低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法与流程

1.本发明涉及微生物发酵技术，特别涉及一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法。


背景技术：

2.在工业微生物中，特别是芽孢类微生物在高密度液态发酵过程中，会产生大量的生物大分子——多糖、蛋白质、核酸、脂质、多分子聚合物等，这些物质在发酵过程中积累，会带来发酵液流体状态改变，增加发酵液的粘稠度，从而改变微生物生长环境，包括：营养传递速度变慢、溶氧变低、代谢物从细胞中释放速度变慢，使得微生物生产发酵异常，并进一步恶化发酵液的粘稠体态，导致后续的产物分离困难。
3.在发酵过程中，目前较常用的方式主要是，通过工艺及培养基配方调整来进行发酵体态优化。但工业发酵过程中使用的培养基成分，大部分是豆粕粉、玉米发酵酱、糖蜜等天然物料，物料本身批次间质量波动就较大，导致发酵过程中的粘度难以稳定控制，时常出现反复。同时通过改变发酵工艺例如通氧、搅拌、温度等进行粘度控制，难免会出现以牺牲目标代谢物产量为代价的情况。因此，相比之下，筛选、使用低发酵粘度的芽孢菌，从菌种特性层面出发来根源性解决芽孢菌种发酵粘度较高问题，是一个较优选择。
4.筛选低发酵粘度芽孢菌的过程本质上也是对多种芽孢菌粘度进行评价的过程，目前对于粘度的评价，主要是通过流体法和运动法进行：流体法的测量装置包括毛细管粘度计、落球式粘度计、流出杯粘度计等；运动法的测量装置包括旋转式粘度计、振动式粘度计等。这些粘度测量装置往往操作较为复杂，测量费时较长，样品用量较大，对外界环境要求较高(例如需要控制在同一温度下进行)，同时根据不同粘度特性需要更换不同的粘度头，尽管对于单个或少数发酵样品的检测可实现精确的粘度监控，但对于大量样品的检测却耗时过长、操作过繁。
5.如果使用常见的流体法和运动法来进行菌株发酵粘度评价，则需要微生物在三角瓶这种较大体系培养，且为了保证评价结果的有效性，则每批次只能对数量较少的菌株进行评价，效率低下，难以满足需求，特别是通过菌种选育来实现发酵特性改变的过程中，面临从成百上千甚至上万的诱变菌株中来筛选出低发酵粘度的目标菌株，工作量巨大。
6.有鉴于此，特提出本技术。


技术实现要素：

7.本技术实施例的目的包括提供一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法，采用该方法能够快速实现低发酵粘度的芽孢菌的高通量筛选。
8.本技术的提供一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
9.对芽孢菌进行发酵，制备发酵液；以及，
10.采用自低至高的转速对所述发酵液进行梯度离心，直至分离出的上清液澄清，将分离出澄清的上清液所需的转速记作n
max
，从所述芽孢菌中筛选出n
max
相对其他菌株较低的
菌株作为低发酵粘度的芽孢菌；
11.发酵的条件包括：采用含0.1wt％-0.5wt％硅藻土的发酵培养基，发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为20h-40h；
12.以将芽孢菌菌体从其水悬液中离心出来所需的最低转速ns以及所需的最小离心时间ts为参考，梯度离心的条件包括：n
min
≥ns，t≥ts；其中，n
min
为梯度离心的初始转速，t为采用每一梯度的转速进行离心的时间。
13.在本技术的一些实施方式中，所述发酵液在20℃-30℃条件下放置的时间不超过1h。
14.在本技术的一些实施方式中，所述发酵培养基包含水以及3wt％-6wt％谷物粉、0.5wt％-1.5wt％酵母提取物、0.1wt％-0.3wt％硫酸镁、0.6wt％-1wt％磷酸二氢钾、0.3wt％-0.8wt％氯化钠和0.1wt％-0.5wt％硅藻土。
15.在本技术的一些实施方式中，所述谷物粉选自小麦粉、豆粕粉、玉米淀粉和玉米浆干粉中的一种或者多种。
16.在本技术的一些实施方式中，制备发酵液的步骤包括：
17.将芽孢菌接种至lb培养基中培养，制备种子液；以及，
18.将所述种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，制备发酵液；其中，所述种子液的接种量为0.8％-1.2％(v/v)。
19.在本技术的一些实施方式中，发酵的条件还包括：发酵转速为150rpm-250rpm。
20.在本技术的一些实施方式中，梯度离心中，相邻梯度的转速的差值恒定，采用每一梯度的转速进行离心的时间恒定。
21.在本技术的一些实施方式中，梯度离心中，初始转速为1000rpm-8000rpm，相邻梯度的转速的差值为200-1000，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min-5min。
22.在本技术的一些实施方式中，梯度离心中：
23.起始转速为6000rpm，相邻梯度的转速的差值为1000，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min；或者，
24.起始转速为1200rpm，相邻梯度的转速的差值为400，采用每一梯度的转速进行离心的时间为3min；或者，
25.起始转速为1000rpm，相邻梯度的转速的差值为500，采用每一梯度的转速进行离心的时间为3min；或者，
26.起始转速为8000rpm，相邻梯度的转速的差值为200，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min。
27.在本技术的一些实施方式中，所述芽孢菌包括出发菌株及其诱变株，所述筛选方法包括从所述芽孢菌中筛选出n
max
相对出发菌株较低的诱变株作为低发酵粘度的芽孢菌。
28.相对于传统技术，本技术的有益效果包括：
