藿香叶提取物的医药用途

1.本发明属于医药领域，涉及藿香叶提取物的医药用途。


背景技术：

2.流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的rna病毒，属正粘病毒科。流感病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播。根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为四类：甲型流感病毒(influenza a virus)、乙型流感病毒(influenza b virus)、丙型流感病毒(influenza c virus)和丁型流感病毒(influenza d virus)。
3.在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，多次引起世界性大流行，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。甲型流感病毒的高变异性增大了人们应对流行性感冒的难度，人们无法准确预测即将流行的病毒亚型，便不能有针对性地进行预防性疫苗接种；此外，病毒基因组的突变对抗流感病毒药物产生了高水平的耐药性。
4.流感疫苗的免疫原性在老年人和免疫功能低下的受试者等高危人群中通常较低。因此，抗流感药物是治疗季节性流感感染病例的重要选择。目前主要有三类抗流感病毒的药物，分别是神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、拉尼米韦辛酸酯、扎那米韦、帕拉米韦)、m2蛋白抑制剂(金刚烷胺、金刚乙烷)以及帽依赖性核酸内切酶抑制剂(巴洛沙韦)。奥司他韦可以抑制神经氨酸酶活性，阻止成熟的病毒离开宿主细胞。金刚烷胺和金刚乙烷可以抑制流感病毒m2离子通道抑制剂，以阻断病毒的复制。巴洛沙韦可以抑制转录，使病毒mrna无法合成从而阻止病毒复制。除了针对流感病毒的治疗，更多的治疗是针对流感病毒引起的症状，包括非甾体抗炎药等，这些药物能够缓解流感症状但是并不能缩短病程。
5.值得注意的是，目前临床上应用的抗病毒药物的耐药性发生率正在增加，同时其副作用也日益严峻。2005年流感爆发时，由于高抗药性，美国疾病控制与预防中心建议尽量不要使用m2抑制剂。在日本，出于对神经系统副作用的担忧，奥司他韦禁止用于10-19岁的儿童和青少年。
6.藿香为唇形科草本植物广藿香pogostemincablin(blanco)benth.或藿香agastacherugosus(fisch.etmey)o.ktze.的地上部分，为临床常用的芳香化湿类中药。其味辛，性微温，有芳香化湿、和中止呕、发表解暑之功效，用于治疗湿阻中焦，脘痞呕吐，腹痛泄泻，暑湿表证，湿温初起，发热倦怠，具有抗炎、抗菌、调节胃肠道功能等药理作用。藿香常以干燥地上部分入药，除了作为传统中药的处方药物外，也是许多中成药的主要组成药物，如藿香正气水(丸/胶囊)、香砂养胃丸、霍胆丸及抗病毒口服液等。
7.目前尚需要开发新的抗流感病毒药物。


技术实现要素：

8.本发明人根据流感病毒致病特点并结合中药特性，基于体外细胞病毒感染模型，
设计了相应体外抗病毒药效学试验。藿香叶水提物、藿香叶醇提物分别设计100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个剂量，观察其对甲型流感病毒h1n1型致细胞病变，细胞存活率，抑制病毒复制作用，评价其抗病毒药效作用。本发明人惊奇地发现，藿香叶水提物和藿香叶醇提物具有显著的抗流感病毒的作用，细胞毒性较低，具有良好的应用前景。由此提供了下述发明：
9.本发明的一个方面涉及藿香叶或者藿香叶提取物在制备抗流感的药物中的用途。
10.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述藿香叶提取物为藿香叶水提取物或藿香叶乙醇提取物。
11.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述藿香叶水提取物为藿香叶与水经加热回流提取得到的提取物。
12.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述藿香叶水提取物通过包含如下步骤的方法制得：
13.(1)将藿香叶与水按照1g：5-30ml的比例混合，加热回流提取一次或多次(例如2次、3次、4次或5次)；
14.(2)过滤，如果是多次加热回流提取则合并滤液；
15.(3)将滤液浓缩至粘稠状，得到粘稠状产物；
16.优选地，还包括下述步骤：
17.(4)将粘稠状产物进行干燥，得到干燥产物。
18.步骤(3)中的粘稠状产物或者步骤(4)中的干燥产物为藿香叶水提物。
19.优选地，步骤(1)中藿香叶与水的比例为1g：5-20ml、1g：5-15ml、1g：10ml。
20.优选地，步骤(1)中加热回流提取的时间为0.1-5小时、0.2-4小时、0.3-3小时、0.2-2小时、0.5-1.5小时、0.8-1.2小时或者1小时。
