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid的峰；峰8为五灵脂素a的峰。
[0098]
本发明成功从五灵脂标准汤剂中分离出7个化合物对应的特征峰，这为五灵脂标准汤剂质量标准的研究和提升提供依据，同时也为快速、高效地分离、制备和鉴定五灵脂标准汤剂的主要化学成分奠定基础。
[0099]
在一个具体的示例中，五灵脂标准汤剂的冻干粉的制备包括如下步骤：
[0100]
混合五灵脂饮片与水，浸泡20min～40min后第一次煎煮，第一次过滤，取滤饼与水混合，第二次煎煮，第二次过滤；
[0101]
合并第一次过滤的滤液与第二次过滤的滤液，减压浓缩，然后冷冻干燥。
[0102]
在一个具体的示例中，混合五灵脂饮片与8倍量的水，浸泡20min～40min后第一次煎煮。
[0103]
在一个具体的示例中，取滤饼与6倍量的水混合，第二次煎煮。
[0104]
更具体地，五灵脂标准汤剂的冻干粉的制备包括如下步骤：
[0105]
混合五灵脂饮片与8倍量的水，浸泡30min后武火煮沸后文火保持微沸30min，趁热第一次过滤，取滤饼与6倍量的水混合，武火煮沸后文火保持微沸25min，趁热第二次过滤；合并两次过滤后的滤液，减压浓缩，然后冷冻干燥。
[0106]
本发明还提供一种五灵脂标准汤剂的检测方法，包括如下步骤：
[0107]
取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备待测样品溶液；
[0108]
将待测样品溶液进行高效液相色谱检测；
[0109]
其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％。
[0110]
在一个具体的示例中，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷
键合硅胶柱；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，流速为0.2ml/min～0.3ml/min；和/或，波长为260nm～280nm。
[0111]
在一个具体的示例中，色谱柱的规格包括：柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。
[0112]
在一个具体的示例中，制备待测品溶液包括如下步骤：
[0113]
将五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。
[0114]
以下结合具体实施例对本发明的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
[0115]
实施例1
[0116]
本实施例提供一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，具体如下：
[0117]
一、仪器与试剂
[0118]
1.1仪器
[0119]
waters arc uhplc-dad-qda联用仪(美国waters公司)；岛津lc-20ar制备液相(日本岛津公司)；bruker avanceⅲ400mhz核磁共振波谱仪(德国bruker公司)；超纯水系统milli-q direct(德国默克公司)；万分之一天平me204e(瑞士梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器kq-500de(中国昆山市超声仪器有限公司)。
[0120]
1.2试剂与试药
[0121]
甲醇(色谱纯，德国默克公司)；水为自制超纯水；其它试剂均为分析纯。
[0122]
试药：15批不同产地的五灵脂饮片，具体信息见表1所示。苯甲酸对照品(批号：100419-201703，含量：99.9％，中国食品药品检定研究院)。
[0123]
表1 12批川木通样品产地信息表
[0124][0125][0126]
二、实验过程
[0127]
1、供试品溶液的制备
[0128]
取五灵脂饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟后，武火(500w)煮沸后，文火(200w)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次煎煮加6倍量水，武火(500w)煮沸后，文火(200w)保持微沸25分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得到五灵脂饮片标准汤剂冻干粉。
[0129]
取五灵脂标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定重量，超声处理(温度30℃，功率300w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液0.2ml至25ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀，即得。
[0130]
2、对照品参照物溶液的制备
[0131]
取苯甲酸对照品适量，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0132]
3、色谱条件
[0133]
采用waters hss t3 c18(100mm
×
2.1mm,1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表2中的条件进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.25ml。
[0134]
表2梯度洗脱表
[0135][0136]
4、特征图谱的构建
[0137]
精密吸取上述15批不同产地的五灵脂标准汤剂供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。15批不同产地的五灵脂标准汤剂的特征图谱叠加图如图1所示，以苯甲酸对照品参照物峰对应的色谱峰6为参照，计算其余特征峰与峰6的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3和表4所示。
[0138]
表3 15批五灵脂标准汤剂特征图谱各特征峰的相对保留时间
[0139][0140]
表4 15批五灵脂标准汤剂特征图谱各特征峰的相对峰面积
[0141]
[0142]
将15批不同产地的五灵脂标准汤剂uplc特征图谱的.cdf文件导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统2012.130723》软件中进行共有峰匹配，以s1样品特征图谱为参照，采用多点校正，生成五灵脂标准汤剂对照特征图谱，见图2所示。
[0143]
根据15批五灵脂标准汤剂uplc特征图谱的测定结果，规定五灵脂标准汤剂特征图谱的标准为：供试品色图谱中应呈现8个特征峰，其中峰6应与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与苯甲酸对照品参照物峰相对应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰7和峰8与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.299(峰1)、0.457(峰2)、0.560(峰3)、0.593(峰4)、0.853(峰5)、1.103(峰7)、1.273(峰8)。
[0144]
实施例2
[0145]
本实施例提供一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的验证方法，具体如下：