29.本技术提供一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法，该方法在发酵培养基中添加0.1wt％-0.5wt％硅藻土，接入芽孢菌种后于30℃-35℃发酵20h-40h，后采用自低至高的梯度转速，对制备的发酵液进行离心，直至离心出澄清上清液，并将离心出澄清上清液的离心速度作为衡量芽孢菌粘度的依据，从巧妙地实现了芽孢菌粘度的评价，操作简单，采用该方法能够快速实现低发酵粘度的芽孢菌的高通量筛选(例如能短时时间内检测多达384个样
品)。并且该方法对样品需求量少(例如能在样品量为0.1ml的情况下实现检测)，结果准确，成本低。另外，本技术筛选方法的适用性广，适用于多种发酵条件下制备的芽孢菌发酵液的粘度评价。
附图说明
30.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案、更完整地理解本技术及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为实施例1中不同离心澄清度示例。
具体实施方式
32.下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
33.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
34.术语
35.除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
36.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本技术中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“a及/或b”包括a、b和a+b三种并列方案。又比如，“a，及/或，b，及/或，c，及/或，d”的技术方案，包括a、b、c、d中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括a、b、c、d的任意的和所有的组合，也即包括a、b、c、d中任两项或任三项的组合，还包括a、b、c、d的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
37.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
38.本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整
数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
39.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如
±
5℃、
±
4℃、
±
3℃、
±
2℃、
±
1℃的范围内波动。
40.本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
41.本技术的提供一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
42.对芽孢菌进行发酵，制备发酵液；
43.采用自低至高的转速对所述发酵液进行梯度离心，直至分离出的上清液澄清，将分离出澄清的上清液所需的转速记作n
max
，从所述芽孢菌中筛选出n
max
相对其他菌株较低的菌株作为低发酵粘度的芽孢菌；
44.发酵的条件包括：采用含0.1wt％-0.5wt％硅藻土的发酵培养基，发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为20h-40h；
45.以将芽孢菌菌体从其水悬液中离心出来所需的最低转速ns以及所需的最小离心时间ts为参考，梯度离心的条件包括：n
min
≥ns，t≥ts；其中，n
min
为梯度离心的初始转速，t为采用每一梯度的转速进行离心的时间。
46.可以理解的是，不同芽孢菌对应的ns和ts的可能存在区别，相应地，从不同的芽孢菌中筛选低发酵粘度菌株过程中所采用的n
min
和t有所区别，这些可经预实验确定。
47.梯度离心的过程中，从选定的起始转速开始，离心固定时长后观察上清浑浊程度，若仍浑浊，则以固定差值提高转速，再次离心固定时长后观察上清浑浊程度，以此类推，将上清完全澄清时所用的转速用于评价所检测发酵液样品的相对粘度大小。
48.本技术中所述发酵液指芽孢菌种在液态培养基中发酵所产生的液体。
49.本技术梯度离心是将发酵液置于透明管状容器中进行离心，透明管状容器指离心管、八联管等可透光直视观察上清浑浊程度的透明塑料管状容器，进行对比的发酵液样品使用的容器需相同。
50.可以理解的是，本技术梯度离心的发酵液保持流体状态，相应地，梯度离心是在使发酵液保持流体状态的特定温度下进行，特定温度是发酵液处于流体状态的某一温度，且需统一不同批次发酵液离心时的温度，确保不同批次发酵液间可进行对比。
51.本技术的发酵条件中：发酵培养基中硅藻土的添加量(wt％)例如可以为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5；发酵温度(℃)例如为30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35；发酵时间(h)例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40。
52.在其中一个示例中，所述发酵液在20℃-30℃(例如为20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30)条件下放置的时间不
超过1h(例如为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min)。
