一种生物制品及其制备方法和其在制备抗衰延寿产品中的应用

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种生物制品及其制备方法和其在制备抗衰延寿产品中的应用。


背景技术：

2.衰老，是指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象。衰老可分为两类：生理性衰老和病理性衰老。前者指成熟期后出现的生理性退化过程，后者是由于各种外来因素(包括各种疾病)所导致的老年性变化。人体衰老过程中的生理变化主要体现在机体组织细胞和构成物质的丧失，机体代谢率的减缓，机体和器官功能减退。衰老是不可避免的，但延缓衰老却是可能的。
3.机体的衰老主要受到遗传、环境、细胞基因等因素影响。遗传因素决定了各种动物的寿命都存在最高寿限。同时，外部环境(如空气质量、水质量等)和机体内部环境对衰老也会产生重大影响。此外，若机体大部分重要细胞都健康，那么机体的寿命也会相应加长。
4.现有医学和生物学研究发现，机体的衰老，是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程，受各种内外因素影响。线粒体病的迟发和渐进过程提示线粒体功能随着年龄的增加而退化。在正常生理状态下，机体自身的防御系统可及时清除能量代谢过程中产生的氧自由基。而在机体衰老的进程中，抗氧化防御系统作用减弱，线粒体内自由基不能有效地清除而积累，从而导致线粒体的氧化性损伤，包括生物膜损伤、mtdna损伤等。大量的研究证实，衰老与线粒体氧化磷酸化酶活性降低以及分裂终末的组织中突变mtdna积累密切相关。与增龄有关的突变类型主要是缺失，并且与氧化损伤有关。体细胞中mtdna突变随年龄而增加，与衰老的程度呈正相关性。mtdna突变的累积可诱发多种老年性疾病。
5.外泌体(exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、rna等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
6.细胞分泌的外泌体通过携带生物分子(蛋白质、mirnas、dna和其他非编码rnas)在细胞囊泡运输中发挥了不可或缺的作用。外泌体的功能取决于所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等多个进程中。
7.现有的针对抗衰老的技术研究中，存在有一些使用外泌体的相关技术文献，其主要聚焦在三个方面：
8.1、将某种类型的细胞进行体外培养后，分离其中的外泌体，产生抗衰老作用，其细胞来源主要为胚胎干细胞、脐带/胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牛胎盘细胞、神经干细胞、牙髓干细胞、脂肪来源干细胞等，如公开号cn113041208a的发明专利《胚胎干细胞外泌体在制备美白及抗衰老药物或者化妆品中的用途》；
9.2、将外泌体做为传递载体，负载某些抗衰物质或修饰某些小分子物质，包括活性肽、透皮肽、小分子肽、nampt基因等，如公开号cn112980801a的发明专利《一种nampt基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法》；
10.3、将外泌体与某种物质组合成组合物，共同用于抗衰老，如公开号cn111225659a的发明专利《包含乳酸菌来源的胞外囊泡的抗衰老组合物》。
11.但上述技术，均存在操作复杂、应用范围单一以及抗衰作用持续效果差等缺陷。


技术实现要素：

12.本发明的目的是提供了一种生物制品及其制备方法和其在制备抗衰延寿产品中的应用。
13.本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现：
14.一种生物制品，所述生物制品的有效成分中，包含有提取自哺乳动物血液的外泌体。
15.血液是唯一与所有器官都有接触的组织，携带着大量与机体相关的各种类型细胞，其所能产生的外泌体也是一个复杂的组合体，提取自血液的外泌体，其也具有最广泛的用途；同时，血液做为包含有外泌体的液态物质，其提取方法相对比较简单，而且血液做为机体内最大规模的液态物质，其所能够提取到的外泌体总量也明显要远高于其它器官/组织，更适于大规模、长期、重复性的施展用途。
16.进一步的，上述的生物制品，所述外泌体为提取自年轻哺乳动物动物体血液或血浆的外泌体。
17.直接提取自年轻动物体血液的外泌体，实际上是一组外泌体的集合，包含有各种类型细胞所分泌的外泌体，相互之间联系紧密，共同发挥作用。由于年轻动物体处于高速生长发育阶段，其血液中的外泌体数量和活性要远远高于年老动物体，且外泌体所包含的内容物(如mirna等)也要明显高于年老动物体。年老动物体血液内的外泌体，随着年龄增长，其中许多与抗衰老、抗氧化、激发活力相关的因子逐渐失活或减量，从而引发了衰老以及与衰老相关疾病的发生。而年轻动物体血液中所包含的外泌体，能够通过其中所包含的内容物，综合发挥出针对衰老及与衰老相关疾病发生的拮抗性，实现抗衰延寿的相应效果。
18.进一步的，上述的生物制品，所述年轻哺乳动物动物体是指生长年龄小于等于该物种平均寿命的17％的动物体；优选为生长年龄等于该物种平均寿命12％-16.5％的动物体。
19.由于动物体年龄总周期不同，而在针对动物体衰老机制的研究中，年龄是最直观的标准之一，故此，本发明也是采用年龄比例对“年轻”、“年老”的概念进行了定义。由于本发明的最终目的是以生物制品抑制人体的衰老，产生延寿效果的同时，拮抗由于衰老所产生的相关疾病，因而本发明在实验之初，即确定了以动物实验确定人体的外泌体使用效果，这也就确定了需要多种实验动物与人体的年龄之间具有相关性。
20.经过前期查询，为了更准确表达本发明所记载的“年轻动物体”、“年老动物体”的概念，申请人查询到了以下2篇相关文献，并以文献记载确定了实验小鼠的年龄定义：即“年轻”是指月龄4个月之内的小鼠，“年老”是指月龄在18个月以上的小鼠。
21.1、相关文献1：
22.《实验动物与人类年龄相关性研究进展》——中国比较医学杂志，2019，29(11)：116-122，陈玥，苏丹，贵文娟，孙效容。
23.其中，记载了小鼠等实验动物和人年龄对应的相关性，以人类年龄计算实验动物年龄如图1中的表1所示。
24.2、相关文献2：
25.《the mouse in biomedical research,2nd edition》。
26.其中，记载了小鼠不同生长阶段与人类对应关系，并以c57bl/6j为例进行了统计，如图2所示。
27.结合上述文献记载，同时申请人也在进行了大量实验后，最终优化和确认了本发明中所描述的“年轻动物体”是指生长年龄小于等于该物种平均寿命17％的动物体，优选为生长年龄等于该物种平均寿命12％-16.5％的动物体；“年老动物体”是指生长年龄大于等于该物种平均寿命62％的动物体，优选为生长年龄等于该物种平均寿命62％-95％的动物体。
28.上述的生物制品，所述外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为相同的哺乳动物(亦可以为不同的哺乳动物，即跨物种施用)。。
29.本技术中所记载的“供体动物”是指可以从其体内血液/血浆中分离/提取得到外泌体/mirna的不限物种的年轻动物体；“受体动物”是指可以接收从“供体动物”体内血液/血浆中分离/提取得到的外泌体/mirna的不限物种的年老动物体。
30.2007年，valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的外泌体可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mrna成分可以进入细胞浆中被翻译成蛋白质，不仅仅是mrna，外泌体所转移的microrna同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mrna的水平。后续通过不断的研究发现，外泌体是存在“跨物种”特性的，也即是从小鼠等动物体内产生的外泌体可以被人类相同或相似细胞获取，从而实现外泌体内容物的跨物种传递。外泌体的此种特性，大大增加了其对人体各种疾病的基因层面的诊断和治疗作用，同时由于外泌体是单一的微小囊泡结构，不同物种之间的外泌体并不会产生相应的免疫反应，也即是摒弃了跨物种的“排异反应”，大幅扩展了基因制剂的来源。
31.基于前述研究结果，在本发明的具体实施过程中，可采用多种动物的年幼动物体做为供体动物，采用多种动物的年老动物体做为受体动物，尤其是可以将年老人类群体做为受体动物，实现与相同物种一致的“焕活”效果。