[0146]
一、仪器与试剂
[0147]
1.1仪器
[0148]
waters arc uhplc-dad-qda联用仪(美国waters公司)；岛津lc-20ar制备液相(日本岛津公司)；bruker avanceⅲ400mhz核磁共振波谱仪(德国bruker公司)；超纯水系统milli-q direct(德国默克公司)；万分之一天平me204e(瑞士梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器kq-500de(中国昆山市超声仪器有限公司)。
[0149]
1.2试剂与试药
[0150]
甲醇(色谱纯，德国默克公司)；水为自制超纯水；其它试剂均为分析纯。
[0151]
试药：五灵脂饮片；原儿茶酸对照品(批号：110809-201906，含量：97.7％，中国食品药品检定研究院)、对羟基苯甲酸对照品(批号：101149-202204，100％，中国食品药品检定研究院)、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品(批号：201903，纯度大于98.0％，成都乐美天医药科技有限公司)、间羟基苯甲酸对照品(批号：s088105，含量：99.7％，成都瑞芬思生物科技有限公司)、苯甲酸对照品(批号：100419-201703，含量：99.9％，中国食品药品检定研究院)、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品(委托制备，批号：220621，含量：92.8％，广州牌牌生物科技有限公司)、五灵脂素a对照品(委托制备，批号：220612，含量：95.7％，广州牌牌生物科技有限公司)。
[0152]
二、实验过程
[0153]
1、供试品溶液的制备
[0154]
取五灵脂饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟后，武火(500w)煮沸后，文火(200w)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次煎煮加6倍量水，武火(500w)煮沸后，文火(200w)保持微沸25分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得到五灵脂饮片标准汤剂冻干粉。
[0155]
取五灵脂标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定重量，超声处理(温度30℃，功率300w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液0.2ml至25ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀，即得。
[0156]
2、对照品溶液的制备
[0157]
取原儿茶酸对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色
谱峰1对照品溶液；
[0158]
取对羟基苯甲酸对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色谱峰2对照品溶液；
[0159]
取3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色谱峰3对照品溶液；
[0160]
取间羟基苯甲酸对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色谱峰4对照品溶液；
[0161]
取苯甲酸对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色谱峰6对照品溶液；
[0162]
取(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色谱峰7对照品溶液；
[0163]
取五灵脂素a对照品，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的对照品溶液，过滤，制备色谱峰8对照品溶液；
[0164]
3、色谱条件
[0165]
采用waters hss t3 c18(100mm
×
2.1mm,1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按表2中的条件进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.25ml，并采用pda检测器在190～410nm波长范围内进行全波长扫描。
[0166]
4、测定
[0167]
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。对照品与样品特征图谱的特征峰对比结果如图3所示，对照品与样品特征图谱的特征峰紫外光谱吸收曲线对比见图4～图10所示。
[0168]
实施例3
[0169]
本实施例提供一种五灵脂标准汤剂特征图谱的检测方法，具体如下：
[0170]
一、仪器与试剂
[0171]
1.1仪器
[0172]
waters arc uhplc-dad-qda联用仪(美国waters公司)；岛津lc-20ar制备液相(日本岛津公司)；bruker avanceⅲ400mhz核磁共振波谱仪(德国bruker公司)；超纯水系统milli-q direct(德国默克公司)；万分之一天平me204e(瑞士梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器kq-500de(中国昆山市超声仪器有限公司)。
[0173]
1.2试剂与试药
[0174]
甲醇(色谱纯，德国默克公司)；水为自制超纯水；其它试剂均为分析纯。
[0175]
试药：五灵脂饮片；苯甲酸对照品(批号：100419-201703，含量：99.9％，中国食品药品检定研究院)
[0176]
二、实验过程
[0177]
1、供试品溶液的制备
[0178]
取五灵脂饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟后，武火(500w)煮沸后，文火(200w)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次煎煮加6倍量水，武火(500w)煮沸后，文火(200w)保持微沸25分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得
到五灵脂饮片标准汤剂冻干粉。
[0179]
取五灵脂标准汤剂冻干粉适量，研细，取0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定重量，超声处理(温度30℃，功率300w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液0.2ml至25ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀，即得。
[0180]
2、对照品参照物溶液的制备
[0181]
取苯甲酸对照品适量，加入甲醇溶解，制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0182]
3、色谱条件
[0183]
采用waters hss t3 c18(100mm
×
2.1mm,，1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按表2中的条件进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.25ml。