53.在添加适量的硅藻土的基础上，本技术对培养基的其他成分以及含量不做特别限定，满足芽孢菌的营养需求即可。在其中一个示例中，所述发酵培养基包含水以及3wt％-6wt％谷物粉(例如为3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％、5.5wt％、6wt％)、0.5wt％-1.5wt％(例如为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％)酵母提取物、0.1wt％-0.3wt％(例如为0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.25wt％、0.3wt％)硫酸镁、0.6wt％-1wt％(例如为0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％)磷酸二氢钾、0.3wt％-0.8wt％(例如为0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％)氯化钠和0.1wt％-0.5wt％(例如为0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.25wt％、0.3wt％、0.35wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％)硅藻土。
54.本技术对谷物粉的种类不做特别限定，例如为小麦粉、豆粕粉、玉米淀粉和玉米浆干粉，可以是一种，也可以是多种混合使用。
55.在其中一个示例中，制备发酵液的步骤包括：
56.将芽孢菌接种至lb培养基中培养，制备种子液；以及，
57.将所述种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，制备发酵液。
58.可以理解的是，在制备种子液的过程中，采用合适的条件(例如温度)、接种适量的种子液即可，在其中一个示例中，所述种子液的接种量为0.8％-1.2％(v/v)，例如为0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％。
59.在其中一个示例中，发酵的条件还包括：发酵转速为150rpm-250rpm，发酵转速(rpm)。例如为150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250。
60.在其中一个示例中，梯度离心中，相邻梯度的转速的差值恒定，采用每一梯度的转速进行离心的时间恒定。本技术的恒定差值，也即固定差值可经预实验确定，固定差值的设定需能够区分不同粘度发酵液，差值越小测量精度越大。本技术中时间恒定，固定时长可经预实验确定，取值一般在1min至5min之间，该时长的设定需能够区分不同粘度发酵液，不能使不同粘度发酵液在低转速下同时被离心至上清完全澄清。
61.在其中一个示例中，梯度离心中，初始转速为1000rpm-8000rpm(例如为1000rpm、1500rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、5000rpm、5500rpm、6000rpm、6500rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm)，相邻梯度的转速的差值为200-1000(200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000)，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min-5min(例如为1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min)。
62.在其中一个示例中，梯度离心中：
63.起始转速为6000rpm，相邻梯度的转速的差值为1000，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min；或者，
64.起始转速为1200rpm，相邻梯度的转速的差值为400，采用每一梯度的转速进行离心的时间为3min；或者，
65.起始转速为1000rpm，相邻梯度的转速的差值为500，采用每一梯度的转速进行离心的时间为3min；或者，
66.起始转速为8000rpm，相邻梯度的转速的差值为200，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min。
67.本技术的筛选方法，可以用于从多种菌株中筛选低发酵粘度的芽孢菌，多种菌株可以均为芽孢菌的野生株，也可以均为野生株的诱变株，亦或是同时包括野生株和诱变株。在其中一个示例中，所述芽孢菌包括出发菌株及其诱变株，所述筛选方法包括从所述芽孢菌中筛选出n
max
相对出发菌株较低的诱变株作为低发酵粘度的芽孢菌。
68.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
69.下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
70.解淀粉芽孢杆菌a、b、c分别为解淀粉芽孢杆菌cicc 20178、解淀粉芽孢杆菌cicc 21746、解淀粉芽孢杆菌cicc 10036。
71.出发菌株为解淀粉芽孢杆菌cicc 22647。
72.实施例1：培养时间优化
73.(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
74.(2)配制发酵培养基分装于500ml三角瓶，每瓶50ml。发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，其余为水。