21.优选地，所述藿香叶为干燥的藿香叶并经粉碎后过10目筛。
22.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述藿香叶乙醇提取物为藿香叶与乙醇或乙醇溶液经加热回流提取得到的提取物；优选地，所述乙醇溶液为20％-80％的乙醇溶液、30％-70％的乙醇溶液、40％-70％的乙醇溶液、50％-70％的乙醇溶液、55％-65％的乙醇溶液或60％的乙醇溶液。
23.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述藿香叶乙醇提取物通过包含如下步骤的方法制得：
24.(1)将藿香叶与乙醇或者10％-90％的乙醇溶液按照1g：5-30ml的比例混合，加热回流提取一次或多次(例如2次、3次、4次或5次)；
25.(2)过滤，如果是多次加热回流提取则合并滤液；
26.(3)将滤液浓缩至粘稠状，得到粘稠状产物；
27.优选地，还包括下述步骤：
28.(4)将粘稠状产物进行干燥，得到干燥产物。
29.步骤(3)中的粘稠状产物或者步骤(4)中的干燥产物为藿香叶乙醇提取物。
30.优选地，步骤(1)中藿香叶与乙醇或乙醇溶液的比例为1g：5-20ml、1g：5-15ml、1g：10ml。
31.优选地，步骤(1)中的乙醇溶液为20％-80％的乙醇溶液、30％-70％的乙醇溶液、
40％-70％的乙醇溶液、50％-70％的乙醇溶液、55％-65％的乙醇溶液或60％的乙醇溶液。
32.优选地，步骤(1)中加热回流提取的时间为0.1-5小时、0.2-4小时、0.3-3小时、0.2-2小时、0.5-1.5小时、0.8-1.2小时或者1小时。
33.优选地，所述藿香叶为干燥的藿香叶并经粉碎后过10目筛。
34.优选地，所述浓缩为旋蒸浓缩。
35.优选地，所述干燥为真空干燥。
36.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述抗流感为治疗或预防流感。
37.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述抗流感为抑制流感病毒；优选地，所述流感病毒为甲型流感病毒；更优选地，为甲型流感病毒h1n1亚型；特别优选地，为甲型流感病毒h1n1 fm1株或甲型流感病毒h1n1 pr8株。
38.在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，藿香叶或者藿香叶提取物(例如藿香叶水提物或藿香叶乙醇提取物)作为唯一活性成分。
39.本发明的另一方面涉及一种抗流感药物组合物，其包含作为活性成分的藿香叶提取物，以及一种或多种药学上可接受的辅料，例如载体或赋形剂；具体地，其为注射剂、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂或提取物再混合剂型。
40.可采用常规加工方法，制成包含藿香叶提取物和辅料的注射液、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、提取物再混合等剂型。
41.通常本发明药物组合物含有0.1－90重量％的有效成分。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将有效成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
42.本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单
元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。
43.此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
44.本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗流感的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
45.但应认识到，本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的药物组合物以有效成分计算用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于100－2000mg/kg体重/天，例如介于100－1000mg/kg体重/天，例如介于200－500mg/kg体重/天，或者300mg/kg体重/天。
46.在本发明的一些实施方式中，所述的抗流感药物组合物，其中，所述藿香叶提取物为本发明中任一项所述的藿香叶水提物或者本发明中任一项所述的藿香叶乙醇提取物。
47.在本发明的一些实施方式中，所述的抗流感药物组合物，其中，藿香叶或者藿香叶提取物(例如藿香叶水提物或藿香叶乙醇提取物)作为唯一活性成分。
48.本发明中，术语“抑制流感病毒”或“抗流感病毒”是指，包括但不限于以下的一项或者几项：改善流感病毒致细胞病变、提高流感病毒感染宿主细胞存活率、抑制流感病毒复制，等等。