32.进一步的，上述的生物制品，所述外泌体的提取方法为：通过超速离心与外泌体试剂盒相结合的方式提取。
33.进一步的，上述的生物制品，所述外泌体的提取方法具体为：
34.s1.获得动物体血液，并分离得到血浆；
35.s2.若s1中获得的血浆不立即使用，则置于-80℃保存；
36.s3.采用超速差异化离心方法对步骤s1中或s2中的血浆进行分离纯化，离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀；
37.s4.采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取，得到外泌体终产物；
38.若步骤s4中获得的外泌体终产物不立即使用，则置于4℃保存并于14天内使用，或置于-80℃保存。
39.近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，包括通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分、采用空间排阻色谱法(sec)进行分离纯化、利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来等等。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果也在逐渐提高。
40.超离法(超速离心法，或叫差速离心)是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的外泌体囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的外泌体数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。
41.本专利中提供的方法，是将外泌体试剂盒与超速离心方式相结合，对外泌体进行提取。结合提取的方式，克服了超速离心对外泌体的伤害，再辅以试剂盒提取则进一步增加了回收稳定性、增加了回收纯度，效果较单独使用超速离心或试剂盒提取更优。
42.进一步的，上述的生物制品，所述生物制品中的外泌体粒径范围为20-150纳米，优选的外泌体粒径范围为50-100纳米。
43.生物制品中，所包含的外泌体粒径范围需要在20-150纳米范围内，包括但不限于20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150纳米，优选的粒径范围为50-100纳米。通过对外泌体粒径和传递效率的相关性研究发现，外泌体粒径低于20纳米粒径或高于150纳米粒径，均会严重影响外泌体的传递效率。现有领域内的研究发现，理论上来说，外泌体粒径越小，其传播速度越快，同时这种传播速度的加快又会影响细胞的生长速度，使其生长速度加快；但由于本技术中，不仅需要外泌体的传递功能，也需要外泌体数量和外泌体内容物含量达到一定标准，故此粒径过低的外泌体，其内容物含量经过检测是无法达标的，也即是说，粒径过低或过高的外泌体均是无法实现本技术所需要效果的。申请人通过多次实验发现，粒径范围在20-150纳米的外泌体是能够实现相应的内容物传递并使其达到一定浓度，从而实现本发明所需的“焕活”效果，尤其是50-100纳米粒径的外泌体，其“焕活”效率最高，“焕活”效果最好。
44.本发明的第二个发明点在于提供了一种上述生物制品的制备方法，包括以下步骤：
45.1)获得动物体血液，并分离得到血浆；
46.2)若1)中获得的血浆不立即使用，则置于-80℃保存；
47.3)采用超速差异化离心方法对步骤1)中或2)中的血浆进行分离纯化，离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀；
48.4)采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取，得到外泌体终产物；
49.5)若步骤4)中获得的外泌体终产物不立即使用，则置于4℃保存并于14天内使用，或置于-80℃保存。
50.本发明的第三个发明点在于提供了另一种生物制品，所述生物制品的有效成分中，包含有一组mirna，所述mirna为mir-144、mir-149和/或mir-455(即可以为mir-144+mir-149+mir-455三种联用、mir-144单独使用、mir-149单独使用、mir-455单独使用、mir-144+mir-149两种联用、mir-149+mir-455两种联用、mir-144+mir-455两种联用)；所述mirna包含在前述的外泌体中。
51.优选地，上述一组mirna，其既可以是包含在前述的外泌体中的mirna并随外泌体
共同施用共同发挥作用，也可以将一组mirna单独提取出来后直接施用。
52.外泌体内包含多种不同分子，如蛋白质、脂质、dna、mrna和mirna。microrna(mirna)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小rna，几个mirnas也可以调节同一个基因。可以通过几个mirnas的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，mirna调节着人类三分之一的基因。
53.申请人经过大量实验研究发现，此三种mirna可单独或通过外泌体内容物的方式，对动物体的衰老产生一定拮抗作用。
54.本发明的第四个发明点在于，提供了上述生物制品在制备抗衰延寿产品中的应用。
55.生物制品的作用机理为，由于其所含有的年轻动物体血液所提取的大量外泌体，而采用此种外泌体可以“替换”、“置换”或“激活”年老动物体内的外泌体，从细胞层面改善了基础功能，从而减缓了衰老作用的发生，实现了延寿的效果。
56.进一步的，上述的应用，所述抗衰延寿产品的施用方式包括但不限于：口服、外敷、肌肉注射、静脉注射和/或静脉滴注。
57.施用方式，可以采用常规的多种施用方式，不限于所列出的几种，但由于外泌体来源是血液，故而，外泌体“置换”“激活”效果比较好的，主要是静脉注射和静脉滴注方法，在静脉注射一定量的年轻动物体血液外泌体后，能够以最快的速度(通过血液的全身流动)实现年轻年老动物体内的外泌体“置换”过程；通过实验可以得知，静脉注射和静脉滴注方式中，最优的选择则是静脉滴注方式，静脉注射的缺陷在于，短时大量的注入提取的外泌体，会造成机体内局部外泌体浓度过高，极有可能会引发不可预估的后果，而且静脉注射的总体用量也必然要低于静脉滴注。静脉滴注的优势在于，由于静脉中血液的流动是实时的，同时通常情况下静脉滴注过程中会对滴注液进行稀释，即可有效防止外泌体在机体内局部浓度过高的问题，而且由于静脉滴注速度可调，也使得在一定周期内可向机体内注入更多的外泌体，更持久的发挥外泌体的抗衰老作用。同时，通过口服施用再进入血液、通过皮肤外敷施用直接作用于皮肤毛发以及通过肌肉注射作用于肌肉骨骼的施用方式，也能够实现对机体不同部位的局部“焕活”效果。
58.进一步的，上述的应用，所述抗衰延寿产品的有效成分为外泌体时，其施用周期分为短期施用和长期施用；短期施用为将抗衰延寿产品每隔1-3天以静脉注射施用一次，每次剂量170-190μg，连续施用6-8次；长期施用为将抗衰延寿产品每6-8天以静脉注射施用一次，每次剂量170-190μg；
59.优选地，短期施用为将抗衰延寿产品每隔1天以静脉注射施用一次，每次剂量180μg，连续施用7次；长期施用为将抗衰延寿产品每7天以静脉注射施用一次，每次剂量180μg。
60.申请人设计的两种施用周期方式，分别为短期施用和长期施用，其效果相差不大，可根据受试体的反应进行相应调整。
61.进一步的，上述的应用，所述抗衰延寿产品的有效成分为mirna时，其是先构建mirna过表达的质粒，再将含有所述质粒的抗衰延寿产品进行施用，施用周期为每6-8天静脉注射1-3次，施用剂量为每次4-6mg/kg。
62.进一步的，上述的应用，所述抗衰延寿产品中，还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法，包括但不限于提高体内nad
+
辅酶水平的方法、加入烟酰胺核糖苷nr/烟酰胺单
核苷酸nmn制剂、加入雷帕霉素制剂。
63.本技术中所提供的生物制品(年轻动物体血液提取的外泌体或外泌体内容物mirna)，除了单独使用以外，还能够与其它具有抑制衰老或抗氧化的方法和制剂联合使用，也能够与其它用于抑制衰老或氧化的方法进行联合使用，实现了制剂或方法上的互补及相互影响，从而得以实现更优的效果。