75.(3)将菌株a、b、c的种子液分别接种至盛有发酵培养基的三角瓶，每个菌株接种3瓶，接种量1％(v/v)。
76.(4)将三角瓶放置于30℃、200rpm孔板摇床培养。从第12h开始每隔4h取样，用以下方法测定发酵液相对粘度：
77.取1ml待测芽孢菌种发酵液于2ml透明圆底带盖塑料离心管。同时将9支装有发酵液的离心管放入离心机，设定温度为25℃。所用离心机为dynamica velocity 15r pro高速冷冻离心机，所用转子型号为fa15m。设置起始转速为6000rpm，离心1min后观察上清浑浊程度，若澄清，则相对粘度等级记为6；若仍浑浊，则将转速提高至7000rpm，再次离心1min后观察上清浑浊程度，若澄清，则相对粘度等级记为7；若仍浑浊，则将转速提高至8000rpm，再次离心1min，以此类推，将上清完全澄清时所用的转速用于评价所检测发酵液样品的相对粘度大小。
78.图1为样品(培养时间为28h，相对粘度等级为9)的不同澄清度示例，左一为未离心发酵液，右一为上清完全澄清样品，从左至右澄清度逐渐提高；图中，从左至右分别为未离心、6000rpm离心、7000rpm离心、8000rpm离心、9000rpm离心。
79.(5)相对粘度测定结果：
80.表1、不同培养时间各菌株发酵液相对粘度等级测定结果
[0081][0082]
根据上述实施例1结果，培养至第12h时菌株a、b、c发酵液相对粘度等级均为6，无法进行区分；培养至第16h时菌株a和菌株b的发酵液相对粘度等级均为6，无法进行区分；培养第20h-40h时，虽然同一菌株发酵液粘度存在一定程度的波动，但根据菌株a、b、c发酵液相对粘度等级的众数可进行区分；培养至第44h，菌株b、c发酵液相对粘度等级的众数均为12，已无法进行区分。因此，确定芽孢菌种发酵液可进行粘度区分的培养时间为20h-40h。
[0083]
实施例2：培养温度优化
[0084]
(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
[0085]
(2)配制发酵培养基分装于500ml三角瓶，每瓶50ml。发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，其余为水。
[0086]
(3)将菌株a、b、c的种子液分别接种至盛有发酵培养基的三角瓶，每个菌株接种27瓶，接种量1％(v/v)。
[0087]
(4)摇床转速为200rpm，培养时间28h，设置不同培养温度：29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。每个温度下均放置菌株a、b、c发酵摇瓶各3瓶。培养结束后用实施例1中方法测定发酵液相对粘度。
[0088]
(5)粘度测定结果显示：培养温度为30-35℃时，不同菌株发酵液间可进行明显的粘度区分；培养温度为29℃时，菌株c的发酵液相对粘度等级为9，但菌株a、b的发酵液相对粘度等级均为7，无法进行区分；培养温度为36-37℃时，菌株a、b、c的发酵液相对粘度等级均为12，无法进行区分。
[0089]
根据上述实施例2结果，确定芽孢菌种发酵液可进行粘度区分的培养温度为30℃-35℃。
[0090]
实施例3：培养基成分优化
[0091]
(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
[0092]
(2)配制不同硅藻土添加量的发酵培养基。发酵培养基基础组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，其余为水。硅藻土添加量：0％、0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％。
[0093]
(3)将菌株a、b、c的种子液分别接种至盛有不同发酵培养基的三角瓶，每个菌株每种培养基接种5瓶，接种量1％(v/v)。
[0094]
(4)将三角瓶放置于30℃、200rpm孔板摇床培养28h，培养结束后用实施例1中方法测定发酵液相对粘度。
[0095]
(5)粘度测量结果显示：添加0.1％-0.5％硅藻土培养基的同一菌株发酵液粘度，5个平行样相对粘度等级一致；而不添加硅藻土或添加量大于0.5％的培养基的同一菌株发酵液粘度，平行样相对粘度等级有波动。此外，添加0.1％-0.5％硅藻土培养基的不同菌株发酵液间仍能进行明显的粘度区分。
[0096]
上述实施例3中结果证明，在发酵培养基中添加0.1％-0.5％硅藻土能够增加发酵稳定性，并实现不同粘度发酵液的稳定区分。
[0097]
实施例4：不同原料培养基中本发明方法适用性
[0098]
(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
[0099]
(2)配制不同原料的发酵培养基。
[0100]
培养基一：小麦粉5％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0101]
培养基二：豆粕4％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0102]
培养基三：玉米淀粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0103]
(3)将菌株a、b、c的种子液分别接种至盛有不同发酵培养基的三角瓶，每个菌株每种培养基接种3瓶，接种量1％(v/v)。
[0104]
(4)将三角瓶放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h。培养结束后用实施例1中方法测定发酵液相对粘度。
[0105]
