表达载体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及表达载体以及利用其筛选细胞池的方法。


背景技术：

2.中国仓鼠卵巢(cho)细胞是制造复杂生物分子的最常用表达宿主。在cho细胞中表达蛋白质最常用的两种方法是瞬时基因表达和稳定基因表达。瞬时基因表达是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。瞬时基因表达是快速产生少量重组蛋白的首选方法，通常只需要1-3周。但是，由于需要大量的dna和宿主细胞，在需要生成克级蛋白质的情况下，瞬时基因表达并不适用。因此，稳定基因表达通常被用来产生克级重组蛋白。稳定基因表达是指转染的目的基因整合到染色体dna中从而表达目的蛋白。然而，稳定基因表达既耗时又费力。通常需要3-9个月才能产生cho细胞系。因此，亟需快速、稳定、高产目的蛋白的细胞系。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种表达载体，通过该表达载体可以快速筛选得到细胞池，并且可通过进一步筛选得到cho克隆，从而产生稳定的cho细胞系。本发明中还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量，快速产生的cho细胞系不仅稳定还高产。
4.第一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括筛选标记表达单元，至少一个目的基因表达单元，以及piggybac转座子的反向末端重复序列(itrs)。
5.所述筛选标记表达单元包含筛选标记的编码序列，以及与所述筛选标记的编码序列可操作连接的第一调控序列，例如，启动子的编码序列和终止子的编码序列。
6.在一些实施方案中，所述筛选标记包括但不限于嘌呤霉素(puromycin,puro)、新霉素(neomycin,neo)，潮霉素b(hygromycin b,hygro b)和杀稻瘟菌素(blasticidin,bsd)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,gs)和二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,dhfr)。优选地，所述筛选标记为人gs。
7.在一些实施方案中，所述筛选标记表达单元的启动子可以为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(thymidine kinasegene of herpes simplex virus,hsv-tk)启动子或猴空泡病毒40(simian virus40,sv40)启动子。
8.在一些实施方案中，所述筛选标记表达单元的终止子可以为聚腺苷化信号(polya)，例如sv40 polya，牛生长激素(bovine growth hormone，bgh)polya，hsv-tk polya或兔β-珠蛋白(rabbit beta-globin，rbg)polya，优选为sv40 polya。
9.优选地，所述筛选标记表达单元包含hsv-tk启动子的编码序列和sv40 polya的编码序列。
10.优选地，所述筛选标记表达单元包含hsv-tk启动子的编码序列，人gs筛选标记的编码序列和sv40 polya的编码序列。
11.所述目的基因表达单元包含目的基因序列，以及与目的基因序列可操作连接的第
二调控序列，例如，目的基因表达调控元件的编码序列和终止子的编码序列。
12.在一些实施方案中，所述目的基因表达调控元件的编码序列调控序列具有选自seq id no.1-6所示的序列。
13.在一些实施方案中，所述目的基因表达单元的终止子可以为polya，例如sv40 polya，bgh polya，tk polya，rbg polya，优选为bgh polya。
14.在一些实施方案中，所述目的基因为一个或者多个，例如2个，3个或者4个，相应地，所述表达载体具有2个，3个或者4个目的基因表达单元。
15.在一些实施方案中，所述目的基因编码anti-cd20单克隆抗体(rituximab)或anti-her2单克隆抗体(trastuzumab)的轻链和/或重链。相应地，所述表达载体具有1个或者2个目的基因表达单元。
16.在一些实施方案中，所述表达载体可以快速筛选获得cho细胞池，进一步筛选得到cho克隆产生稳定cho细胞系，还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量，快速产生的cho细胞系不仅稳定还高产。
17.第二方面，本发明提供了含有第一方面的表达载体的表达系统。
18.在一些实施方案中，所述表达系统还包含辅助质粒，所述辅助质粒编码piggybac转座酶。
19.第三方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞转染有第一方面的表达载体。
20.在一些实施方案中，所述宿主细胞转染有第二方面的表达系统。