64.本发明的的特点及优点是：
65.本发明提供的生物制品及其制备方法和其在制备抗衰延寿产品中的应用，生物制品中包含有从血液中提取的外泌体以及mirna，保证了外泌体内容物含量和外泌体本身的数量，同时，由于血液中的外泌体本身就是组合体，其能够更有效的实现多种功效，且来源简单、广泛，有利于长期、重复、大量的使用。
66.外泌体来源，可选择年轻动物的血液，以年轻动物血液中提取的外泌体“替换”、“置换”或“激活”年老动物体内的外泌体，提高年轻动物外泌体及外泌体内容物在年老动物体内的含量，从而能够实现激发年老动物生机活力的作用，也能够有效激发机体对抗因衰老引发疾病的体内机制，从而实现一定程度上的“返老还童”。
67.本技术中的动物体血液外泌体的提取方法，综合了试剂盒方法和超速离心方法的优势，通过将两种方法结合，克服了两种方法中的固有缺陷，提高了动物体血液外泌体提取过程的控制、准确性，降低了提取难度。
附图说明
68.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
69.图1为现有文献中记载的以人类年龄计算实验动物年龄的对比表格。
70.图2为现有文献中记载的以c57bl/6j为例显示的小鼠不同生长阶段与人类对应关系图示。
71.图3为外泌体的制备与分离结果图。
72.图3a为年轻/年老小鼠外泌体标志蛋白的检测结果；其中，cd9、cd63、alix和tsg101为外泌体标志蛋白，albumin为血浆标志蛋白，横坐标分别显示为血浆组(年轻/年老)、外泌体组(年轻/年老)和上清组(年轻/年老)。
73.图3b为年轻小鼠外泌体粒径的nanosight检测结果，横坐标为外泌体粒径(nm)，纵坐标显示为mexo-y的浓度(particles/ml)。
74.图3c为年老小鼠外泌体粒径的nanosight检测结果，横坐标为外泌体粒径(nm)，纵坐标显示为mexo-a的浓度(particles/ml)。
75.图3d为脐带血外泌体标志蛋白检测结果；其中，cd9、cd63、alix和tsg101为外泌体标志蛋白，albumin为血浆标志蛋白，三列分别显示了血浆组、脐带血外泌体组(ucb-exo)和上清组(exo-free)。
76.图3e为年轻/年老小鼠外泌体透射电镜检测结果，年老小鼠外泌体为mexo-o，年轻小鼠外泌体为mexo-y。
77.图4显示为“置换”外泌体后，小鼠全身各器官组织的变化数据图第一部分。
78.图4a为注射年轻小鼠外泌体后，小鼠的背部(左图)和腹部(右图)外观变化，其中，从左至右分别为年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠。
79.图4b为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从上至下分别为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉)衰老标志物β-半乳糖苷酶(β-gal)染色图片，其中，从左至右分别为年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠。
80.图4c为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从上至下分别为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉)增殖标志物brdu染色图片，其中，从左至右分别为年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠。
81.图4d为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从左至右分别为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉)衰老标志物β-半乳糖苷酶(β-gal)检测定量，其中，纵坐标记载为年老小鼠β-半乳糖苷酶的比较，每个组织中从左至右分别记载了年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠检测数值。
82.图4e为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从左至右分别为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉)增殖标志物brdu染色定量结果，其中，纵坐标记载为年老小鼠brdu的比较，每个组织中从左至右分别记载了年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠检测数值。
83.图5显示为“置换”外泌体后，小鼠全身各器官组织的变化数据图第二部分。
84.图5a为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从左至右分别为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉)活性氧(ros)检测定量结果，其中，纵坐标记载为年老小鼠活性氧的比较，每个组织中从左至右分别记载了年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠检测数值。
85.图5b为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从左至右分别为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉)晚期糖基化终末产物(age)检测定量结果，其中，纵坐标记载为年老小鼠age的比较，每个组织中从左至右分别记载了年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠检测数值。
86.图5c为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(从上至下分别为肝、心、肾、大脑海马体)脂褐素(lipofuscin)染色图片，其中，从左至右分别为年轻小鼠、注射了pbs空白对照的年老小鼠、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠。
87.图5d为年轻小鼠和年老小鼠各个组织(依次为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、睾丸)衰老标志物p21的western blot检测图片，其中，上排显示为p21的检测结果，下排显示为β-actin的内参检测结果；同一组织中，左列为年轻小鼠检测结果，右列为年老小鼠检测结果。
88.图5e为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(依次为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、睾丸)衰老标志物p21的western blot检测图片，其中，上排显示为p21的检测结果，下排显示为β-actin的内参结果；同一组织中，左列为注射pbs的年老小鼠(空白对照)检测结果，右列为注射年轻小鼠外泌体后的年老小鼠检测结果。
89.图5f为年轻小鼠和年老小鼠各个组织(横坐标依次为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、睾丸)衰老标志物p21(mrna水平)的western blot定量检测结果，同一组织中，左侧数据
为年轻小鼠检测结果，右侧数据为年老小鼠检测结果。
90.图5g为注射年轻小鼠外泌体后，年老小鼠各个组织(横坐标依次为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、睾丸)衰老标志物p21(mrna水平)的western blot定量检测结果，同一组织中，左侧数据为注射pbs的年老小鼠(空白对照)检测结果，右侧数据为注射年轻小鼠外泌体后的年老小鼠检测结果。
91.图6显示为“置换”外泌体后，小鼠全身各器官组织的变化数据图第三部分。
92.图6a为注射年轻小鼠外泌体后，小鼠产热量变化情况(左：统计图，右：折线图)，统计图中，从左至右分别为年轻小鼠、pbs(空白对照)、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠的数据。