49.本发明中，如果没有特别说明，乙醇的浓度为体积百分比浓度(v/v％)。
50.本发明中，如果没有特别说明，藿香叶是指藿香叶药材或者干燥的藿香叶。
51.发明的有益效果
52.本发明取得了如下技术效果(1)至(4)中的一项或多项：
53.(1)藿香叶水提物和藿香叶醇提物对流感病毒均有显著抑制作用，特别是能够显著改善甲型流感病毒h1n1 fm1株及pr8株致细胞病变，提高病毒感染宿主细胞存活率，有效抑制病毒复制；
54.(2)藿香叶水提物和藿香叶醇提物100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml三个剂量组表现出
较好的量效关系；
55.(3)藿香叶水提物和藿香叶醇提物具有较低的细胞毒性；
56.(4)使用藿香叶提取物的抗流感效果显著优于使用藿香的其它部位(例如地上部分、茎、根或者全株)的提取物的抗流感效果。
附图说明
57.图1a至图1g：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 fm1致mdck细胞病变的影响(代表性图片)。图1a正常对照；图1b模型对照；图1c藿香叶水提物100μg/ml；图1d藿香叶水提物10μg/ml；图1e藿香叶水提物1μg/ml；图1f藿香叶水提物0.1μg/ml；图1g达菲(39.06μg/ml)。
58.图2：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 fm1致mdck细胞存活率的影响。注：药物浓度μg/ml；与模型对照组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01。
59.图3：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 fm1病毒载量的影响。注：药物浓度μg/ml；n＝4；与模型对照组比较，
**
p《0.01。
60.图4a至图4g：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 pr8致a549细胞病变的影响(代表性图片)。图4a正常对照；图4b模型对照；图4c藿香叶水提物100μg/ml；图4d藿香叶水提物10μg/ml；图4e藿香叶水提物1μg/ml；f藿香叶水提物0.1μg/ml；图4g达菲(39.06μg/ml)。
61.图5：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 pr8致a549细胞存活率的影响。注：药物浓度μg/ml；与模型对照组比较，
**
p《0.01。
62.图6：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 pr8病毒载量的影响。注：药物浓度μg/ml；n＝4；与模型对照组比较，
**
p《0.01。
63.图7a至图7g：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 fm1致mdck细胞病变的影响(代表性图片)。图7a正常对照；图7b模型对照；图7c藿香叶醇提物100μg/ml；图7d藿香叶醇提物10μg/ml；图7e藿香叶醇提物1μg/ml；图7f藿香叶醇提物0.1μg/ml；图7g达菲(39.06μg/ml)。
64.图8：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 fm1致mdck细胞存活率的影响。注：药物浓度μg/ml；与模型对照组比较，
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p《0.05，
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p《0.01。
65.图9：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 fm1病毒载量的影响。注：药物浓度μg/ml；n＝4；与模型对照组比较，
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p《0.05，
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p《0.01。
66.图10a至图10g：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 pr8致a549细胞病变的影响(代表性图片)。图10a正常对照；图10b模型对照；图10c藿香叶醇提物100μg/ml；图10d藿香叶醇提物10μg/ml；图10e藿香叶醇提物1μg/ml；图10f藿香叶醇提物0.1μg/ml；图10g达菲(39.06μg/ml)。
67.图11：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 pr8致a549细胞存活率的影响。注：药物浓度μg/ml；与模型对照组比较，