(5)相对粘度测定结果显示：菌株a的培养基一发酵液相对粘度等级均为7，培养基二发酵液相对粘度等级均为8，培养基三发酵液相对粘度等级均为7；菌株b的培养基一发酵液相对粘度等级均为8，培养基二发酵液相对粘度等级均为9，培养基三发酵液相对粘度等级均为8；菌株c的培养基一发酵液相对粘度等级均为10，培养基二发酵液相对粘度等级均为11，培养基三相对粘度等级均为11。在三种发酵培养基中，均能实现不同粘度发酵液的准确及稳定区分。
[0106]
实施例4表明，本发明在发酵培养基中添加0.1％-0.5％硅藻土、接入芽孢菌种后于30℃-35℃发酵20h-40h的条件下能够实现不同原料培养基发酵液相对粘度的准确评价。
[0107]
实施例5：24孔深孔板培养体系下本发明方法适用性
[0108]
(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
[0109]
(2)配制发酵培养基，发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提
取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0110]
(3)将发酵培养基分装至每孔容积为5ml的方形圆底24孔深孔板，每孔加培养基2ml。
[0111]
(4)将菌株a、b、c的种子液分别接种至不同孔，每个菌株接种8个孔，接种量1％(v/v)。
[0112]
(5)将24孔深孔板放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h。培养结束后用实施例1中方法测定每孔发酵液相对粘度。
[0113]
(6)相对粘度测定结果显示，菌株a的发酵液相对粘度等级均为7，菌株b的发酵液相对粘度等级均为9，菌株c的发酵液相对粘度等级均为11。
[0114]
实施例5表明，24孔深孔板培养体系下本发明方法仍可实现不同粘度发酵液的准确及稳定区分。
[0115]
实施例6：48孔深孔板培养体系下本发明方法适用性
[0116]
(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
[0117]
(2)配制发酵培养基，发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0118]
(3)将发酵培养基分装至每孔容积为4.6ml的方形48孔深孔板，每孔加培养基2ml。
[0119]
(4)将菌株a、b、c的种子液分别接种至不同孔，每个菌株接种16个孔，接种量1％。
[0120]
(5)将48孔深孔板放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h。培养结束后用实施例1中方法测定每孔发酵液相对粘度。
[0121]
(6)相对粘度测定结果显示，菌株a的发酵液相对粘度等级均为7，菌株b的发酵液相对粘度等级均为9，菌株c的发酵液相对粘度等级均为11。
[0122]
实施例6表明，48孔深孔板培养体系下本发明方法仍可实现不同粘度发酵液的准确及稳定区分。
[0123]
实施例7：96孔深孔板培养体系下本发明方法适用性
[0124]
(1)选择已知具有不同发酵粘度特性的解淀粉芽孢杆菌三株(编号分别为a、b、c，发酵粘度：a《b《c)，接种至lb液体培养基活化培养种子液。
[0125]
(2)配制发酵培养基，发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0126]
(3)将发酵培养基分装至每孔容积为2.2ml的方孔圆底96孔深孔板，每孔加培养基0.7ml。
[0127]
(4)将菌株a、b、c的种子液分别接种至不同孔，每个菌株接种32个孔，接种量1％。
[0128]
(5)将96孔深孔板放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h。培养结束后用以下方法测定每孔发酵液相对粘度：
[0129]
于1.2ml圆底深孔板八连管中每管加入0.5ml发酵液样品，盖上盖子，将装有样品的八连管放置于空的96孔深孔板中，分两块板，每块板放置48个样品进行配平。同时将2块96孔深孔板放入离心机，设定温度为25℃。所用离心机为卢湘仪l580r大容量冷冻离心机，所用转子型号为d5b。设置起始转速为1200rpm，离心3min后观察上清浑浊程度，若澄清，则相对粘度等级记为1.2；若仍浑浊，则将转速提高至1600rpm，再次离心3min后观察上清浑浊
程度，若澄清，则相对粘度等级记为1.6；若仍浑浊，则将转速提高至2000rpm，再次离心3min，以此类推，将上清完全澄清时所用的转速用于评价所检测发酵液样品的相对粘度大小。
[0130]
(6)相对粘度测定结果显示，菌株a的发酵液相对粘度等级均为2.0，菌株b的发酵液相对粘度等级均为2.8，菌株c的发酵液相对粘度等级均为3.6。
[0131]
实施例7表明，96孔深孔板培养体系下本发明方法仍可实现不同粘度发酵液的准确及稳定区分。
[0132]
实施例8：筛选低发酵粘度芽孢菌种过程中发酵液相对粘度的高通量检测
[0133]
(1)芽孢菌种出发菌株经诱变后涂布平板培养，分离单菌落，从平板挑取376个不同单菌落接种至lb液体培养基培养种子液，另外将出发菌株接种至lb液体培养基培养种子液。
[0134]
(2)配制发酵培养基，发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0135]
(3)将发酵培养基分装至每孔容积为4.6ml的方形48孔深孔板，每孔加培养基2ml。
[0136]
(4)将培养的不同菌株种子液分别接种至不同孔，出发菌株每块板接种1个孔，其余菌株各接种1个孔，接种量1％(v/v)。接种后的深孔板放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h，获得发酵液。
[0137]