93.图6b为注射年轻小鼠外泌体后，小鼠氧气消耗量变化情况(左：统计图，右：折线图)，统计图中，从左至右分别为年轻小鼠、pbs(空白对照)、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠的数据。
94.图6c为注射年轻小鼠外泌体后，小鼠呼吸交换率变化情况(左：统计图，右：折线图)，统计图中，从左至右分别为年轻小鼠、pbs(空白对照)、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠的数据。
95.图6d为注射年轻小鼠外泌体后，小鼠活动性变化情况(左：统计图，右：折线图)，统计图中，从左至右分别为年轻小鼠、pbs(空白对照)、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠的数据。
96.图6e为注射年轻小鼠外泌体后，小鼠二氧化碳生成量变化情况(左：统计图，右：折线图)，统计图中，从左至右分别为年轻小鼠、pbs(空白对照)、注射了年轻小鼠外泌体的年老小鼠的数据。
97.图7显示为mirna的相关效果数据。
98.图7a为维恩图展示循环mirna的重叠，mirna在人和小鼠的血浆中随着衰老而不断增加或减少；
99.其中，随着年龄增加的人体内外泌体有mir-130、mir-23a、mir-221、mir-29a、mir-29c、mir-34a，小鼠体内外泌体有mir-23b、mir-27b、mir-183a、mir-29a、mir-29c、mir-34a，二者重叠部分有mir-29a、mir-29c、mir-34a；
100.随着年龄减少的人体内外泌体有mir-144、mir-149、mir-455，小鼠体内外泌体有mir-7、let-7a、let-7f、mir-144、mir-149、mir-455，二者重叠部分有mir-144、mir-149、mir-455。
101.图7b为western blot代表图片：显示了转染scrrna、mir-29a/29c/34a mimic(模拟物)或mir-144/149/455mimic后细胞中的pgc1-α蛋白水平，其中，ne-4c为神经干细胞样细胞，c2c12为小鼠成肌细胞。
102.图7c-7h为转染(从左至右)scrrna、mir-29a/29c/34a或mir-144/149/455mimic进入细胞后的atp生成速率、线粒体复合物v活性、相对mtdna含量；其中，(c和f)显示转染scrrna、mir-29a/29c/34a或mir-144/149/455mimic进入细胞后的atp生成速率；(d和g)显示转染scrrna、mir-29a/29c/34a或mir-144/149/455mimic进入细胞后的线粒体复合物v活性；(e和h)显示转染scrrna、mir-29a/29c/34a或mir-144/149/455mimic进入细胞后的相对mtdna含量。
103.图7i为western bolt代表图片：显示了注射pbs和年轻外泌体的老年小鼠海马和肌肉中的pgc1-α蛋白水平。
104.图7j为western bolt代表图片：显示了与pbs或年轻的外泌体共培24小时后细胞(ne-4c为神经干细胞样细胞，c2c12为小鼠成肌细胞)中的pgc1-α蛋白水平。
105.图7k为western bolt代表图片：显示了转染scrrna、年轻外泌体加scrrna，或年轻外泌体加mir-144、mir-149和mir-455的反义寡核苷酸后细胞中(ne-4c为神经干细胞样细胞，c2c12为小鼠成肌细胞)的pgc1-α蛋白水平。
106.图7l-7m为用scrrna、年轻外泌体加scrrna或年轻外泌体加mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞中的ocr(oligomycin寡霉素、fccp线粒体氧化磷酸化解偶联剂、鱼藤酮rotenone-抗霉素antimycin a)。
107.图7n-7s为用(从左至右)scrrna、年轻外泌体加scrrna或年轻外泌体加mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞的atp生成速率、线粒体复合物v活性、相对mtdna含量；其中，(n和q)用scrrna、年轻外泌体加scrrna或年轻外泌体加mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞的atp生成速率；(o和r)用scrrna、年轻外泌体加scrrna或年轻外泌体加mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞的线粒体复合物v活性；(p和s)用scrrna、年轻外泌体加scrrna或年轻外泌体加mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞的相对mtdna含量。
108.图7t和u为edu(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)代表图片(t为ne-4c神经干细胞样细胞和u为c2c12小鼠成肌细胞)：用scrrna、年轻外泌体加scrrna或年轻外泌体加mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞中edu阳性细胞的代表性显微视野，其中，edu为5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷染色图，dapi为4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色图，merge为合并染色图。
109.图7v为western bolt代表图片：显示了细胞中衰老标志物p21的蛋白水平，其中，上排显示为p21的检测结果，下排显示为β-actin的内参检测结果，从左至右分别为转染scrrna、年轻外泌体加scrrna，或年轻外泌体加mir-144、mir-149和mir-455的反义寡核苷酸后细胞中(ne-4c为神经干细胞样细胞，c2c12为小鼠成肌细胞)的p21蛋白水平。
110.图8为外泌体短期施用β-半乳糖苷酶染色结果，其中，从上至下分别为肝、脾、肺、肾、大脑、睾丸，从左至右分别为pbs注射至年轻小鼠、pbs注射至年老小鼠、年轻小鼠外泌体注射至年老小鼠。
111.图9为外泌体短期施用p21 western blot结果，其中，检测器官组织依次为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、睾丸，左侧为pbs注射至年老小鼠，右侧为年轻小鼠外泌体注射至年老小鼠。
112.图10为外泌体长期施用β-半乳糖苷酶染色结果，其中，从上至下分别为肝、脾、肺、肾、大脑、睾丸，从左至右分别为pbs注射至年轻小鼠、pbs注射至年老小鼠、年轻小鼠外泌体注射至年老小鼠。
113.图11为外泌体长期施用p21 western blot结果，其中，检测器官组织依次为心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、睾丸，左侧为pbs注射至年老小鼠，右侧为年轻小鼠外泌体注射至年老小鼠。
114.图12显示为年轻的人外泌体注射年老小鼠后的焕活数据(体内实验)。
115.图12a.实验流程示意图，从19-24岁年轻人体内血液中提取外泌体sev，注射至21月龄的年老小鼠体内，每2周注射7次，分别进行行为测试和代谢分析；
116.图12b-d.水迷宫实验结果，左侧为pbs注射至年老小鼠，右侧为外泌体注射至年老小鼠；
117.图12b.潜伏期，其中，横坐标为天数，纵坐标为潜伏期(s)；
118.图12c.穿台次数结果，其中，纵坐标为穿台次数；
119.图12d.站台象限停留时间(s)；
120.图12e.关联性条件恐惧实验结果，纵坐标为静止时间所占百分比(％)；
121.图12f.疲劳跑台实验结果，纵坐标为力竭时间(min)；
122.图12g.海马和肌肉atp生成速率，左侧为海马体，右侧为肌肉；
123.图12h.海马和肌肉线粒体复合物v活性，左侧为海马体，右侧为肌肉；
124.图12i.海马和肌肉线粒体dna(mtdna)含量，左侧为海马体，右侧为肌肉；
125.图12j-m.组织电镜结果，上排为pbs注射至年老小鼠，下排为外泌体注射至年老小鼠；
126.图12j.海马组织电镜图片；
127.图12k.肌肉组织电镜图片；
128.图12l.海马组织线粒体统计；
129.图12m.肌肉组织线粒体统计；