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p《0.01。
68.图12：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 pr8病毒载量的影响。注：药物浓度μg/ml；n＝4；与模型对照组比较，
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p《0.05，
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p《0.01。
69.图13a至图13b：藿香叶水提取物对体外培养mdck细胞的毒性作用(
×
20)。图13a，藿香叶水提物：原液(50mg/ml)；图13b，藿香叶水提物：tc0(1:128)。
70.图14a至图14b：藿香叶水提取物对体外培养a549细胞的毒性作用(
×
20)。图14a，藿香叶水提物：原液(50mg/ml)；图14b，藿香叶水提物：tc0(1:256)。
71.图15a至图15b：藿香叶醇提取物对体外培养mdck细胞的毒性作用(
×
20)。图15a，藿香叶醇提物：原液(50mg/ml)；图15b，藿香叶醇提物：tc0(1:128)。
72.图16a至图16b：藿香叶醇提取物对体外培养a549细胞的毒性作用(
×
20)。图16a，藿香叶醇提物：原液(50mg/ml)；图16b，藿香叶醇提物：tc0(1:256)。
具体实施方式
73.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
74.1.试验材料
75.1.1细胞
76.如下面的表a。
77.表a
[0078][0079]
1.2病毒株
[0080]
如下面的表b。
[0081]
表b
[0082][0083]
1.3试剂
[0084]
如下面的表c。
[0085]
表c
[0086][0087][0088]
1.4仪器
[0089]
如下面的表d。
[0090]
表d
[0091][0092][0093]
1.5受试药物
[0094]
制备例1制得的藿香叶水提物。
[0095]
制备例2制得的藿香叶醇提物。
[0096]
1.6阳性对照药：
[0097]
磷酸奥司他韦胶囊(达菲)，意大利delpharm milano s.r.l.生产，上海罗氏制药
有限公司分装；生产批号：m1066；分装批号：sh0089；规格：75mg/粒，10粒/盒；性状：灰色和淡黄色胶囊，内容物为白色至黄白色粉末；储存条件：25℃以下保存；生产日期：2019.06.05，有效期至：2024.06.04。
[0098]
2.一般实验方法
[0099]
2.1剂量设计
[0100]
藿香叶提取物：藿香叶水提物、藿香叶醇提物，按提取物浸膏计算，分别设置100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个剂量，试验时将提取物浸膏药粉用细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)稀释成相应浓度。
[0101]
达菲：在本实验涉及的细胞上确定其不出现明显病变的最低稀释倍数为最大无毒浓度(tc0)，以tc0及其后2-3个浓度为阳性对照孔的药物浓度。本实验中达菲在mdck、a549细胞上tc0均为78.125μg/ml。
[0102]
2.2统计学分析
[0103]
使用graphpad prism 6.0软件进行数据分析。计量资料以表示，组间差异采用t检验，p《0.05为差异具有统计学意义。
[0104][0105][0106]
制备例1：藿香叶水提物的制备
[0107]
藿香叶药材购自天津市中药饮片有限公司，产地广东。藿香叶经粉碎机粉碎，过10目筛，筛孔内径2mm。
[0108]
制备步骤如下：
[0109]
(1)称取藿香叶800g，按1g藿香叶：10ml纯水的比例，将藿香叶与纯水混合，加热回流提取1h，冷却至室温，过滤；得到滤液
[0110]
(2)重复前面(1)中的操作1次；
[0111]
(3)合并两次提取的滤液，旋蒸浓缩至粘稠状，真空干燥得藿香叶水提物。
[0112]
制备例2：藿香叶醇提物的制备
[0113]
藿香叶药材购自天津市中药饮片有限公司，产地广东。藿香叶经粉碎机粉碎，过10目筛，筛孔内径2mm。
[0114]
制备步骤如下：
[0115]
(1)称取藿香叶800g，按1g藿香叶：10ml乙醇溶液的比例，将藿香叶与体积百分比浓度为60％的乙醇水溶液混合，加热回流提取1h，冷却至室温，过滤；得到滤液
[0116]
(2)重复前面(1)中的操作1次；
[0117]
(3)合并两次提取的滤液，旋蒸浓缩至粘稠状，真空干燥得藿香叶水提物。
[0118]
实施例1：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 fm1株致细胞病变的影响
[0119]
1.实验方法
[0120]