(5)于1.2ml深孔板八连管中每管加入0.6ml芽孢菌种发酵液，盖上盖子，将深孔板八连管放置于96孔深孔板中。
[0138]
(6)同时将4个96孔深孔板共384个发酵液样品放入离心机，设定温度为25℃。所用离心机为卢湘仪l580r大容量冷冻离心机，所用转子型号为d5b。
[0139]
(7)设置起始转速为1200rpm，离心3min，观察每支管中上清的浑浊程度，未发现上清完全澄清的样品。
[0140]
(8)将转速提高至1600rpm，再次离心3min，观察每支管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为1.6。
[0141]
(9)将转速提高至2000rpm，再次离心3min，观察每支管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为2.0。
[0142]
(10)将转速提高至2400rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为2.4。
[0143]
(11).将转速提高至2800rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为2.8。
[0144]
(12)将转速提高至3200rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为3.2。
[0145]
(13)将转速提高至3600rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，剩余所有样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为3.6。
[0146]
(14)出发菌株发酵液相对粘度等级为2.8，发酵液相对粘度等级小于2.8的菌株可作为进一步研究的对象。
[0147]
上述实施例8检测过程总计用时120min。
[0148]
实施例9：筛选低发酵粘度芽孢菌种过程中发酵液相对粘度的高通量检测
[0149]
(1)于0.2ml容积pcr八连管中每管加入0.1ml实施例8中获得的芽孢菌种发酵液，盖上盖子，将八连管放置于96孔管架盒中，盖上盒盖。
[0150]
(2)同时将4个96孔管架盒共384个发酵液样品放入离心机，设定温度为25℃。所用离心机为卢湘仪l580r大容量冷冻离心机，所用转子型号为d5b。
[0151]
(3)设置起始转速为1000rpm，离心3min，观察每支管中上清的浑浊程度，未发现上清完全澄清的样品。
[0152]
(4)将转速提高至1500rpm，再次离心3min，观察每支管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为1.5。
[0153]
(5)将转速提高至2000rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为2.0。
[0154]
(6)将转速提高至2500rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为2.5。
[0155]
(7)将转速提高至3000rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，剩余所有样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为3.0。
[0156]
(8)将转速提高至3500rpm，再次离心3min，观察除相对粘度已记录的样品以外的管中上清的浑浊程度，剩余所有样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为3.5。
[0157]
(9)出发菌株相对粘度等级为3.0，发酵液相对粘度等级小于3.0的菌株可作为进一步研究的对象。
[0158]
上述实施例9检测过程总计用时120min。
[0159]
实施例10：筛选低发酵粘度芽孢菌种过程中发酵液相对粘度的检测
[0160]
(1)从实施例8中选择23个发酵液粘度不同的菌株接种至lb液体培养基培养种子液，另外将实施例8中出发菌株接种至lb液体培养基培养种子液。
[0161]
(2)配制发酵培养基，发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0162]
(3)将发酵培养基分装于500ml三角瓶，每瓶50ml。
[0163]
(4)将培养的24个不同菌株种子液接种至三角瓶，每个菌株接种1瓶，接种量1％(v/v)。
[0164]
(5)将接种后的三角瓶放置于30℃、200rpm摇床培养，培养28h，获得发酵液。
[0165]
(6)取1ml芽孢菌种发酵液于2ml透明圆底带盖塑料离心管。
[0166]
(7)同时将24支装有发酵液的离心管放入离心机，设定温度为25℃。所用离心机为dynamica velocity 15r pro高速冷冻离心机，所用转子型号为fa15m。
[0167]
(8)设置起始转速为6000rpm，离心1min，观察每支离心管中上清的浑浊程度，未发现上清完全澄清的样品。
[0168]
(9)将转速提高至7000rpm，再次离心1min，观察每支离心管中上清的浑浊程度，未发现上清完全澄清的样品。
[0169]
(10)将转速提高至8000rpm，再次离心1min，观察每支离心管中上清的浑浊程度，
部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为8。
[0170]
(11)将转速提高至9000rpm，再次离心1min，观察除相对粘度已记录的样品以外的离心管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为9。
[0171]