[0184]
4、测定
[0185]
精密吸取对照品溶液和供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图11所示，以与苯甲酸对照品参照物峰相对应的峰6为s峰，计算其余特征峰的相对保留时间，结果见表5所示，各特征峰的相对保留时间均在标准规定的范围内，证明该批次样品符合要求。
[0186]
表5五灵脂标准汤剂特征图谱测定结果
[0187][0188]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0189]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备供试品溶液；将所述供试品溶液进行高效液相色谱分析，构建所述五灵脂标准汤剂的特征图谱；其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％。2.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，流速为0.2ml/min～0.3ml/min；和/或，波长为260nm～280nm。3.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述色谱柱的规格包括：柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。4.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，制备供试品溶液包括如下步骤：将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。5.根据权利要求4所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，超声提取的条件包括：温度为25℃～35℃；功率为250w～350w；频率为35khz～45khz；时间为20min～40min。6.根据权利要求1～5任一项所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述特征图谱包含8个特征峰，以苯甲酸对照品所对应的峰6为参照物峰s，峰1的相对保留时间为0.269～0.329，峰2的相对保留时间为0.411～0.502，峰3的相对保留时间为0.504～0.617，峰4的相对保留时间为0.534～0.653，峰5的相对保留时间为0.767～0.938，峰7的相对保留时间为0.993～1.213，峰8的相对保留时间为1.146～1.400。7.根据权利要求1～5任一项所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法还包括如下步骤：取原儿茶酸对照品、对羟基苯甲酸对照品、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品、间羟基苯甲酸对照品、苯甲酸对照品、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品与五灵脂素a对照品，分别制备对照品溶液；将所述对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，并与所述五灵脂标准汤剂的特征图谱中的共有峰进行比对；其中，(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid的化学结构式如式(1)所示：
所述五灵脂素a的化学结构如式(2)所示：8.根据权利要求7所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，分别制备对照品溶液包括如下步骤：分别将所述原儿茶酸对照品、对羟基苯甲酸对照品、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸对照品、间羟基苯甲酸对照品、苯甲酸对照品、(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid对照品、五灵脂素a对照品与甲醇混合。9.根据权利要求7所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，峰1为原儿茶酸的峰；峰2为对羟基苯甲酸的峰；峰3为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸的峰；峰4为间羟基苯甲酸的峰；峰6为苯甲酸的峰；峰7为(+)-(1s,5r)-verbenon-10-oic acid的峰；峰8为五灵脂素a的峰。10.根据权利要求1～5任一项所述的五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述五灵脂标准汤剂的冻干粉的制备包括如下步骤：混合五灵脂饮片与水，浸泡20min～40min后第一次煎煮，第一次过滤，取滤饼与水混合，第二次煎煮，第二次过滤；合并第一次过滤的滤液与第二次过滤的滤液，减压浓缩，然后冷冻干燥。11.一种五灵脂标准汤剂的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备待测样品溶液；将所述待测样品溶液进行高效液相色谱检测；其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相a的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相a的体积百分数由20％变化至38％。12.根据权利要求11所述的五灵脂标准汤剂的检测方法，其特征在于，高效液相色谱分析的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；和/或，柱温为25℃～35℃；和/或，流
速为0.2ml/min～0.3ml/min；和/或，波长为260nm～280nm。13.根据权利要求11所述的五灵脂标准汤剂的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格包括：柱长为80mm～120mm，内径为1.9mm～2.3mm，填料粒径为1.6μm～2.0μm。14.根据权利要求11所述的五灵脂标准汤剂的检测方法，其特征在于，制备待测品溶液包括如下步骤：将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液。

技术总结
本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：取五灵脂标准汤剂的冻干粉，制备供试品溶液；将供试品溶液进行高效液相色谱分析，构建所述五灵脂标准汤剂的特征图谱；其中，高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～11min，流动相A的体积百分数由5％变化至15％；11min～20min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；20min～23min，流动相A的体积百分数保持为20％；23min～25min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％。20％变化至38％。20％变化至38％。


技术研发人员：李振雨 何广铭 马懿飞 杨洁 段志文 陈向东 何民友 邓淙友 吕渭升 孙冬梅
受保护的技术使用者：广东一方制药有限公司
技术研发日：2022.07.13
技术公布日：2023/7/22