取已长成单层的mdck细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)冲洗细胞面3遍后，接种100tcid
50
甲型流感病毒h1n1 fm1病毒液，100μl/孔，置37℃
5％co2培养箱中吸附2h后，弃去病毒液，分别加入100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个稀释度的藿香叶水提物药液，100μl/孔，每个稀释度药液设4个复孔，同时设如下对照组：
[0121]
正常细胞对照组：只加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔)；设8个复孔；
[0122]
模型对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔；设8个复孔；以及
[0123]
达菲对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入达菲药液，100μl/孔，药物浓度为39.06μg/ml；设8个复孔。
[0124]
将各组细胞置于37℃5％co2培养箱中继续培养，72h后在倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(cck8)，吸取细胞上清液检测病毒载量。
[0125]
致细胞病变效应(cytopathic effect,cpe)：指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。具体而言，体外组织细胞培养时，溶细胞病毒在易感细胞内大量复制增殖导致细胞死亡或细胞出现变圆、脱落、聚集等现象，称为致细胞病变效应。
[0126]
cpe法指根据细胞病变效应进行分级，评价药物改善病毒致细胞病变的程度，以此作为评价药物是否具有体外抗病毒作用。细胞病变按6级标准判断进行分级：
[0127]
－：细胞生长正常，无病变出现；
[0128]
±
：细胞病变少于整个单层的10％；
[0129]
+：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；
[0130]
++：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；
[0131]
+++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；
[0132]
++++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。
[0133]
2.实验结果
[0134]
如表1、图1a至图1g、图2和图3所示。
[0135]
表1：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 fm1致mdck细胞病变的影响(cpe法)
[0136][0137]
注：“/”表示：不加药物干预，仅加细胞维持液；“——”表示：无病变。表1中数字“1、2、3”分别对应细胞病变判断标准“+、++、+++”，“—”对应判断标准
“‑
或
±”
。有几个数字代表这个实验组设置了几个复孔。下同。
[0138]
表1和图1a至图1g的结果显示：甲型流感病毒h1n1 fm1感染mdck细胞72h后，细胞聚集成团，圆缩直至碎裂，坏死脱落等病变。藿香叶水提物干预后，能够明显抑制病毒所致的细胞病变，以100μg/ml、10μg/ml剂量药效最佳，100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml三个剂量表现出良好的量效关系。
[0139]
图2结果显示：甲型流感病毒h1n1 fm1感染mdck细胞72h后，细胞出现明显病变，甚至坏死，活细胞数量减少。藿香叶水提物干预后，细胞存活率升高，100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml三个剂量组与模型对照组比较均有统计学差异(p《0.01或p《0.05)。
[0140]
图3结果显示：mdck细胞感染甲型流感病毒h1n1 fm1后，上清液中病毒载量显著增加，正常对照组未检测到病毒复制(p《0.01)。藿香叶水提物干预72h后，100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与模型对照组比较均有统计学差异(p《0.01)，病毒抑制率分别为62.25％、18.37％、21.81％，达菲组病毒抑制率为90.17％。
[0141]
实施例2：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 pr8株致细胞病变的影响
[0142]
1.实验方法
[0143]
取已长成单层的a549细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)冲洗细胞面3遍后，接种100tcid
50