130.图12n-o：肌肉组织琥珀酸脱氢酶(sdh)染色结果，n.图片(上排为pbs注射至年老小鼠，下排为外泌体注射至年老小鼠)，o.统计结果。
131.图13显示为年轻的人外泌体在体外与细胞共培养后的焕活数据(体外实验)。
132.图13a.实验流程示意图，从19-24岁年轻人体内血液中提取外泌体sev，注入至神经干细胞样细胞ne-4c和小鼠成肌细胞c2c12中，共培养24小时后，分别进行代谢分析和衰老表型分析；；
133.图13b和图13e.atp生成速率(b.神经干细胞样细胞ne-4c，e.小鼠成肌细胞c2c12)；
134.图13c和图13f.线粒体复合物v活性nmol/min/104cell(c.神经干细胞样细胞ne-4c，f.小鼠成肌细胞c2c12)，；
135.图13d和图13g.线粒体dna含量(d.神经干细胞样细胞ne-4c，g.小鼠成肌细胞c2c12)；
136.图13h-k.神经干细胞样细胞ne-4c的seahorse仪器分析实验结果pmol/min/105cell(h.折线图，i.基础呼吸率，j.atp-相关呼吸率，k.最大呼吸率)；
137.图13l-o.小鼠成肌细胞c2c12的seahorse仪器分析实验结果pmol/min/105cell(l.折线图，m.基础呼吸率，n.atp-相关呼吸率，o.最大呼吸率)；
138.图13p.神经干细胞样细胞ne-4cp21 mrna含量；
139.图13q.神经干细胞样细胞ne-4c增殖能力(edu染色、dapi染色和merge合并染色)检测；
140.图13r.小鼠成肌细胞c2c12 p21 mrna含量；
141.图13s.小鼠成肌细胞c2c12增殖能力(edu染色、dapi染色和merge合并染色)检测。
142.图14-图18显示为三种mirna单独使用以及其中任意两种配合使用的效果对比图。
143.图14显示为mirna的western bolt代表图片：显示了细胞中衰老标志物p21的蛋白水平，其中，上排显示为p21的检测结果，下排显示为β-actin的内参检测结果，从左至右分别为转染scrrna、mir-144mimic，scrrna、mir-149mimic,scrrna、mir-455mimic后细胞中(ne-4c为神经干细胞样细胞，c2c12为小鼠成肌细胞)的p21蛋白水平。
144.图15显示为ne-4c细胞转染(从左至右)scrrna(对照)、联合或单独转染mir-144/149/455mimic进入细胞后的atp生成速率、线粒体复合物v活性、相对mtdna含量。
145.图16显示为c2c12细胞转染(从左至右)scrrna(对照)、联合或单独转染mir-144/149/455mimic进入细胞后的atp生成速率、线粒体复合物v活性、相对mtdna含量。
146.图17显示为ne-4c细胞用(从左至右)scrrna(对照1)、年轻外泌体加scrrna(对照2)、年轻外泌体单独或联合加入mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞的atp生成速率、线粒体复合物v活性、相对mtdna含量。
147.图18显示为c2c12细胞用(从左至右)scrrna、年轻外泌体加scrrna、年轻外泌体单独或联合加入mir-144/149/455反义寡核苷酸处理24小时后细胞的atp生成速率、线粒体复合物v活性、相对mtdna含量。
148.从图15至图18可以明显看出，三种外泌体共同施用时，其效果明显要优于将其中任意一种单独使用或任意两种共同施用。
149.图19-图21显示为免疫反应检测结果。
150.图19显示为注射pbs、年轻小鼠外泌体以及年轻人外泌体后衰老小鼠肝肾功能生化分析结果(数据从左至右分别为衰老小鼠注射pbs、衰老小鼠注射年轻小鼠血液外泌体、衰老小鼠注射年轻人血液外泌体)。其中，图19a.血清谷丙转氨酶(alt)、图19b.谷草转氨酶(ast)、图19c.碱性磷酸酶(alp)、图19d.胆红素(tbil)，图19e.血清肌酐(crea)和图19f.血尿素氮(bun)水平。
151.从图中可以看出，年轻人血液外泌体注射至衰老小鼠体内后，衰老小鼠的肝肾功能生化分析结果并未产生明显变化，也即是说明外泌体的“跨物种”注射基本未出现会造成肝肾损伤的免疫反应。
152.图20显示为注射pbs、年轻小鼠外泌体以及年轻人外泌体后衰老小鼠炎症细胞因子水平检测结果(数据从左至右分别为衰老小鼠注射pbs、衰老小鼠注射年轻小鼠血液外泌体、衰老小鼠注射年轻人血液外泌体)。
153.其中，图20a.il-6，图20b.tnf-α水平。
154.从图中可以看出，年轻人血液外泌体注射至衰老小鼠体内后，衰老小鼠的炎症细胞因子水平检测结果并未产生明显变化，也即是说明外泌体的“跨物种”注射基本未出现会引起炎症发病的免疫反应。
155.图21显示为注射pbs、年轻小鼠外泌体以及年轻人外泌体后衰老小鼠补体水平检测结果(数据从左至右分别为衰老小鼠注射pbs、衰老小鼠注射年轻小鼠血液外泌体、衰老小鼠注射年轻人血液外泌体)。其
156.中，包括了血清补体3和血清补体4水平。
157.从图中可以看出，年轻人血液外泌体注射至衰老小鼠体内后，衰老小鼠的补体水平检测结果并未产生明显变化，也即是说明外泌体的“跨物种”注射基本未出现会引起补体
c3/c4异常的免疫反应。
具体实施方式
158.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
159.实施例1：
160.一种生物制品，所述生物制品的有效成分中，包含有提取自哺乳动物血液的外泌体。
161.外泌体为提取自年轻哺乳动物动物体血液或血浆的外泌体。
162.年轻哺乳动物动物体是指生长年龄小于等于该物种平均寿命的17％的动物体；优选为生长年龄等于该物种平均寿命12％-16.5％的动物体。
[0163]“年轻动物体”是指生长年龄小于等于该物种平均寿命17％的动物体，优选为生长年龄等于该物种平均寿命12％-16.5％的动物体；“年老动物体”是指生长年龄大于等于该物种平均寿命62％的动物体，优选为生长年龄等于该物种平均寿命62％-95％的动物体。
[0164]
上述的生物制品，外泌体的提取来源与生物制品的施用对象为相同的哺乳动物(亦可以为不同的哺乳动物，即跨物种施用)。。
[0165]
通过图12-图13的体内、体外实验能够看出，供体动物(年轻人类)和受体动物(年老小鼠)可以为不同的物种，同时，跨物种的供体动物外泌体也能够对受体动物产生相应的抗衰效果。
[0166]
上述的生物制品，所述外泌体的提取方法为：通过超速离心与外泌体试剂盒相结合的方式提取。
[0167]
进一步的，上述的生物制品，所述外泌体的提取方法具体为：
[0168]
s1.获得动物体血液，并分离得到血浆；
[0169]
s2.若s1中获得的血浆不立即使用，则置于-80℃保存；
[0170]
s3.采用超速差异化离心方法对步骤s1中或s2中的血浆进行分离纯化，离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀；
[0171]
s4.采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取，得到外泌体终产物；
[0172]
若步骤s4中获得的外泌体终产物不立即使用，则置于4℃保存并于14天内使用，或置于-80℃保存。
[0173]
所述生物制品中的外泌体粒径范围为20-150纳米，优选的外泌体粒径范围为50-100纳米。
[0174]
生物制品中，所包含的外泌体粒径范围需要在20-150纳米范围内，包括但不限于20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150纳米，优选的粒径范围为50-100纳米。
[0175]
一种生物制品的制备方法，包括以下步骤：
[0176]
1)获得动物体血液，并分离得到血浆；
[0177]
2)若1)中获得的血浆不立即使用，则置于-80℃保存；
[0178]
3)采用超速差异化离心方法对步骤1)中或2)中的血浆进行分离纯化，离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀；
[0179]
4)采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取，得到外泌体终产物；
[0180]
5)若步骤4)中获得的外泌体终产物不立即使用，则置于4℃保存并于14天内使用，或置于-80℃保存。
[0181]
