一种用于响应胞内L-甲硫氨酸浓度的生物传感器

一种用于响应胞内l-甲硫氨酸浓度的生物传感器
技术领域
1.本发明属于生物化工领域，具体涉及一种检测待测菌株生产l-甲硫氨酸能力的生物传感器的构建及功能测试。


背景技术：

2.甲硫氨酸是一种必需氨基酸，广泛应用于饲料、食品加工以及制药等领域，年需求量已超过100万吨。德国赢创(evonik)在1950s首先实现了d,l-甲硫氨酸的化学合成，该路线现已成为甲硫氨酸的主流生产方法。但是d,l-甲硫氨酸的化学合成工艺需要以丙烯醛、甲硫醇和氢氰酸等剧毒石油基化合物为起始原料，反应过程需要高温高压，对环境影响较大，对设备维护和生产线选址、管理都有严苛的要求。受制于环境和成本等压力，我国尚未完全实现甲硫氨酸自给自足，2020年进口依赖度仍高达80％。
3.微生物可以利用清洁、廉价、可再生的原料工业化生产众多高附加值化学品，已广泛应用于饲料、食品、印染和制药等领域。但微生物中的l-甲硫氨酸生物合成途径复杂冗长，且受到多层次调控，导致l-甲硫氨酸高产菌株选育及发酵产业化技术开发进展缓慢。通过常规理性代谢工程设计优化合成途径中的基因表达及调控解除，可以有效提高l-甲硫氨酸的合成，但是离工业化应用仍有较大的差距，提示需要对底盘菌进行系统的设计和重构以实现发酵效价的突破。利用传统的诱变育种，如伽马射线、artp(常温常压等离子诱变)、亚硝基胍等物理化学手段，对底盘菌进行诱变，产生的微生物文库用甲硫氨酸结构类似物(如乙硫氨酸)平板筛选，在用hplc(高效液相色谱)复筛确认，也没有取得令人满意的效果。虽然物理化学诱变可以在一定程度上扩大突变的范围和类型，但是通过结构类似物的初筛方式强度有限，给后续hplc复筛造成不小压力，无法有效开展高产菌株的选育和改造研究。如果能够开发出一种特异性响应l-甲硫氨酸浓度，且筛选强度可调的生物传感器，将有助于提高突变文库的筛选通量，对l-甲硫氨酸高产菌株的定向选育有积极的作用。
4.nurije mustafi等报道了一种基于转录调控因子lrp的可以响应谷氨酸棒杆菌胞内l-甲硫氨酸浓度的生物传感器(the development and application of a single-cell biosensor for the detection of l-methionine and branched-chain amino acids.metab.eng.2012,14(4):449-57)。当胞内有较高浓度的l-甲硫氨酸、l-亮氨酸、l-缬氨酸和l-异亮氨酸时，谷氨酸棒杆菌中lrp蛋白可以激活编码分支氨基酸运输蛋白brnfe的表达。将gfp基因克隆到brnfe基因的lrp响应dna序列的下游并与lrp表达盒串联构建一个生物传感器，可以灵敏地响应谷氨酸棒杆菌内部的l-甲硫氨酸浓度，将该生物传感器与facs(流式细胞荧光分选技术)结合有效地从谷氨酸棒杆菌随机突变文库中筛选出l-甲硫氨酸高产菌株。但是这种生物传感器需要facs辅助，胞内l-甲硫氨酸浓度存在上限，而且biosensor响应特异性较差，还能够响应亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。
5.mohd mohsin等报道了一种基于fret(荧光共振能量转移)原理可以响应胞内l-甲硫氨酸浓度的biosensor(genetically-encoded nanosensor for quantitative monitoring of methionine in bacterial and yeast cells.biosens.bioelectron.20
14.59:358-364)。将cfp蛋白和yfp蛋白分别融合到metn(甲硫氨酸结合蛋白)的n端和c端，当l-甲硫氨酸与metn结合时会发生构象变化，为两端的cfp和yfp发生fret创造条件，可以用535/485nm荧光比值变化表示胞内l-甲硫氨酸浓度变化。对metn进行进一步改造，对l-甲硫氨酸的kd值可以从0.2mm提高到2.4mm。这种基于fret的biosensor特异性较好，而且在酵母中同样有效，但检测过程相对复杂，成本也相对较高。
6.应用合成生物学理念，开发一种可以特异性响应胞内l-甲硫氨酸浓度并引起高产菌株和低产菌株出现显著的生长差异的新型biosensor，将有助于显著降低初筛的筛选成本，减小复筛的筛选压力，有效地提高l-甲硫氨酸高产菌株的筛选通量，对实现l-甲硫氨酸的绿色发酵生产具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种可以响应活细胞内l-甲硫氨酸浓度的生物传感器，该生物传感器可以响应活细胞内l-甲硫氨酸的浓度并使高产菌株和低产菌株表现显著的生长差异，实现l-甲硫氨酸高产菌株的高通量筛选。