甲型流感病毒h1n1 pr8病毒液，100μl/孔，置37℃5％co2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个稀释度的藿香叶水提物药液，100μl/孔，每个稀释度药液设4个复孔，同时设如下对照组：
[0144]
正常细胞对照组：只加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔)；设8个复孔；
[0145]
模型对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔；设8个复孔；以及
[0146]
达菲对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入达菲药液，100μl/孔，药物浓度为39.06μg/ml；设8个复孔。
[0147]
将各组细胞置于37℃5％co2培养箱中继续培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(cck8)，吸取细胞上清液检测病毒载量。
[0148]
细胞病变判断标准参照实施例1。
[0149]
2.实验结果
[0150]
如表2、图4a至图4g、图5和图6所示。
[0151]
表2：藿香叶水提物对甲型流感病毒h1n1 pr8致a549细胞病变的影响(cpe法)
[0152][0153]
注：“/”表示：不加药物干预，仅加细胞维持液；“——”表示：无病变。表1中数字“1、2、3”分别对应细胞病变判断标准“+、++、+++”，“—”对应判断标准
“‑
或
±”
。有几个数字代表这个实验组设置了几个复孔。
[0154]
表2、图4a至图4g的结果显示：甲型流感病毒h1n1 pr8感染a549细胞72h后，整个细胞皱缩，变圆直至碎裂，细胞出现大面积坏死脱落等病变，细胞密度降低。藿香叶水提物干预后，100μg/ml、10μg/ml两个剂量组均能够明显抑制病毒所致的细胞病变，且表现出良好的量效关系。
[0155]
图5的结果显示，甲型流感病毒h1n1 pr8感染a549细胞72h后，细胞出现坏死，活细胞数量减少。藿香叶水提物干预后，细胞存活率升高，100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个剂量组与模型对照组比较均有统计学差异(p《0.01)。
[0156]
图6的结果显示，a549细胞感染甲型流感病毒h1n1 pr8后，上清液中病毒载量显著增加，正常对照组未检测到病毒复制(p《0.01)。藿香叶水提物干预72h后，100μg/ml、10μg/ml剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与模型对照组比较均有显著性差异(p《0.01或p《0.05)，病毒抑制率分别为29.37％、8.91％，达菲组病毒抑制率为35.64％。
[0157]
实施例3：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 fm1株致细胞病变的影响
[0158]
1.实验方法
[0159]
取已长成单层的mdck细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)冲洗细胞面3遍后，接种100tcid
50
甲型流感病毒h1n1 fm1病毒液，100μl/孔，置37℃5％co2培养箱中吸附2h后，弃去病毒液，分别加入100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个稀释度的藿香叶醇提物药液，100μl/孔，每个稀释度药液设4个复孔，同时设如下对照组：
[0160]
正常细胞对照组：只加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔)；设8个复孔；
[0161]
模型对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔；设8个复孔；以及
[0162]
达菲对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入达菲药液，100μl/孔，药物浓度为39.06μg/ml；设8个复孔。
[0163]
将各组细胞置于37℃5％co2培养箱中继续培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病
变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(cck8)，吸取细胞上清液检测病毒载量。
[0164]
细胞病变判断标准参照实施例1。
[0165]
2.实验结果
[0166]
如表3、图7a至图7g、图8和图9所示。
[0167]
表3：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 fm1致mdck细胞病变的影响(cpe法)
[0168][0169]