另一种生物制品，所述生物制品的有效成分中，包含有一组mirna，所述mirna为mir-144、mir-149和/或mir-455(即可以为mir-144+mir-149+mir-455三种联用、mir-144单独使用、mir-149单独使用、mir-455单独使用、mir-144+mir-149两种联用、mir-149+mir-455两种联用、mir-144+mir-455两种联用)；所述mirna包含在前述的外泌体中。
[0182]
优选地，上述一组mirna，其既可以是包含在前述的外泌体中的mirna并随外泌体共同施用共同发挥作用，也可以将一组mirna单独提取出来后直接施用。
[0183]
上述生物制品在制备抗衰延寿产品中的应用。
[0184]
抗衰延寿产品的施用方式包括但不限于：口服、外敷、肌肉注射、静脉注射和/或静脉滴注。
[0185]
抗衰延寿产品的有效成分为外泌体时，其施用周期分为短期施用和长期施用；短期施用为将抗衰延寿产品每隔1-3天以静脉注射施用一次，每次剂量170-190μg，连续施用6-8次；长期施用为将抗衰延寿产品每6-8天以静脉注射施用一次，每次剂量170-190μg；
[0186]
优选地，短期施用为将抗衰延寿产品每隔1天以静脉注射施用一次，每次剂量180μg，连续施用7次；长期施用为将抗衰延寿产品每7天以静脉注射施用一次，每次剂量180μg。
[0187]
抗衰延寿产品的有效成分为mirna时，其是先构建mirna过表达的质粒，再将含有所述质粒的抗衰延寿产品进行施用，施用周期为每6-8天静脉注射1-3次，施用剂量为每次4-6mg/kg。
[0188]
抗衰延寿产品中，还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法，包括但不限于提高体内nad
+
辅酶水平的方法、加入烟酰胺核糖苷nr/烟酰胺单核苷酸nmn制剂、加入雷帕霉素制剂。
[0189]
从本发明所提供的图1-图13可以看出，注射年轻小鼠外泌体及其包含的mirna可以有效恢复年老小鼠外观，延缓/拮抗全身主要器官的衰老，恢复线粒体功能，恢复细胞呼吸能力，同时，外泌体的跨物种注射也能够产生相应效果。
[0190]
实施例2：
[0191]
一、动物体选择：
[0192]
1、年龄选择：
[0193]
年轻动物体：选择生长年龄小于等于该物种平均寿命17％的动物体；优选为生长年龄等于该物种平均寿命12％-16.5％的动物体；
[0194]
本实施例所用实验用年轻小鼠，为月龄4个月之内的小鼠(约相当于人类年龄13.15岁之内)；
[0195]
年老动物体：选择生长年龄大于等于该物种平均寿命62％的动物体，优选为生长年龄等于该物种平均寿命62％-95％的动物体；
[0196]
本实施例所用实验用年老小鼠，为月龄18个月以上的小鼠(约相当于人类年龄59岁以上)。
[0197]
以人类年龄计算实验动物年龄的对比表如图1所示，小鼠不同生长阶段与人类的对应关系如图2所示。
[0198]
在现有的研究中，还存在其它相关记载，如dna甲基化变化与衰老的相关性(stubbs,t.m.,bonder,m.j.,stark,ak.et al.multi-tissue dna methylation age predictor in mouse.genome biol 18,68(2017).https://doi.org/10.1186/s13059-017-1203-5)。该研究在多个组织和年龄的小鼠中生成了迄今为止最全面的一组匹配的单碱基分辨率甲基化组。该结果可以研究dna甲基化变化与衰老之间的相关性。该研究第一次建立了一个小鼠表观遗传时钟，它根据整个小鼠基因组329个离散cg位点的甲基化状态估计年龄。这种新的表观遗传时钟的表现类似于人类表观遗传时钟，可以用于评估无关甲基化数据集中的(表观遗传)年龄。具体而言，小鼠时钟在测试的所有组织和年龄时，年龄相关性为0.839，测试数据中的中位绝对误差(mae)为3.33周。因此：小鼠表观遗传时钟的329个位点在预测小鼠样本年龄方面的表现优于小鼠基因组中对应于人类horvath时钟位点的位点；小鼠表观遗传时钟存在预测误差，需要进行实验和数据集来评估其在老年小鼠中的准确性。
[0199]
上述的dna甲基化研究对于动物体衰老的时间描述更加精准，是完全可以用于本发明技术中进行年轻动物和年老动物的具体限定的，相信也必然会给出更加精准的机体机能对应阶段，但由于动物体内的各组织是随时在变化的，而本技术也并不需要对生长阶段进行严格限定，只是以年龄或甲基化程度做为判定外泌体是否为“年轻”或“年老”动物体的就可以，故此，本发明的限定及描述中，仍采用了以动物体年龄限定“年轻”、“年老”的方式。
[0200]
2、动物选择：
[0201]
本实施例中所用小鼠，购自维通利华实验动物技术有限公司。
[0202]
二、血液来源、血浆提取及保存：
[0203]
1、血液来源：
[0204]
本实施例中的血液来源可选自人、小鼠、脐血，具体取血过程分别为：
[0205]
1)人取血：
[0206]
(1)准备试管：取合适数量和规格的试管备用。
[0207]
(2)检查注射器：打开一次性注射器包装，左手持针头下座，右手持针筒，将针头和针筒紧密连接，并使针头斜面对准针筒刻度，抽拉针栓检查有无阻塞和漏气。最后排尽注射器中的空气，备用。
[0208]
(3)选择静脉：被采样人(18岁-20岁)取坐位，前臂水平伸直置于桌面枕垫上。暴露穿刺部位，选择容易固定、明显可见的肘部静脉。
[0209]
(4)消毒：先用30g/l碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75％乙醇棉签以同样方法拭去碘迹，待干。
[0210]
(5)扎压脉带：在采血部位上端扎压脉带或止血带，被采样人反复握拳几次后握紧拳头，使静脉充盈暴露，便于穿刺。
[0211]
(6)穿刺：取下针头无菌帽，以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，食指固定针头下座，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30
°
角斜行快速刺入皮肤，然后以5
°
角向前穿破静脉壁进入静脉腔。见回血后，将针头顺势探入少许，以免采血时针头滑出；但不可用力深刺，以免造成血肿，同时立即去掉压脉带。
[0212]
(7)抽血：以左手固定注射器，缓缓抽动注射器内芯至所需血量后，用消毒干棉球压住针孔，迅速拔出注射器。被采样人继续按压针孔数分钟，以防出血。
[0213]
(8)放血与混匀：取下注射器针头，将血液沿试管壁缓缓注入抗凝管中，防止溶血和泡沫产生。轻轻混匀抗凝血，切忌振荡试管，盖紧试管塞备用。
[0214]
2)小鼠取血：
[0215]
(1)按需准备适量含3.5％枸橼酸钠的1.5ml离心管；
[0216]
(2)左手拇、食指抓取小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部；
[0217]
(3)中指将年轻小鼠(2月龄)左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部，捻动拇指，轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出；
[0218]
(4)用弯头镊夹取眼球；
[0219]
(5)根据需要捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入离心管；
[0220]
(6)同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度；
[0221]
(7)当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠,合上离心管管帽，180度上下颠倒8次，使血液与抗凝剂充分混合。
[0222]
3)脐血取血：
[0223]
(1)检查采血管、注射器是否在有效期，有无破损。分娩前按无菌原则将注射器打开待用；
[0224]
(2)胎儿娩出后，常规断脐；
[0225]
(3)消毒脐带：用碘伏纱布自脐带断端向胎盘断端快速擦拭，消毒2遍，消毒范围为自脐带断端10-15cm，清除血液羊水胎粪等；消毒完成后用此纱布扶持住脐带断端，并暴露好脐静脉的充盈处准备穿刺；
[0226]
(4)脐静脉穿刺采血：取一支30ml的无菌注射器，摘除针帽，在距脐带断端3-5cm处针头斜面朝下或侧面小角度穿刺脐静脉采血；如脐带相对平直，见血后针头可沿血管壁顺行1-2cm，再用止血钳或手固定穿刺针头；抽取30ml脐血后，去除针头放入锐器盒，将注射器中的30ml脐血立即注射入摘除管帽的3支10ml的edta采血管中，合上3只管帽，180度上下颠倒8次，使脐带血与抗凝剂充分混合。