8.为了实现以上目的，本发明首先提供一种用于检测l-甲硫氨酸的生物传感器的蛋白元件，其特征在于：是大肠杆菌来源的截短型甲硫氨酰-trna合成酶或其突变体，其中所述大肠杆菌来源的截短型甲硫氨酰-trna合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示(transition state stabilization by a phylogenetically conserved tyrosine residue in methionyl-trna synthetase.j.bio.chem.1991.266:17136-17141)；所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第14位的l，第261位的y和第302位的h三个位点中至少一个氨基酸残基进行置换得到的蛋白质。
9.优选地，所述突变体中，是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w；所述第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t、l、p、e、q、w、n或f；所述第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n。
10.更优选地，所述突变体中，是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第14位的l置换为第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w，且第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t、l、p、e、q、w、n或f的任意组合的双突变。
11.进一步优选地，所述突变体，是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第14位的l置换为第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w，且第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n的任意组合的双突变体。
12.另一优选地，所述突变体，是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t或f，和第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n的任意组合的双突变体。
13.进一步优选地，所述突变体，是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第14位的l置换为第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w，和第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t、l、p、e、q、w、n或f，和第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n的任意组合的三突变体。
14.本发明因而提供编码所述生物传感器的蛋白元件的核酸分子，具体地所述核酸分子是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；或者是rna，如mrna或hnrna。
15.本发明进一步提供含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
16.本发明还提供所述生物传感器的蛋白元件、所述核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的在下述方面中的应用：1)制备用于检测l-甲硫氨酸的生物传感器；2)检测菌株生产l-甲硫氨酸的能力；3)制备生产l-甲硫氨酸或l-甲硫氨酸下游产物的生物材料；4)生产l-甲硫氨酸。
17.本发明进一步提供一种用于检测l-甲硫氨酸的生物传感器，包括表达盒，其特征在于，所述的表达盒从上游至下游依次包括野生型启动子、效应基因和终止子；所述效应基因是编码所述蛋白元件的核酸分子，任选地还包括编码标记蛋白的基因。
18.优选地，所述生物传感器为含有所述表达盒的质粒。所述生物传感器可为含有所述表达盒的质粒。在本发明的一个实施例中，所述的生物传感器具体可为传感器质粒pb2。在本发明的实施例中，所述的生物传感器具体可为传感器质粒pb2-传感器pb122中的任一种。