注：“/”表示：不加药物干预，仅加细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)；“——”表示：无病变。表1中数字“1、2、3”分别对应细胞病变判断标准“+、++、+++”，“—”对应判断标准
“‑
或
±”
。有几个数字代表这个实验组设置了几个复孔。
[0170]
表3、图7a至图7g的结果显示：甲型流感病毒h1n1 fm1感染mdck细胞72h后，细胞聚集成团，圆缩直至碎裂，坏死脱落等病变。藿香叶醇提物干预后，可以明显抑制病毒所致的细胞病变，以100、10、1μg/ml剂量药效佳，100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml三个剂量表现出良好的量效关系。
[0171]
图8的结果显示：甲型流感病毒h1n1 fm1感染mdck细胞72h后，细胞出现明显病变，甚至坏死，活细胞数量减少。藿香叶醇提物干预后，细胞存活率升高，100μg/ml、10μg/ml剂量组与模型对照组比较均有统计学差异(p《0.01或p《0.05)。
[0172]
图9的结果显示：mdck细胞感染甲型流感病毒h1n1 fm1后，上清液中病毒载量显著增加，正常对照组未检测到病毒复制(p《0.01)。藿香叶醇提物干预72h后，100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与模型对照组比较均有统计学差异(p《0.01或p《0.05)，病毒抑制率分别为57.34％、8.48％、27.56％，达菲组病毒抑制率为90.17％。
[0173]
实施例4：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 pr8株致细胞病变的影响
[0174]
1.实验方法
[0175]
取已长成单层的a549细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)冲洗细胞面3遍后，接种100tcid
50
甲型流感病毒h1n1 pr8病毒液，100μl/孔，置37℃5％co2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml四个稀释度的藿香叶醇提物药液，100μl/孔，每个稀释度药液设4个复孔，同时设如下对照组：
[0176]
正常细胞对照组：只加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔)；设8个复孔；
[0177]
模型对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入与加药组等体积的细胞维持液，100μl/孔；设8个复孔；以及
[0178]
达菲对照组：加病毒感染细胞，病毒吸附2小时后，加入达菲药液，100μl/孔，药物浓度为39.06μg/ml；设8个复孔。
[0179]
将各组细胞置于37℃5％co2培养箱中继续培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(cck8)，吸取细胞上清液检测病毒载量。
[0180]
细胞病变判断标准参照实施例1。
[0181]
2.实验结果
[0182]
如表4、图10a至图10g、图11和图12所示。
[0183]
表4：藿香叶醇提物对甲型流感病毒h1n1 pr8致a549细胞病变的影响(cpe法)
[0184][0185]
注：“/”表示：不加药物干预，仅加细胞维持液(2％胎牛血清+dmem培养基)；“——”表示：无病变。表1中数字“1、2、3”分别对应细胞病变判断标准“+、++、+++”，“—”对应判断标准
“‑
或
±”
。有几个数字代表这个实验组设置了几个复孔。
[0186]
表4、图10a至图10g的结果显示：甲型流感病毒h1n1 pr8感染a549细胞72h后，整个细胞皱缩，变圆直至碎裂，细胞出现大面积坏死脱落等病变，细胞密度降低。藿香叶醇提物干预后，100μg/ml、10μg/ml两个剂量组均可以明显抑制病毒所致细胞病变，且表现出良好的量效关系。
[0187]
图11的结果显示：甲型流感病毒h1n1 pr8感染a549细胞72h后，细胞出现大量坏死，活细胞数量减少。藿香叶醇提物干预后，细胞存活率升高，100、10、1μg/ml三个剂量组与模型对照组比较均有统计学差异(p《0.01)。
[0188]
图12的结果显示：a549细胞感染甲型流感病毒h1n1 pr8后，上清液中病毒载量显著增加，正常对照组未检测到病毒复制(p《0.01)。藿香叶醇提物干预72h后，100μg/ml、1μg/ml剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与模型对照组比较均有显著性差异(p《0.01或p《0.05)，10μg/ml剂量组细胞上清液中病毒载量有降低趋势，与模型对照组比较均无统计学差异(p》0.05)。藿香叶醇提物100、1μg/ml两个剂量组病毒抑制率分别为16.37％、9.64％，
达菲组病毒抑制率为35.64％。
[0189]