21.优选地，所述宿主细胞的基因组中稳定整合有第一方面的表达载体。
22.在一些实施方案中，所述宿主细胞不包含编码piggybac转座酶的辅助质粒。
23.在一些实施方案中，所述宿主细胞为cho细胞，例如为cho-k1细胞或choexpresstm细胞。
24.在一些实施方案中，所述宿主细胞为稳定的cho细胞系。
25.在一些实施方案中，所述宿主细胞具有提高的目的蛋白表达量。
26.第四方面，本发明提供了利用第一方面的表达载体或第二方面的表达系统筛选细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
27.(a)用第一方面的表达载体或第二方面的表达系统转染宿主细胞；以及
28.(b)利用针对所述表达载体中的筛选标记的筛选试剂对步骤(a)获得的宿主细胞进行筛选的步骤。
29.在一些实施方案中，所述宿主细胞为cho细胞，例如为cho-k1细胞或choexpresstm细胞。
30.在一些实施方案中，所述筛选标记为嘌呤霉素，并且使用10μg/ml的嘌呤霉素对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含嘌呤霉素抗性筛选标记的所述表达载体。
31.在一些实施方案中，所述筛选标记为嘌呤霉素，并且使用浓度增高的嘌呤霉素(10μg/ml、50μg/ml、250μg/ml)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含嘌呤霉素抗性筛选标记的所述表达载体。
32.在一些实施方案中，所述筛选标记为gs，并且使用25μm的蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine,msx)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含gs筛选标记的所述表达载体。
33.在一些实施方案中，所述筛选标记为gs，并且使用浓度增高的msx(25μm、50μm)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含gs筛选标记的所述表达载体。
34.在一些实施方案中，所述筛选标记为gs，并且使用浓度增高的msx(25μm、50μm、100μm)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含gs筛选标记的所述表达载体。
35.优选地，所述筛选标记为人gs。
36.在一些实施方案中，所述筛选标记为dhfr，并且使用250nm的氨甲喋呤(amethopterin,mtx)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含dhfr筛选标记的所述表达载体。
37.在一些实施方案中，所述筛选标记为dhfr，并且使用浓度增高的氨甲喋呤(250nm、500nm)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含dhfr筛选标记的所述表达载体。
38.优选地，所述筛选试剂为嘌呤霉素，蛋氨酸亚氨基代砜或氨甲喋呤。
39.在一些实施方案中，用含有嘌呤霉素，蛋氨酸亚氨基代砜或氨甲喋呤的cho细胞培养基对所述宿主细胞进行加压筛选。在一些实施方案中，所述培养基为balancd cho growth a培养基。
40.在一些实施方案中，待活率恢复至90％以上后撤去筛选压力。
41.本发明的筛选方法筛选得到高产稳定的cho克隆，进而产生稳定的cho细胞系。
42.第五方面，本发明提供了由第四方面的筛选方法获得的细胞。
43.第六方面，本发明提供了第一方面的表达载体，第二方面的表达系统，第三方面的宿主细胞，或第四方面的筛选方法，或第五方面的细胞在生产表达量提高的目的蛋白中的应用。
44.本发明中提供的表达载体，通过该表达载体可以快速筛选得到细胞池，并且可通过进一步筛选得到cho克隆产生稳定cho细胞系，大大缩短了产生稳定cho细胞系的时间，同时还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量，快速产生的cho细胞系不仅稳定还高产。
附图说明：
45.图1显示了包含两个目的基因表达单元的表达载体结构图。
46.图2显示了包含一个目的基因表达单元的表达载体结构图。
47.图3显示了针对使用嘌呤霉素抗性筛选标记的细胞池的筛选策略。
48.图4显示了针对使用gs筛选标记(包括大鼠gs以及人gs)的细胞池的筛选策略。
49.图5显示了针对使用dhfr筛选标记的细胞池的筛选策略。
50.图6显示了用于表达anti-cd20 mab(rituximab)的表达载体结构。
51.图7显示了cho-k1细胞池的细胞活率(via)。
52.图8显示了choexpress
tm
细胞池的细胞活率(via)。
53.图9显示了细胞活率恢复较好的cho-k1细胞池的活细胞密度(vcd)和细胞活率(via)。
54.图10显示了细胞活率恢复较好的choexpress
tm