19.本发明更进一步提供所述的生物传感器的下述方面的应用：检测菌株生产l-甲硫氨酸的能力；检测菌株的活细胞内的l-甲硫氨酸浓度；制备生产l-甲硫氨酸或l-甲硫氨酸下游产物的菌株；生产l-甲硫氨酸；所述生物材料的出发微生物大肠杆菌，更具体是菌株mg1655。
20.本发明的有益效果：本发明将大肠杆菌来源的截短型甲硫胺酰-trna合成酶作为效应蛋白，并进而通过定向进化改变其对l-甲硫氨酸的亲和力，构建了一系列能够感应胞内l-甲硫氨酸浓度的生物传感器。生物传感器进入基因组甲硫胺酰-trna合成酶基因敲除的宿主菌后，当细胞内的l-甲硫氨酸浓度较低时，细胞内无法正常合成蛋白质，细胞生长速度降低；当细胞内的l-甲硫氨酸较高时，细胞内蛋白质合成正常，细胞生长速度恢复正常。因此可以通过细胞在琼脂平板上的生长速度快慢反应出细胞内l-甲硫氨酸浓度高低。本发明构建的一系列传感器可以特异性响应胞内l-甲硫氨酸浓度并引起高产菌株和低产菌株出现显著的生长差异，将有助于显著降低初筛的筛选成本，减小复筛的筛选压力，有效地提高l-甲硫氨酸高产菌株和有效靶点的筛选通量，对实现l-甲硫氨酸的绿色发酵生产具有重要意义。
附图说明
21.图1为本发明中甲硫胺酰-trna合成酶与l-甲硫氨酸相互作用模式；
22.图2为本发明中用于评估胞内l-甲硫氨酸的生物传感器原理示意图；
23.图3为实施例3中含生物传感器pb1菌株的od
600
对l-甲硫氨酸浓度的响应；
24.图4为实施例4中含生物传感器pb2菌株的od
600
对l-甲硫氨酸浓度的响应；
25.图5为实施例5中含生物传感器pb2菌株的od
600
对不同浓度l-甲硫氨酸添加的响应；
26.图6为实施例6中含生物传感器菌pb2株的od
600
对不同氨基酸的响应特异性。
具体实施方式
27.下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
28.除特殊说明的外，下述实施例及试验例中使用的试剂、材料和仪器均可从商业途径获得；未特殊说明的操作均为本领域的常规操作。
29.实施例1.响应l-甲硫氨酸生物传感器构建
30.1)构建含有大肠杆菌来源的截短型甲硫胺酰-trna合成酶基因的生物传感器出发质粒
31.a.pcr扩增截短型甲硫胺酰-trna合成酶基因及其野生型启动子
32.用购买自promega公司的基因组提取试剂盒提取escherichia coli mg1655的基因组dna，以metgt-f和metgt-r为引物，pcr扩增基因组dna中含有野生型启动子的截短型甲硫胺酰-trna合成酶基因片段。引物序列如下所示：
33.metgt-f:tttctactgagctgattttctgcgcccaac；
34.metgt-r:gtccatgttattctttagaggcttccaccag。
35.b.pcr扩增载体骨架
36.以cdfd-zh-f和cdfd-zh-r为引物，以核苷酸序列如seq id no.3所示的cdfd-lacz-trc-yjeh质粒为模版，扩增载体骨架。引物如下所示：
37.cdfd-zh-f:ctctaaagaataacatggactcgtctactag
38.cdfd-zh-r:gaaaatcagctcagtagaaaagatcaaagg
39.上述两个片段经琼脂糖凝胶电泳检测后使用axygen gel extraction kit进行胶回收。
40.将最终得到的两个基因片段采用clonexpress ii one step cloning kit进行连接，最终形成pb1(核苷酸序列如seq id no.4所示)。
41.从-80℃超低温冰箱中取出大肠杆菌trans5α感受态细胞，至于冰浴中解冻。将pb1加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min，取100μl涂布于含有50mg/l硫酸链霉素的平板上，37℃倒置培养过夜。挑取10个菌落，通过菌落pcr筛选阳性菌落。挑取2个阳性菌落过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组质粒。
42.2)构建含有大肠杆菌来源的截短型甲硫胺酰-trna合成酶突变体基因的生物传感器质粒文库
43.以pb1质粒为模版和表1所列的引物，通过定点突变构建截短型甲硫氨酰-trna合成酶突变体文库。
44.表1.定点突变引物
45.46.47.[0048][0049]
pcr完成后取9.75μl pcr产物，加0.25μl dpni消化30min。
[0050]
从-80℃超低温冰箱中取出大肠杆菌trans5α感受态细胞，至于冰浴中解冻。将dpni消化后的pcr产物10μl加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min，取100μl涂布于含有50mg/l硫酸链霉素的平板，37℃倒置培养过夜。挑取2个菌落过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组质粒，构建获得如表2所示一系列生物传感器质粒。