上述实施例1至实施例4的实验结果表明，藿香叶水提物和藿香叶醇提物对流感病毒均有显著抑制作用，能够显著改善甲型流感病毒h1n1 fm1株及pr8株致细胞病变，提高病毒感染宿主细胞存活率，有效抑制病毒复制，且100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml三个剂量组表现出较好的量效关系。可见，藿香叶水提物和藿香叶醇提物对流感病毒有显著抗病毒作用，水提物与醇提物有效性相差不大，均有特别显著的药效作用，具有良好的应用前景。
[0190]
实施例5：细胞毒性试验
[0191]
1.实验方法
[0192]
将受试药物(藿香叶水提物、藿香叶醇提物原始浓度均为50mg/ml)用培养液做(1:2)至(1:2048)倍比稀释后，加到已长成单层的mdck、a549细胞培养板(96孔)中，100μl/孔，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照组(无病毒且不加药，4个孔)。将培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数为最大无毒浓度(tc0)，按reed-muench法计算50％细胞毒性浓度(tc
50
)。
[0193]
2.实验结果
[0194]
如图13a至图16b所示。
[0195]
结果显示，藿香叶水提物及藿香叶醇提物作用于细胞72h后，在mdck细胞上tc0为390.63μg/ml，tc
50
为561.01μg/ml；在a549细胞上tc0为195.31μg/ml，tc
50
为281.17μg/ml。说明藿香叶水提物和藿香叶醇提物对mdck(nbl-2)、a549细胞表现出低细胞毒性。
[0196]
藿香叶水提物和藿香叶醇提物在mdck及a549细胞上均表现出低细胞毒性，tc0在195.31～390.63μg/ml之间，tc
50
在281.17～561.01μg/ml之间。目前已有报道，达菲在a549、mdck细胞上tc0均为78.125μg/ml，tc
50
均为140.92μg/ml。可见，本发明的藿香叶水提物和藿香叶醇提物具有更低的细胞毒性。
[0197]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

技术特征：
1.藿香叶或者藿香叶提取物在制备抗流感的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述藿香叶提取物为藿香叶水提取物或藿香叶乙醇提取物。3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述藿香叶水提取物为藿香叶与水经加热回流提取得到的提取物。4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述藿香叶水提取物通过包含如下步骤的方法制得：(1)将藿香叶与水按照1g：5-30ml的比例混合，加热回流提取一次或多次；(2)过滤，如果是多次加热回流提取则合并滤液；(3)将滤液浓缩至粘稠状，得到粘稠状产物；优选地，还包括下述步骤：(4)将粘稠状产物进行干燥，得到干燥产物。5.根据权利要求2所述的用途，其中，所述藿香叶乙醇提取物为藿香叶与乙醇或乙醇溶液经加热回流提取得到的提取物。6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述藿香叶乙醇提取物通过包含如下步骤的方法制得：(1)将藿香叶与乙醇或者10％-90％的乙醇溶液按照1g：5-30ml的比例混合，加热回流提取一次或多次；(2)过滤，如果是多次加热回流提取则合并滤液；(3)将滤液浓缩至粘稠状，得到粘稠状产物；优选地，还包括下述步骤：(4)将粘稠状产物进行干燥，得到干燥产物。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的用途，其中，所述抗流感为治疗或预防流感。8.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的用途，其中，所述抗流感为抑制流感病毒；优选地，所述流感病毒为甲型流感病毒；更优选地，为甲型流感病毒h1n1亚型；特别优选地，为甲型流感病毒h1n1 fm1株或甲型流感病毒h1n1 pr8株。9.一种抗流感药物组合物，其包含作为活性成分的藿香叶提取物，以及一种或多种药学上可接受的辅料。10.根据权利要求9所述的抗流感药物组合物，其中，所述藿香叶提取物为权利要求3至4中任一权利要求所述的藿香叶水提物或者权利要求5至6中任一权利要求所述的藿香叶乙醇提取物。

技术总结
本发明属于医药领域，涉及藿香叶提取物的医药用途。具体地，本发明涉及藿香叶提取物在制备抗流感的药物中的用途。藿香叶提取物具有显著的抗流感病毒的作用，细胞毒性较低，具有良好的应用前景。良好的应用前景。良好的应用前景。


技术研发人员：高秀梅 姚荣妹 何俊 王小莹 吕彬 刘二伟 王涛 韩立峰 刘志东
受保护的技术使用者：天津中医药大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/22