[0227]
2、血浆提取：
[0228]
采血后6小时内离心，将采血管置于离心机中，1500g(或3000rpm)，离心5-10min，离心完毕可见血浆在最上层，血细胞在底层，离心温度为室温或4度均可。
[0229]
3、血浆保存：
[0230]
将上层血浆小心的转移到干净的eppendoff管，于-80℃长期保存待用。
[0231]
三、外泌体提取及保存：
[0232]
1、外泌体提取：
[0233]
(1)血浆在37℃水浴锅中融化，用等体积的pbs稀释；
[0234]
(2)在4℃下以500
×
g离心5分钟，取上清，在4℃下以3,000
×
g离心25分钟，取上清，在4℃下以12,000
×
g离心60分钟，取上清；
[0235]
(3)将上清在4℃下以120,000
×
g离心70分钟，小心移除上清液备用，沉淀用pbs溶解；
[0236]
(4)根据总外泌体分离试剂盒(来自血浆)(invitrogen，4484450，ma，usa)的使用说明书提取一半的上清液，将0.2倍上清体积的外泌体沉淀试剂添加到上清液中；
[0237]
(5)迅速涡旋振荡混匀，在室温下孵育10分钟；
[0238]
(6)若血浆来源于小鼠，在4℃下10,000
×
g离心30分钟；若血浆来源于人，在室温下10,000
×
g离心10分钟；小心移除上清液，在4℃下10,000
×
g离心30秒，小心移除上清液，沉淀用pbs溶解。
[0239]
2、外泌体保存：
[0240]
将步骤(3)和(6)得到的沉淀集合，即为外泌体，外泌体制成的生物制品，4℃可保存2周，-80℃长期保存。
[0241]
图3显示了提取到的外泌体的各项相关数据。
[0242]
四、生物制品施用方式：
[0243]
直接提取到的外泌体或保存之后的年轻动物的外泌体，可通过多种施用方式进行“年老动物”的施用，包括口服、皮肤外敷、肌肉注射、静脉注射和静脉滴注等。其中，口服的施用方式，效果相对较差，但施用方式较方便；皮肤外敷施用的方式，其针对皮肤毛发的效果较好，但吸收效果相对较差；肌肉注射施用方式针对肌肉骨骼的活化效果较好，但对于机体其它部位的效果较差；静脉注射和静脉滴注，是所有施用方式中的最优选择，其通过血液边激活外泌体或活化物质(mirna等)，边将其运输至全身各个部位，能够有效实现机体的全面“焕活”。
[0244]
图4-图6，以动物体器官组织的检测以及动物体多种机能检测的注射年轻动物体外泌体前后的对比数据，验证了本发明所提供的年轻动物体外泌体确实具有抗衰效果。
[0245]
五、生物制品施用周期：
[0246]
1)短期施用：
[0247]
将该外泌体制成的生物制品，按照每隔一天注射一次，每次180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内，注射7次。组织生化检测结果如图8、9所示。
[0248]
2)长期施用：
[0249]
将该外泌体制成的生物制品，按照每周一次，每次180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内，组织生化检测结果如图10、11所示。
[0250]
从数据图结果可以看出，无论是短期施用还是长期施用，都能够产生相应的抗衰效果，且二者施用效果近似。
[0251]
实施例3：
[0252]
另外一种相关生物制品：
[0253]
另一种生物制品，其有效成分为，上述的外泌体中所含有的mirna；mirna为mir-144、mir-149和/或mir-455。
[0254]
图7显示了mirna的选择过程，以及其在外泌体中所起到的抗衰延寿作用效果，从图7的数据对比可以看出，外泌体中所含有的mir-144、mir-149和/或mir-455，确实具有较强的抗衰效果，推断可能为年轻动物外泌体具有抗衰效果的主要有效成分。
[0255]
实施例4：
[0256]
所述外泌体生物制品的制备方法与实施例2相同，并将外泌体生物制品与其它方法或制剂联用：
[0257]
1、方法：
[0258]
nad
+
辅酶能够通过细胞氧化还原反应催化多种细胞代谢功能，并通过细胞氧化还原反应转化为nadh，增加nad
+
水平的方法能够延长小鼠的健康寿命，采用此方法也可与本发明的生物制品联合使用。
[0259]
2、与制剂nr/nmn联用：
[0260]
1)与nr/nmn联用操作：
[0261]
基于上述nad
+
辅酶方法，同时，基于nad
+
不被细胞吸收，因此不能直接补充的原因，通常采用添加其前体并利用nad
+
合成途径的方式来提高体内nad
+
水平：两种最常见的测试是烟酰胺核糖苷(nr)和烟酰胺单核苷酸(nmn)，因此，设计实验与外泌体联用，具体如下：
[0262]
a.从年轻小鼠的静脉取血，使用目前市面上可购得的外泌体提取试剂盒对血液中的外泌体进行提取，然后进行超高速离心，获得外泌体生物制品；
[0263]
b.将粉状鼠粮与溶于水的nr/nmn混合制备微丸，颗粒在层流罩下干燥48小时，获得nr/nmn生物制品；
[0264]
c.将该外泌体制成的生物制品，按照每周一次，每次180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内，将nr/nmn生物制品，按照400mg/kg/天的剂量，饲喂给小鼠；
[0265]
d.经过长时间的实验，该生物制品能够延缓注射对象各个主要组织(心脏、肝脏、大脑、脾、肺、肾脏、肌肉、睾丸)的衰老过程(β-半乳糖苷酶含量、p21蛋白含量)。该延缓程度与用pbs溶液作为对照的对照组相比具有明显的可观测结论。
[0266]
2)nr/nmn联用结果：
[0267]
申请人将单独使用nr/nmn的数据、单独使用外泌体的数据、以及二者联用的数据结果进行了对比，单独使用外泌体后的测试数据优于单独使用nr/nmn的测试数据，同时，二者联用的测试数据明显优于将二者单独施用的测试数据，由此可以说明，nr/nmn和外泌体的共同施用，产生了相互关联的促进作用。
[0268]
3、与制剂雷帕霉素联用：
[0269]
1)与雷帕霉素联用操作：
[0270]
雷帕霉素是一种大环内酯类化合物，于1960年首次发现，是一种抗真菌药物，随后发现它在哺乳动物细胞中可以调节细胞生长和各种细胞过程，包括自噬、核糖体生物发生、蛋白质合成和转换，以及脂质、核苷酸和葡萄糖的代谢。从9个月或20个月的年龄开始给予雷帕霉素，可以延长多个小鼠品系的中位与最大寿命。因此，设计实验与外泌体联用，具体如下：
[0271]
a.从年轻小鼠的静脉取血，使用目前市面上可购得的外泌体提取试剂盒对血液中的外泌体进行提取，然后进行超高速离心，获得外泌体生物制品；
[0272]
b.将雷帕霉素溶解在dmso中至100mg/ml，然后在5％peg-400/5％tween-80中进一步稀释至最终浓度为1.2mg/ml，无菌过滤，获得雷帕霉素生物制品；
[0273]
c.将该外泌体制成的生物制品，按照每周一次，每次180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内，将雷帕霉素生物制品，按照每天一次，每次8mg/kg的剂量，腹腔注射到小鼠体内；
[0274]
d.经过长时间的实验，该生物制品能够延缓注射对象各个主要组织(心脏、肝脏、大脑、脾、肺、肾脏、肌肉、睾丸)的衰老过程(β-半乳糖苷酶含量、p21蛋白含量)。该延缓程度
与用pbs溶液作为对照的对照组相比具有明显的可观测结论。
[0275]
2)雷帕霉素联用结果：
[0276]
申请人将单独使用雷帕霉素的数据、单独使用外泌体的数据、以及二者联用的数据结果进行了对比，单独使用外泌体后的测试数据优于单独使用雷帕霉素的测试数据，同时，二者联用的测试数据明显优于将二者单独施用的测试数据，由此可以说明，雷帕霉素和外泌体的共同施用，产生了相互关联的促进作用。
[0277]
实施例5：
[0278]
所述外泌体生物制品的制备方法与实施例2相同，并将外泌体生物制品用于免疫反应，具体包括以下三个方面：
[0279]
1、对补体激活的影响：
[0280]