[0051]
表2.生物传感器质粒
[0052]
[0053][0054]
实施例2.escherichia coli mg1655基因组甲硫氨酰-trna合成酶基因(metg)敲除
[0055]
a.回补质粒构建
[0056]
metg属于必需基因，无法直接敲除，因此需要先构建一个回补质粒，保证基因组metg敲除过程中细胞能够存活。
[0057]
以escherichia coli mg1655基因组dna为模版，p
metg-f和p
metg-r为引物，pcr扩增基因组dna中含有野生型启动子的截短型甲硫胺酰-trna合成酶基因片段，引物序列如下：
[0058]
p
metg-f:taggaacttcgctgattttctgcgcccaac
[0059]
p
metg-r:gcggcggttattctttagaggcttccaccag
[0060]
以ptib1-f和ptib1-r为引物，实验室保藏的ptib1质粒(核苷酸序列如seq id no.5所示)为模版，扩增载体骨架。引物如下所示：
[0061]
ptib1-f:ctctaaagaataaccgccgcagtctcacgc
[0062]
ptib1-r:gaaaatcagcgaagttcctattctctagaaag
[0063]
上述两个片段经琼脂糖凝胶电泳检测后使用axygen gel extraction kit进行胶回收。
[0064]
将最终得到的两个基因片段采用clonexpress ii one step cloning kit进行连接，最终形成pr1(核苷酸序列如seq id no.6所示)。
[0065]
从-80℃超低温冰箱中取出大肠杆菌trans5α感受态细胞，至于冰浴中解冻。将pr1加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min，取100μl涂布于含有50mg/l氯霉素的平板上，37℃倒置培养过夜。挑取10个菌落，通过菌落pcr筛选阳性菌落。挑取2个阳性菌落过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组质粒。
[0066]
b.基因组metg基因敲除
[0067]
第一步：以ptargetf(addgene#62226)质粒为模版，n20-f和n20-r扩增
[0068]
sgrna片段，构建ptarget-metg，引物序列如下：
[0069]
n20-f：tcaagtcgcgaagaaaattcgttttagagctagaaatagc
[0070]
n20-r：gaattttcttcgcgacttgaactagtattatacctaggac
[0071]
取pcr产物10μl，加入0.25μl dpni酶消化30min。
[0072]
从-80℃超低温冰箱中取出大肠杆菌trans5α感受态细胞，至于冰浴中解冻。将ptarget-metg加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min，取100μl涂布于含有50mg/l壮观霉素的平板上，37℃倒置培养过夜。挑取2个菌落过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组质粒。
[0073]
第二步：以escherichia coli mg1655基因组dna为模版，分别以udon-f和udon-r扩增上游同源臂片段，ddon-f和ddon-r扩增下游同源臂片段；以第一步构建获得的ptarget-metg质粒为模版，ptg-vf和ptg-vr扩增质粒骨架，构建ptarget-metg-donor。引物序列如下：
[0074]
udon-f：ctttttttgaggacgatttacccacgccgc
[0075]
udon-r：agggggattacatagtaggcattacttctta
[0076]
ddon-f：gcctactatgtaatcccccttcaaggcgctg
[0077]
ddon-r：gcaggtcgacaatatctttcgccagccacg
[0078]
ptg-vf：gaaagatattgtcgacctgcagaagcttag
[0079]
ptg-vr：taaatcgtcctcaaaaaaagcaccgactcg
[0080]
第三步：以escherichia coli mg1655基因组dna为模版，ptgd-metg-f和ptgd-metg-r为引物，扩增内部不含ptarget-metg-donor中相应pam位点的metg基因片段；以ptarget-metg-donor为模版，ptgd-f和ptgd-f为模版，扩增载体骨架。构建ptarget-metg-donor-metg*，引物序列如下所示：