细胞池的活细胞密度(vcd)和细胞活率(via)。
55.图11显示了37℃条件下细胞池的生长曲线，其中，“kp10”指k1-pr10，“kp250”指
k1-pr250，“ep10”指exp-pr10，“ep250”指exp-pr250，“kh25”指k1-hg25，“kh50”指k1-hg50，“kh100”指k1-hg100，“eh25”指exp-hg25，“eh50”指exp-hg50，“eh100”指exp-hg100。
56.图12显示了第六天降温至33℃条件下细胞池的生长曲线，其中，“kp10”指k1-pr10，“kp250”指k1-pr250，“ep10”指exp-pr10，“ep250”指exp-pr250，“kh25”指k1-hg25，“kh50”指k1-hg50，“kh100”指k1-hg100，“eh25”指exp-hg25，“eh50”指exp-hg50，“eh100”指exp-hg100。
57.图13显示了protein a hplc检测表达量结果，其中，“kp10”指k1-pr10，“kp250”指k1-pr250，“ep10”指exp-pr10，“ep250”指exp-pr250，“kh25”指k1-hg25，“kh50”指k1-hg50，“kh100”指k1-hg100，“eh25”指exp-hg25，“eh50”指exp-hg50，“eh100”指exp-hg100。
58.图14显示了实施例3中细胞的生长曲线。
59.图15显示了实施例3中表达量检测结果。
60.图16显示了实施例4中的表达量检测结果。
具体实施方式
61.在一些实施方案中，本发明可以构建包含两个目的基因表达单元的表达载体(参见图1)，或者构建包含一个目的基因表达单元的表达载体(参见图2)。
62.本发明采用的piggybac系统包含两个载体，一个载体被称为辅助质粒，负责编码转座酶；另一个载体被称为转座子质粒，包含两个末端重复序列(itrs)以及两者之间的被转座区域，启动子、表达盒和目的基因一起被克隆到这个转座区域。当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时，辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个itr元件，然后将被转座区和两个itr元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含ttaa序列的宿主染色体位点，并在转座子两侧出现ttaa重复序列。
63.piggybac属于ii类转座子，通过“剪切—粘贴”的机制移动，从一个地方转座到另一个地方，而不留下序列本身。由于辅助质粒是通过瞬时转染进入宿主细胞的，故会逐渐丢失。随着辅助质粒的丢失，转座子在宿主基因组中变成了永久整合。当这些宿主细胞再次被辅助质粒转染，整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。
64.在利用本发明的表达载体或本发明的表达系统筛选细胞池的方法中，
65.使用嘌呤霉素抗性筛选标记的细胞池的筛选策略如下(参见图3)：
66.puro策略1：全程使用10μg/ml的嘌呤霉素进行筛选；
67.puro策略2：使用浓度增高的嘌呤霉素(10μg/ml、50μg/ml、250μg/ml)进行筛选；
68.使用gs筛选标记(包括大鼠gs以及人gs)的细胞池的筛选策略如下(参见图4)：
69.gs策略1：全程使用25μm的msx进行筛选；
70.gs策略2：使用浓度变化的msx(25μm、50μm)进行筛选；
71.gs策略3：使用浓度变化的msx(25μm、50μm、100μm)进行筛选；
72.使用dhfr筛选标记的细胞池的筛选策略如下(参见图5)：
73.dhfr策略1：全程使用250nm的氨甲喋呤(amethopterin,mtx)进行筛选；
74.dhfr策略2：使用浓度变化的mtx(250nm、500nm)进行筛选。
75.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发
明的任何限制。
76.实施例1：用于表达anti-cd20 mab(rituximab)的表达载体构建以及细胞株的筛选
77.cho细胞系的构建与筛选
78.参见图6，显示了构建用于表达anti-cd20 mab(rituximab)的表达载体。
79.其中目的基因表达调控元件的编码序列如seq id no.1所示，piggybac转座子ltd序列如seq id no.7所示，其中piggybac转座子rtd序列如seq id no.8所示，bgh polya序列如seq id no.9所示，hsv-tk启动子序列如seq id no.10所示，sv40 polya序列如seq id no.11所示。
80.转染体系：
81.pei(25kd)37.5μg；重组抗cd20单克隆抗体质粒11.25μg(参见图6构建的用于表达anti-cd20 mab(rituximab)的表达载体)；转座酶质粒1.25μg；含有cho细胞的hycell transfx-c培养基(ge,sh30934.04)1.5ml；cho细胞在培养基中的密度15