补体(complement，c)是存在于人体和脊椎动物血清与组织液中的一组具有酶活性、不耐热的球蛋白，多数由肝脏实质细胞、单核细胞、巨噬细胞合成。正常情况下，循环中的补体成分均以无活性的酶前体形式存在，免疫复合物或其他因素可激活补体。其中，补体3(c3)是血清中含量最高的补体成分，主要由巨噬细胞和肝脏合成，在c3转化酶的作用下，裂解成c3a和c3b两个片段，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。另外，补体4(c4)是补体传统途径活化的一个早期成分，c4主要在肝细胞和巨噬细胞中合成，在防止免疫复合物沉淀、激活补体、中和病毒和促进吞噬等方面起一定作用。因此，设计实验检测补体表达量，具体如下：a.从年轻小鼠的静脉取血与年轻人的静脉血，使用目前市面上可购得的外泌体提取试剂盒对血液中的外泌体进行提取，然后进行超高速离心，获得外泌体生物制品；b.将该外泌体制成的生物制品，按照180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内；c.尾静脉注射外泌体完毕后，提取小鼠血清，采用elisa试剂盒检测检测各组血清补体3(mu30594,bioswamp)、补体4(mu30595,bioswamp)水平，验证补体激活是否缺失。
[0281]
测试结果如图21所示。
[0282]
2.炎症细胞因子水平检测：
[0283]
炎症细胞因子是指参与炎症反应的各种细胞因子，其作用是诱导t细胞活化增殖、分化等。在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是tnf-α、il-6、il-1β、单核细胞趋化蛋白(il-8、mcp-1)等。其中，tnf-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放；il一6能诱导b细胞分化和产生抗体，并诱导t细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。mcp-1是β亚家族的代表，可趋化单核细胞。因此，设计实验检测炎症细胞因子水平，具体如下：
[0284]
a.从年轻小鼠的静脉取血与年轻人的静脉血，使用目前市面上可购得的外泌体提取试剂盒对血液中的外泌体进行提取，然后进行超高速离心，获得外泌体生物制品；
[0285]
b.将该外泌体制成的生物制品，按照180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内；c.尾静脉注射外泌体完毕后，提取小鼠血清，采用elisa试剂盒检测各组tnf-α(ab208348,abcam)和il-6(ab100712,abcam)水平，使用细胞计数珠阵列小鼠flex试剂盒(bd biosciences)检测单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)和角化细胞来源的趋化因子(kc)的水平，验证是否导致炎症效应。
[0286]
测试结果如图20所示。
[0287]
3.肝肾功能生化分析：
[0288]
肝功能血生化分析用于肝损伤的初步评估，包括测定血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶(alt和ast)、碱性磷酸酶(alp)和胆红素(tbil和dbil)水平。血清肌酐(crea)、血尿素氮(bun)和尿酸(ua)被用作肾脏损害的指标，并已被用作评估急性肾损伤的金标准生物标志物。肝肾功能生化分析是诊断血液疾病或身体有无炎症贫血或凝血问题的基本检查。因此，设计实验检测炎症细胞因子水平，具体如下：
[0289]
a.从年轻小鼠的静脉取血与年轻人的静脉血，使用目前市面上可购得的外泌体提取试剂盒对血液中的外泌体进行提取，然后进行超高速离心，获得外泌体生物制品；
[0290]
b.将该外泌体制成的生物制品，按照180μg的剂量，通过静脉注射到其他小鼠体内；
[0291]
c.尾静脉注射外泌体完毕后，提取小鼠血清，检测各组肝肾功能生化指标，验证肝肾是否有损伤。
[0292]
测试结果如图19所示。
[0293]
通过上述记载的试验及试验结果可以看出，外泌体的提取来源与生物制品的施用对象，既可以是相同的哺乳动物，也可以为不同的哺乳动物，不同的哺乳动物之间进行外泌体的相互施用不会引起免疫反应，是安全可靠的。
[0294]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种生物制品，其特征在于，所述生物制品的有效成分中，包含有提取自哺乳动物血液的外泌体。2.根据权利要求1所述的生物制品，其特征在于，所述外泌体为提取自年轻哺乳动物动物体血液或血浆的外泌体。3.根据权利要求1-2任一所述的生物制品，其特征在于，所述外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为相同的哺乳动物。4.根据权利要求1-3任一所述的生物制品，其特征在于，所述外泌体的提取方法为：通过超速离心与外泌体试剂盒相结合的方式提取。5.根据权利要求4所述的生物制品，其特征在于，所述外泌体的提取方法具体为：s1.获得动物体血液，并分离得到血浆；s2.若s1中获得的血浆不立即使用，则置于-80℃保存；s3.采用超速差异化离心方法对步骤s1中或s2中的血浆进行分离纯化，离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀；s4.采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取，得到外泌体终产物；s5.若步骤s4中获得的外泌体终产物不立即使用，则置于4℃保存并于14天内使用，或置于-80℃保存。6.根据权利要求1-3所述的生物制品，其特征在于，所述生物制品中的外泌体粒径范围为20-150纳米，优选的外泌体粒径范围为50-100纳米。7.一种生物制品的制备方法，其特征在于，所述生物制品为权利要求1-6任一所述的生物制品，其制备方法包括以下步骤：1)获得动物体血液，并分离得到血浆；2)若1)中获得的血浆不立即使用，则置于-80℃保存；3)采用超速差异化离心方法对步骤1)中或2)中的血浆进行分离纯化，离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀；4)采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取，得到外泌体终产物；5)若步骤4)中获得的外泌体终产物不立即使用，则置于4℃保存并于14天内使用，或置于-80℃保存。8.一种生物制品，其特征在于，所述生物制品的有效成分中，包含有一组mirna，所述mirna为mir-144、mir-149和/或mir-455；所述mirna包含在权利要求1-7任一所述的外泌体中。9.权利要求1-8任一所述的生物制品在制备抗衰延寿产品中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗衰延寿产品的施用方式包括但不限于：口服、外敷、肌肉注射、静脉注射和/或静脉滴注。11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗衰延寿产品的有效成分为外泌体时，其施用周期分为短期施用和长期施用；短期施用为将抗衰延寿产品每隔1-3天以静脉注射施用一次，每次剂量170-190μg，连续施用6-8次；长期施用为将抗衰延寿产品每6-8天以静脉注射施用一次，每次剂量170-190μg。12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗衰延寿产品的有效成分为mirna时，其是先构建mirna过表达的质粒，再将含有所述质粒的抗衰延寿产品进行施用，施用周
期为每6-8天静脉注射1-3次，施用剂量为每次4-6mg/kg。13.根据权利要求9-12任一所述的应用，其特征在于，所述抗衰延寿产品中，还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法，包括但不限于提高体内nad+辅酶水平的方法、加入烟酰胺核糖苷nr/烟酰胺单核苷酸nmn制剂、加入雷帕霉素制剂。

技术总结
本发明提供了一种生物制品，所述生物制品的有效成分中，包含有提取自哺乳动物血液的外泌体，并提供了其制备方法和应用。本发明的的特点及优点是：本发明提供的生物制品及其制备方法和其在制备抗衰延寿产品中的应用，生物制品中包含有从血液中提取的外泌体以及miRNA，保证了外泌体内容物含量和外泌体本身的数量，同时，由于血液中的外泌体本身就是组合体，其能够更有效的实现多种功效，且来源简单、广泛，有利于长期、重复、大量的使用。大量的使用。大量的使用。


技术研发人员：陈熹 骆阳 吴舟怡 朱卿 潘金梦 陈骁锐 张辰宇
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2022.01.06
技术公布日：2023/7/22