(12)将转速提高至10000rpm，再次离心1min，观察除相对粘度已记录的样品以外的离心管中上清的浑浊程度，部分样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为10。
[0172]
(13)将转速提高至12000rpm，再次离心1min，观察除相对粘度已记录的样品以外的离心管中上清的浑浊程度，剩余所有样品上清完全澄清，记录该部分样品的相对粘度等级为11。
[0173]
(14)出发菌株发酵液相对粘度等级为10，发酵液相对粘度等级小于10的菌株可作为进一步研究的对象。
[0174]
上述实施例10检测过程总计用时25min。
[0175]
对比例1：筛选低发酵粘度芽孢菌种过程中发酵液粘度的传统旋转粘度计检测
[0176]
(1)取15ml实施例10中芽孢菌种发酵液于粘度计专用15ml样品杯。
[0177]
(2)将样品杯安装于底座上，插入转子和探头，启动粘度计进行粘度检测。单个样品检测时长为3min。所用粘度计为atago visco便携式数显旋转标准粘度计，所用转子型号为a1。
[0178]
(3)单个样品测量完毕，记录测得的粘度值，清洗转子、探头和样品杯并擦干装回仪器上，该操作用时约2min。
[0179]
(4)重复步骤(1)～(3)进行下一个样品的测量。
[0180]
将实施例8、9、10与对比例1对比：对比例1单个样品检测用量为15ml，样品用量较大；对比例1单个样品检测操作时间约5min，检测24个样品需2h，检测384个样品需32h，检测耗时长，且前后样品检测时间间隔长。
[0181]
实施例8、实施例9、实施例10以及对比例1对菌株粘度的检测结果相一致。
[0182]
实施例11：芽孢菌种发酵液放置时间对粘度的影响
[0183]
(1)取实施例10中测得相对粘度为8的芽孢菌种发酵液1ml于2ml透明圆底带盖塑料离心管，共取8管同样的发酵液。每2管为一组，共分四组。第一组发酵液立即进行粘度检测；第二组发酵液常温放置1h后振荡混匀进行粘度检测；第三组发酵液常温放置2h后振荡混匀进行粘度检测；第四组发酵液常温放置6h后振荡混匀进行粘度检测。
[0184]
(2)粘度检测方法为：将盛有发酵液的离心管放置于离心机中，设置温度25℃，以8000rpm为起始转速，离心1min后观察上清浑浊程度若澄清，则相对粘度等级记为8；若仍浑浊，则将转速提高至8200rpm，再次离心1min后观察上清浑浊程度，若澄清，则相对粘度等级记为8.2；若仍浑浊，则将转速提高至8400rpm，再次离心1min，以此类推，将上清完全澄清时所用的转速用于评价所检测发酵液样品的相对粘度大小。
[0185]
(3)第一组发酵液测得的相对粘度等级为8.4，第二组发酵液测得的相对粘度等级为8.6，第三组发酵液测得的相对粘度等级为9，第四组发酵液测得的相对粘度等级为10。
[0186]
上述实施例11中发酵液样品经常温长时间放置后粘度升高，表明发酵液样品经长时间放置后性质会发生改变。因此同一批样品的检测间隔时间不可过长，同时检测方可保证结果准确性。
[0187]
实施例12：本发明方法在筛选低发酵粘度芽孢菌种中的应用
[0188]
(1)芽孢菌种出发菌株经诱变后涂布平板培养，分离单菌落，从平板挑取380个单菌落接种至lb液体培养基培养种子液，另外将出发菌株接种至lb液体培养基培养种子液。
[0189]
(2)配制发酵培养基，发酵培养基组分(以质量百分比计)：玉米浆干粉3％，酵母提取物1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.5％，硅藻土0.25％，其余为水。
[0190]
(3)将发酵培养基分装至每孔容积为2.2ml的方孔圆底96孔深孔板，每孔加培养基0.7ml，共分装4块96孔深孔板。
[0191]
(4)将培养的不同菌株种子液分别接种至不同孔，出发菌株每块板接种1个孔，其余菌株各接种1个孔，接种量1％(v/v)。
[0192]
(5)将接种后的4块96孔深孔板放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h。培养结束后用以下方法测定每孔发酵液相对粘度：
[0193]
于1.2ml圆底深孔板八连管中每管加入0.5ml发酵液样品，盖上盖子，将装有样品的八连管放置于空的96孔深孔板中。同时将4块96孔深孔板放入离心机，设定温度为25℃。所用离心机为卢湘仪l580r大容量冷冻离心机，所用转子型号为d5b。设置起始转速为1000rpm，离心3min后观察上清浑浊程度，若澄清，则相对粘度等级记为1.0；若仍浑浊，则将转速提高至1300rpm，再次离心3min后观察上清浑浊程度，若澄清，则相对粘度等级记为1.3；若仍浑浊，则将转速提高至1600rpm，再次离心3min，以此类推，将上清完全澄清时所用的转速用于评价所检测发酵液样品的相对粘度大小。
[0194]
(6)出发菌株发酵液相对粘度等级为2.2，选择相对粘度等级小于2.2的86个菌株进行进一步研究验证。
[0195]
(7)将挑选出的86个菌株和出发菌株接种至lb液体培养基培养种子液。将发酵培养基分装至每孔容积为2.2ml的方孔圆底96孔深孔板，每孔加培养基0.7ml，共分装2块96孔深孔板，每块板加87个孔。将培养的不同菌株种子液分别接种至不同孔，出发菌株和其余菌株每板接种1个孔，接种量1％(v/v)。将接种后的2块96孔深孔板放置于30℃、200rpm孔板摇床培养，培养28h。培养结束后用步骤(5)中方法测定每孔发酵液相对粘度。
[0196]
(8)出发菌株发酵液相对粘度等级为2.2，选择相对粘度等级最小(1.3)的7个菌株进行进一步研究验证。
[0197]
(9)将挑出的7个菌株和出发菌株接种至lb液体培养基培养种子液。将发酵培养基分装于500ml三角瓶，每瓶50ml。将培养的不同菌株种子液接种至三角瓶，每个菌株接种3瓶，接种量1％(v/v)。将接种后的三角瓶放置于30℃、200rpm摇床培养，培养28h。培养结束后用实施例1中方法测定每瓶发酵液相对粘度。出发菌株发酵液相对粘度等级为10，挑出的7个菌株相对粘度等级为7或8。