×
106cell/ml。
82.转染方法：
83.转染时，将pei、重组抗cd20单克隆抗体质粒、转座酶质粒及含有cho细胞的hycell transfx-c培养基混匀后放入37℃摇床孵育，转染1小时后加入3.5ml balancd cho growth a。
84.筛选方法：
85.转染两天后，用含有筛选试剂的balancd cho growth a medium进行加压筛选，每三天传代一次，传代细胞密度为0.3-0.5
×
106cell/ml，待活率恢复至90％以上后撤去筛选压力。
86.本实施例中使用cho-k1(购于atcc)和choexpress
tm
(购于excellgene)两种宿主细胞，以及嘌呤霉素、大鼠gs、人gs、小鼠dhfr四种筛选标记构建了八种表达抗cd20单克隆抗体的细胞，并针对这些细胞，采用了不同的细胞池筛选策略，具体如下表1所示。
87.表1：
88.组别筛选标记细胞系筛选策略k1-pr10嘌呤霉素抗性筛选标记cho-k1puro策略1k1-pr250嘌呤霉素抗性筛选标记cho-k1puro策略2k1-rg25大鼠gscho-k1gs策略1k1-rg50大鼠gscho-k1gs策略2k1-rg100大鼠gscho-k1gs策略3k1-hg25人gscho-k1gs策略1k1-hg50人gscho-k1gs策略2k1-hg100人gscho-k1gs策略3k1-md250小鼠dhfrcho-k1dhfr策略1k1-md500小鼠dhfrcho-k1dhfr策略2exp-pr10嘌呤霉素抗性筛选标记choexpress
tm
puro策略1exp-pr250嘌呤霉素抗性筛选标记choexpress
tm
puro策略2exp-rg25大鼠gschoexpress
tm
gs策略1
exp-rg50大鼠gschoexpress
tm
gs策略2exp-rg100大鼠gschoexpress
tm
gs策略3exp-hg25人gschoexpress
tm
gs策略1exp-hg50人gschoexpress
tm
gs策略2exp-hg100人gschoexpress
tm
gs策略3exp-md250小鼠dhfrchoexpress
tm
dhfr策略1exp-md500小鼠dhfrchoexpress
tm
dhfr策略2
89.cho-k1细胞池的细胞活率(viability,via)如图7和下表2所示。
90.表2：
[0091][0092][0093]
由上述结果可知，采用嘌呤霉素抗性标记和人gs标记的细胞池可以在在转染后两周内恢复，使用dhfr标记的细胞池则恢复的慢很多。另外，筛选过程中的筛选试剂的浓度对细胞池的恢复有一定影响。
[0094]
choexpress
tm
细胞池的细胞活率如图8和下表3所示：
[0095]
表3：
[0096] day 11day 14day 17exp-hg2595.497.6797.86exp-hg5097.1295.8497.28exp-hg10097.1291.8292.11exp-md25024.5836.9935.82exp-md50024.1424.6362.62exp-pr1098.5999.2899.24exp-pr25077.8695.8289.54exp-rg2568.9179.4384.11exp-rg5054.7660.6875.38exp-rg10054.7659.8963.19
[0097]
细胞活率恢复较好的cho-k1细胞池的活细胞密度(vcd)及细胞活率(via)检测结果(如图9所示)。
[0098]
细胞活率恢复较好的choexpress
tm
细胞池的活细胞密度(vcd)及细胞活率(via)检
7b；
[0123]
当葡萄糖浓度低于5g/l时，添加葡萄糖至其浓度为8g/l。
[0124]
表达量如图16所示。
[0125]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0126]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0127]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种表达载体，所述表达载体包括筛选标记表达单元，至少一个目的基因表达单元，以及piggybac转座子的反向末端重复序列。2.根据权利要求1的表达载体，其中，所述筛选标记表达单元包含筛选标记的编码序列，以及与所述筛选标记的编码序列可操作连接的第一调控序列，优选地，所述第一调控序列包括启动子的编码序列和终止子的编码序列。3.根据权利要求2的表达载体，其中，所述筛选标记为嘌呤霉素、新霉素、潮霉素b、和杀稻瘟菌素、谷氨酰胺合成酶、或二氢叶酸还原酶，优选地，所述筛选标记为人谷氨酰胺合成酶。4.