[0081]
ptgd-metg-f:aatgcctactatgactcaagtcgcgaagaaaattctagtgacgtgcgcac
[0082]
ptgd-metg-r:gtttatgctagagcggcatcttatttcacc
[0083]
ptgd-f:gatgccgctctcgcataaacctgattgatt
[0084]
ptgd-r:cttgagtcatagtaggcattacttcttaat
[0085]
上述各个片段经琼脂糖凝胶电泳检测后使用axygen gel extraction kit进行胶回收。
[0086]
将最终得到的基因片段采用clonexpress ii one step cloning kit进行连接，
最终形成ptarget-metg-donor-metg*(核苷酸序列如seq id no.7所示)。
[0087]
从-80℃超低温冰箱中取出大肠杆菌trans5α感受态细胞，至于冰浴中解冻。将ptarget-metg-donor-metg*加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min，取100μl涂布于含有50mg/l壮观霉素的平板上，37℃倒置培养过夜。挑取10个菌落，通过菌落pcr筛选阳性菌落。挑取2个菌落过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组质粒。
[0088]
第四步，参考文献(multigene editing in the escherichia coli genome using the crispr-cas9 system.appl environ microbiol.2015)进行基因组metg敲除。所不同的是：在pcas和ptarget-metg-donor-metg*协作完成基因组metg敲除获得e.coli mg1655 δmetg/(pcas+ptarget-metg-donor-metg*)后，将回补质粒pr1转化到该菌株构建e.coli mg1655δmetg/(pcas+ptarget-metg-donor-metg*+pr1)，然后进入正常质粒消去步骤，依次消去ptarget-metg-donor-metg*和pcas，最终构建获得e.coli mg1655 δmetg/pr1。
[0089]
实施例3.传感器质粒pb1功能测试
[0090]
从-80℃超低温冰箱中取出e.colimg1655δmetg/pr1感受态，置于冰浴中解冻。将传感器质粒pb1加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min。将所有复苏产物转接到含有50mg/l的硫酸链霉素的lb试管(额外补加l-甲硫氨酸至终浓度0.8g/l)，42℃，220rpm培养过夜。将过夜培养物进行105倍稀释，涂布含有50mg/l硫酸链霉素的lb琼脂糖平板分离单菌落。检验单菌落的氯霉素抗性，挑取2个氯霉素抗性消去的单克隆37℃过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组菌e.coli mg1655 δmetg/pb1。
[0091]
将e.coli mg1655 δmetg/pb1种子液分别接种到m9培养基和含有0.8g/l l-甲硫氨酸的m9培养基中，37℃，220rpm振荡培养，每隔3h测定一次od
600
。检测结果见图3。如图所示，外源添加l-甲硫氨酸并不会影响重组菌e.coli mg1655 δmetg/pb1的生长，对照组(不加l-甲硫氨酸)和实验组(添加0.8g/l l-甲硫氨酸)之间的生长速度没有显著差异。以上结果表明传感器质粒pb1(含截短的野生型甲硫胺酰-trna合成酶基因)不能响应l-甲硫氨酸浓度，不会使宿主菌e.coli mg1655 δmetg的生长速度与胞内l-甲硫氨酸浓度表现出关联性。
[0092]
实施例4.传感器质粒pb2功能测试
[0093]
从-80℃超低温冰箱中取出e.coli mg1655 δmetg/pr1感受态，置于冰浴中解冻。将传感器质粒pb2(其中甲硫胺酰-trna合成酶的第14位l突变为k)加入感受态细胞中，冰浴静置30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入700μl无抗lb培养基，37℃，220rpm振荡复苏60min。将所有复苏产物转接到含有50mg/l的硫酸链霉素的lb试管(额外补加l-甲硫氨酸至终浓度0.8g/l)，42℃，220rpm培养过夜。将过夜培养物进行105倍稀释，涂布含有50mg/l硫酸链霉素的lb琼脂糖平板分离单菌落。检验单菌落的氯霉素抗性，挑取2个氯霉素抗性消去的单克隆37℃过夜培养，提取质粒，并送公司测序。通过序列比对，最终获得序列正确的重组菌e.coli mg1655 δmetg/pb2。