[0198]
(10)使用对比例1中方法测量挑出的7个菌株发酵液粘度，结果见表2。
[0199]
表2、不同检测方法下出发菌株及挑出的7个菌株发酵液粘度检测结果
[0200][0201]
(11)将菌株发酵液相对粘度结合目标产物的产量综合选择出1株相对粘度较低、目标产物产量高的菌株。
[0202]
上述实施例12表明应用本发明方法可以高通量地筛选目标菌株，本发明方法筛选到的低粘度发酵液与传统粘度测量方法结果一致，且本发明方法在不同体系的应用效果一致。
[0203]
整体上，本发明实施例提供了一种低发酵粘度芽孢菌种的高通量筛选方法，该方法能够实现不同培养体系发酵液相对粘度的准确评价，并能够同时检测多达384个样品，需要的样品量少，具有高通量、耗时短、成本低、操作简便、节约样品等优点。
[0204]
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
[0205]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：对芽孢菌进行发酵，制备发酵液；以及，采用自低至高的转速对所述发酵液进行梯度离心，直至分离出的上清液澄清，将分离出澄清的上清液所需的转速记作n
max
，从所述芽孢菌中筛选出n
max
相对其他菌株较低的菌株作为低发酵粘度的芽孢菌；发酵的条件包括：采用含0.1wt％-0.5wt％硅藻土的发酵培养基，发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为20h-40h；以将芽孢菌菌体从其水悬液中离心出来所需的最低转速n
s
以及所需的最小离心时间t
s
为参考，梯度离心的条件包括：n
min
≥n
s
，t≥t
s
；其中，n
min
为梯度离心的初始转速，t为采用每一梯度的转速进行离心的时间。2.根据权利要求1所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述发酵液在20℃-30℃条件下放置的时间不超过1h。3.根据权利要求1所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述发酵培养基包含水以及3wt％-6wt％谷物粉、0.5wt％-1.5wt％酵母提取物、0.1wt％-0.3wt％硫酸镁、0.6wt％-1wt％磷酸二氢钾、0.3wt％-0.8wt％氯化钠和0.1wt％-0.5wt％硅藻土。4.根据权利要求3所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述谷物粉选自小麦粉、豆粕粉、玉米淀粉和玉米浆干粉中的一种或者多种。5.根据权利要求3所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，制备发酵液的步骤包括：将芽孢菌接种至lb培养基中培养，制备种子液；以及，将所述种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，制备发酵液；其中，所述种子液的接种量为0.8％-1.2％(v/v)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，发酵的条件还包括：发酵转速为150rpm-250rpm。7.根据权利要求1至5中任一项所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，梯度离心中，相邻梯度的转速的差值恒定，采用每一梯度的转速进行离心的时间恒定。8.根据权利要求7所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，梯度离心中，初始转速为1000rpm-8000rpm，相邻梯度的转速的差值为200-1000，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min-5min。9.根据权利要求8所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，梯度离心中：起始转速为6000rpm，相邻梯度的转速的差值为1000，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min；或者，起始转速为1200rpm，相邻梯度的转速的差值为400，采用每一梯度的转速进行离心的时间为3min；或者，起始转速为1000rpm，相邻梯度的转速的差值为500，采用每一梯度的转速进行离心的时间为3min；或者，起始转速为8000rpm，相邻梯度的转速的差值为200，采用每一梯度的转速进行离心的时间为1min。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的低发酵粘度的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述芽孢菌包括出发菌株及其诱变株，所述筛选方法包括从所述芽孢菌中筛选出n
max
相对出发菌株较低的诱变株作为低发酵粘度的芽孢菌。

技术总结
本发明涉及一种低发酵粘度的芽孢菌的筛选方法，包括如下步骤：对芽孢菌进行发酵，制备发酵液；采用自低至高的梯度转速对发酵液进行离心，直至分离出的上清液澄清，将分离出澄清的上清液对应的转速记作n


技术研发人员：廖艺楠 周斌 刘翔 周其洋
受保护的技术使用者：佛山市海天（高明）调味食品有限公司 佛山市海天调味食品股份有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/7/22