根据权利要求2的表达载体，其中，所述筛选标记表达单元的启动子为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子、猴空泡病毒40启动子，和/或所述筛选标记表达单元的终止子为猴空泡病毒40聚腺苷化信号，牛生长激素聚腺苷化信号，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号或兔β-珠蛋白聚腺苷化信号，优选为猴空泡病毒40聚腺苷化信号；优选地，所述筛选标记表达单元包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子的编码序列和猴空泡病毒40聚腺苷化信号的编码序列；优选地，所述筛选标记表达单元包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子的编码序列，人谷氨酰胺合成酶筛选标记的编码序列和猴空泡病毒40聚腺苷化信号的编码序列。5.根据权利要求1的表达载体，其中，所述目的基因表达单元包括目的基因序列，以及与目的基因序列可操作连接的第二调控序列，优选地，所述第二调控序列包括目的基因表达调控元件的编码序列和终止子的编码序列；优选地，所述目的基因表达调控元件的编码序列具有选自seq id no.1-6所示的序列；优选地，所述目的基因表达单元的终止子为猴空泡病毒40聚腺苷化信号，牛生长激素聚腺苷化信号，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号或兔β-珠蛋白聚腺苷化信号，优选为牛生长激素聚腺苷化信号。6.一种表达系统，所述表达系统包括权利要求1-5任一项的表达载体。7.根据权利要求6的表达系统，还包含编码piggybac转座酶的辅助质粒。8.一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有权利要求1-5任一项的表达载体，或权利要求6或7的表达系统，优选地，所述宿主细胞的基因组中稳定整合有权利要求1-5任一项的表达载体；优选地，所述宿主细胞不包含编码piggybac转座酶的辅助质粒；优选地，所述宿主细胞为cho细胞。9.利用权利要求1-5任一项的表达载体或权利要求6或7的表达系统筛选细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用权利要求1-5任一项的表达载体或权利要求6或7的表达系统转染宿主细胞；以及(b)利用针对所述表达载体中的筛选标记的筛选试剂对步骤(a)获得的宿主细胞进行筛选的步骤。10.根据权利要求9的方法，其中，所述宿主细胞为cho细胞；优选地，所述筛选标记为嘌呤霉素，并且使用10μg/ml的嘌呤霉素对宿主细胞进行筛
选，所述宿主细胞转染有包含嘌呤霉素抗性筛选标记的所述表达载体；优选地，所述筛选标记为嘌呤霉素，并且使用10μg/ml、50μg/ml、250μg/ml浓度增高的嘌呤霉素对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含嘌呤霉素抗性筛选标记的所述表达载体；优选地，所述筛选标记为谷氨酰胺合成酶，并且使用25μm的蛋氨酸亚氨基代砜对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含谷氨酰胺合成酶筛选标记的所述表达载体；优选地，所述筛选标记为谷氨酰胺合成酶，并且使用25μm、50μm浓度增高的蛋氨酸亚氨基代砜对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含谷氨酰胺合成酶筛选标记的所述表达载体；优选地，所述筛选标记为谷氨酰胺合成酶筛选标记，并且使用25μm、50μm、100μm浓度增高的蛋氨酸亚氨基代砜对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有谷氨酰胺合成酶筛选标记的所述表达载体；优选地，所述筛选标记为人谷氨酰胺合成酶；优选地，所述筛选标记为二氢叶酸还原酶，并且使用250nm的氨甲喋呤对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含二氢叶酸还原酶筛选标记的所述表达载体；优选地，所述筛选标记为二氢叶酸还原酶，并且使用250nm、500nm浓度增高的氨甲喋呤对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含二氢叶酸还原酶筛选标记的所述表达载体。11.由权利要求10的筛选方法获得的细胞。12.权利要求1-5任一项的表达载体，权利要求6或7的表达系统，权利要求8的宿主细胞，或权利要求9或10的筛选方法，或权利要求11的细胞在生产表达量提高的目的蛋白中的应用。

技术总结
本发明公开了一种表达载体，通过该表达载体可以快速筛选得到细胞池，进一步筛选得到CHO克隆产生稳定CHO细胞系，还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量。提高了目的蛋白的表达量。


技术研发人员：沈潇 李京浩 亚娜
受保护的技术使用者：广州汉腾生物科技有限公司 佛山普津生物技术有限公司
技术研发日：2022.01.10
技术公布日：2023/7/22