[0094]
将e.coli mg1655 δmetg/pb2种子液分别接种到m9培养基和含有0.8g/l l-甲硫氨酸的m9培养基中，37℃，220rpm振荡培养，每隔3h测定一次od
600
。检测结果见图4。如图所
示，当不外源添加l-甲硫氨酸时，e.coli mg1655 δmetg/pb2的生长几乎停滞；而外源添加l-甲硫氨酸至0.8g/l的l-甲硫氨酸时，e.coli mg1655 δmetg/pb2的生长完全恢复正常。以上结果表明，传感器质粒pb2(含截短型甲硫胺酰-trna合成酶突变体l14k)可以感应l-甲硫氨酸的浓度，并使宿主菌e.coli mg1655 δmetg的生长速度与胞内l-甲硫氨酸浓度表现强关联性。因此传感器pb2可以用于筛选高产l-甲硫氨酸的e.coli mg1655 δmetg突变菌株。
[0095]
实施例5.传感器质粒pb2对l-甲硫氨酸的浓度响应范围测试
[0096]
将e.coli mg1655 δmetg/pb2种子液分别接种到含有0.001g/l、0.01g/l和0.1g/l l-甲硫氨酸的m9培养基中，37℃，220rpm振荡培养，每隔3h测定一次od
600
。检测结果见图5。如图所示，外源添加不同浓度的l-甲硫氨酸时，对e.coli mg1655 δmetg/pb2的生长受不同程度的影响。当外源添加0.001g/l l-甲硫氨酸时，几乎不能使e.coli mg1655 δmetg/pb2停滞的生长得到恢复；添加0.01g/l l-甲硫氨酸时，e.coli mg1655δmetg/pb2生长稍有恢复，但培养12h后的od
600
值仍显著低于e.coli mg1655 δmetg/pb1(图3)；添加0.1g/l l-甲硫氨酸时，e.coli mg1655 δmetg/pb2生长基本恢复。因此，e.coli mg1655 δmetg/pb2对外源添加l-甲硫氨酸的响应浓度范围为0.01-0.1g/l。
[0097]
实施例6.传感器质粒pb2对l-甲硫氨酸的响应特异性测试
[0098]
甲硫氨酰-trna合酶对氨基酸的选择性会影响细胞蛋白质组的构成，因此筛选得到的具有功能的生物传感器pbn(pbn相应于前文中的pb2～pb122)对氨基酸超高忠实性应该不会改变。为验证以上设想，将e.coli mg1655 δmetg/pb2种子液分别接种到分别含有0.5g/l l-氨基酸的m9培养基中，37℃，220rpm振荡培养，培养12h后测定od
600
。
[0099]
检测结果见图6。如图所示，外源添加0.5g/l l-甲硫氨酸可以使e.coli mg1655 δmetg/pb2恢复生长；l-甘氨酸和l-精氨酸外源添加可以在一定程度上促进e.coli mg1655 δmetg/pb2生长，但od
600
显著低于l-甲硫氨酸添加组；其余16种氨基酸添加与空白对照(control)无显著差异，不能促进e.coli mg1655δmetg/pb2恢复生长。以上结果表明，e.coli mg1655 δmetg/pb2的生长仅对l-甲硫氨酸添加产生特异性响应。
[0100]
实施例7.其他有效传感器质粒的生长偶联效应表征
[0101]
按照实施例4和5所述的方法构建了一系列菌株e.coli mg1655 δmetg/pbn(pbn相应于前文中的pb2～pb122)，并测试其生长与外源l-甲硫氨酸添加浓度之间的关联。通过外源添加不同浓度的l-甲硫氨酸(0，0.00001，0.0001，0.001，0.01和0.1g/l)，表征了一系列有效的生物传感器质粒的生长偶联效应。如表3所示，“l-甲硫氨酸响应浓度”表示生长完全恢复时的l-甲硫氨酸添加浓度，所有生物传感器质粒都能不同程度地响应l-甲硫氨酸，最低为0.0001g/l，最高为0.1g/l。以上表明构建获得的一系列传感器质粒pb2-pb122都能感应胞内l-甲硫氨酸的浓度，且感应强度不同，后续可以通过逐级调节筛选强度逐步筛选出l-甲硫氨酸高产菌株。
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表3.不同传感器质粒对l-甲硫氨酸的响应浓度
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由此可见，采用本发明构建的l-甲硫氨酸生物传感器可以高通量筛选菌株的l-甲硫氨酸生产能力；还可以据此对目的菌株进行改造，获得高产“l-甲硫氨酸下游产物(如s-腺苷-l-甲硫氨酸)”的菌株。本发明在菌株改造和代谢工程中有重要的应用价值。

技术特征：
1.一种用于检测l-甲硫氨酸的生物传感器的蛋白元件，其特征在于：是大肠杆菌来源的截短型甲硫氨酰-trna合成酶或其突变体，其中所述大肠杆菌来源的截短型甲硫氨酰-trna合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的中第14位的l，第261位的y和第302位的h三个位点中至少一个氨基酸残基进行置换得到的蛋白质。2.如权利要求1所述的生物传感器的蛋白元件，其特征在于：所述突变体中，第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w；所述第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t、l、p、e、q、w、n或f；所述第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n；或所述突变体中，第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w，且第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t、l、p、e、q、w、n或f的任意组合的双突变；或所述蛋白质为第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w，且第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n的任意组合的双突变体。3.如权利要求2所述的生物传感器的蛋白元件，其特征在于：所述蛋白质为第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t或f，和第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n的任意组合的双突变体。4.如权利要求2所述的生物传感器的蛋白元件，其特征在于：所述蛋白质为第14位的l置换为k、g、v、d、q、p、y、c、f、a或w，和第261位的y置换为v、r、c、g、s、i、k、m、h、a、t、l、p、e、q、w、n或f，和第302位的h置换为m、i、t、y、k、w、s、l、g、q、a、c、f、v、r、p、d、e或n的任意组合的三突变体。5.编码权利要求1-4任一所述生物传感器的蛋白元件的核酸分子，具体地所述核酸分子是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；或者是rna，如mrna或hnrna。6.含有权利要求7所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。7.权利要求1至4任一所述生物传感器的蛋白元件、权利要求7所述核酸分子或含有权利要求8所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的在下述方面中的应用：1)制备用于检测l-甲硫氨酸的生物传感器；2)检测菌株生产l-甲硫氨酸的能力；3)制备生产l-甲硫氨酸或l-甲硫氨酸下游产物的生物材料；4)生产l-甲硫氨酸。8.一种用于检测l-甲硫氨酸的生物传感器，包括表达盒，其特征在于，所述的表达盒从上游至下游依次包括野生型启动子、效应基因和终止子；所述效应基因是编码权利要求5所述的核酸分子，任选地还包括编码标记蛋白的基因。9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于：所述生物传感器为含有权利要求1所述的蛋白元件的表达盒的质粒。10.权利要求8至9任一项所述的生物传感器的下述方面的应用：检测菌株生产l-甲硫氨酸的能力；检测菌株的活细胞内的l-甲硫氨酸浓度；制备生产l-甲硫氨酸或l-甲硫氨酸下游产物的菌株；生产l-甲硫氨酸；所述生物材料的出发微生物大肠杆菌，更具体是菌株mg1655。

技术总结
本发明通过基因重组和蛋白质定向进化构建了一系列响应胞内L-甲硫氨酸的生物传感器，该传感器的核心元件是大肠杆菌来源的甲硫氨酰-tRNA合成酶基因及其野生型启动子，通过蛋白质定向进化重塑甲硫氨酸-tRNA合成酶中L-甲硫氨酸结合口袋，降低其对L-甲硫氨酸的亲和力。当宿主细胞中仅含这种突变型甲硫氨酰-tRNA合成酶时，只有在胞内相应足够高浓度的L-甲硫氨酸才能保证胞内蛋白质的合成以及细胞的正常生长。因此，构建获得的一系列生物传感器可以响应活细胞内L-甲硫氨酸不同浓度，通过生长速率差异可以实现L-甲硫氨酸高产菌株的高通量筛选，因而在构建L-甲硫氨酸高产菌株中具有重要应用价值。具有重要应用价值。


技术研发人员：张燕飞 黄建峰 蔡世杰 尤晓颜 赵国屏
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：2022.01.07
技术公布日：2023/7/22