一种促进植物根系发育的小肽及其应用

1.本发明属于农业科学技术和生物肥料学领域，具体涉及一种促进植物根系发育的小肽及其应用。


背景技术：

2.我国农业生产上由于化肥的过量施用导致了田间环境污染及食品安全危害等问题，造成可耕种土壤质量的持续降低，影响土壤未来的耕种潜力。生物肥料作为传统化肥的替代和补充品，在我国化肥增效减施、土壤肥力优化、农作物提质增产和矿质资源高效利用方面发挥了不可或缺的作用。
3.伴随新兴生物肥料的发展与推广，以微生物代谢物为基础的新型生物肥料日益受到国内外的关注。其中所应用的微生物代谢物主要分为两类：一是以生长素(iaa)、细胞分裂素(ctk)、脱落酸(aba)及赤霉素(ga)等为主的植物激素类物质；二是以生物活性蛋白质和生物活性多肽为主的蛋白类物质。而生物活性多肽作为五大植物激素以外的又一新型植物生长调节物质，在自然环境中对人、畜无毒无害，不污染环境；在植物的生长发育中，多肽优化了植物根系的构型，提高了作物的产量，改善了作物的品质，增强了作物自身的免疫力，提高了肥料的利用率。
4.短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)作为优异的生物肥料资源在自然界中分布广泛，繁殖能力强，对田间的极端环境胁迫有很强的拮抗能力。研究表明芽孢杆菌具有广谱的促生活性，且生长速度快，稳定性强，同时能分泌多种植物促生活性物质，如吲哚乙酸(iaa)，细胞分裂素(ctk)和挥发类有机物(vocs)等。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种由短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)发酵产生的促进植物根系发育的小肽，是一种植物根系发育促生肽(root development promoting peptide，简称rdpp)。
6.本发明的另一目的在于提供上述植物根系发育促生肽rdpp的提取分离方法。
7.本发明的又一目的在于提供上述植物根系发育促生肽rdpp的应用。
8.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
9.一种促进植物根系发育的小肽，该小肽的氨基酸序列为glu-pro-asp-ser-glu-glu-glu-pro-lys-glu-pro-glu-ala-ile。该小肽是一种来自芽孢杆菌的新型植物根系发育促生肽rdpp。
10.本发明提供的小肽序列编码也在本发明的保护范围。
11.一种促进植物根系发育的小肽的提取分离方法，发酵培养短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)并收集发酵液的上清液，所述的上清液经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后冷冻干燥，用去离子水对冻干粉或浸膏溶解重悬浓缩，采用1kda～2kda分子截流量的透析袋对浓缩液进行分离，对透析液使用hplc进行除杂，分离纯化得到促进植物根系发
育的小肽。体外人工合成验证显示其具备较强的植物促生活性。
12.作为一种优选技术方案，所述sephadex lh-20凝胶色谱柱层析的洗脱液是体积比为9:1的水-甲醇。
13.作为一种优选技术方案，经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后的活性物质冷冻干燥40～55h。
14.本发明的实验过程中：将上清液经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析，洗脱液采用水和甲醇的不同比例混合(水：甲醇＝9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，v:v)，将经过sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后的洗脱液(水：甲醇＝9:1，8:2，7:3，6:4，5:5)，通过活性追踪的方法，明确活物质所在洗脱液的区段(水：甲醇＝9:1)；将含有活性物质的区段冷冻干燥48h，冷冻干燥后的冻干粉或浸膏用ddh2o溶解浓缩；将浓缩液用100～500da、1kda、2kda、5kda和10kda分子截留量的透析袋对不同分子量大小的物质进行分段，透析基质采用ddh2o。明确活物质所在的区段(1000-2000da)，对1000-2000da截流区段的活性透析液使用hplc对透析袋分段得到的活性物质进行除杂，最后得到所述的植物根系发育促生肽rdpp的纯品。
15.作为一种优选技术方案，发酵培养短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)的发酵培养基为msgg培养基。
16.作为一种优选技术方案，所述短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)的发酵培养方法为：按1％的接种量将短小芽孢杆菌种子液转接到新鲜msgg培养基中，37℃，170rpm条件下发酵36h。进一步优选的：将发酵液在收集离心桶中，在10000rpm，20min条件下离心收集上清液。
17.上述的小肽在促进植物生长发育或促进植物根系发育中的应用。
18.上述的小肽在制备促进植物生长发育的制剂中的应用。
19.所述的植物为模式植物，如拟南芥；粮食作物，如大豆、玉米或水稻；或叶菜类作物，如番茄。
20.本发明的小肽是一种植物根系发育促生肽(root development promoting peptide,简称rdpp)，其中rdpp作为有效成分，在植物生长中最适施用浓度为0.03μm～10μm，根据植物的品系、植株的不同生长阶段、采用不同的施用方式和浓度，rdpp可用于农作物根系或栽培介质，显著促进作物的生长，增加作物田间产量。
21.本发明的有益效果：
22.本技术从短小芽孢杆菌中分离并纯化出一种分子量大小为1598da的植物根系发育促肽rdpp，摸索了rdpp发酵最适培养基，发酵条件及分离方法，鉴定出rdpp的氨基酸序列；通过对模式植物拟南芥生长发育的促生试验，验证了rdpp的活性。通过水培、盆栽和田间试验明确，rdpp对大豆、玉米和水稻等粮食作物，番茄等叶菜类作物具有广谱的促生长效果，显著提高农作物的产量。
附图说明
23.图1为rdpp对半固体培养拟南芥的促生效果图。
24.图2为rdpp对水培拟南芥的促生效果图。
25.图3为rdpp对无菌土培拟南芥的促生效果图。
26.图4为rdpp对半固体培养玉米的促生效果图。
27.图5为rdpp对水培玉米的促生效果图。
28.图6为rdpp对盆栽玉米的促生效果图。
29.图7为rdpp对田间拔节期玉米的促生效果图。
30.图8为rdpp对半固体培养水稻的促生效果图。
31.具体实施方法
32.本发明公开了一种植物根系发育促生肽rdpp，本领域技术人员根据本发明公开的内容，采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化梗概的，都落入本发明的保护范围。为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例子对本发明作进一步的详细说明。
33.本发明所述的植物根系发育促生肽rdpp可通过化学合成方式获得，也可以通过对短小芽孢杆菌的发酵液进行分离提纯获得。
34.实施例1：
35.按1％(v/v)的接种量将短小芽孢杆菌wh4(为常见市售菌株)种子液转接到装有400ml新鲜msgg培养基的锥形瓶中，在37℃，170rpm条件下发酵36h。将发酵液在收集离心桶中，在10000rpm，20min条件下离心收集上清液。将上清液经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析，洗脱液采用水和甲醇的不同比例混合，将经过sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后的洗脱液(水：甲醇＝9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，v/v)，混匀在1/2ms半固体培养基内，并将长势一至的野生型拟南芥幼苗(7天龄)，移栽于固体培养基表面，经过五天的培育后测量拟南芥根系发育指标，明确活物质所在洗脱液的区段(水：甲醇＝9:1)；将含有活性物质的区段冷冻干燥48h，冷冻干燥后的冻干粉或浸膏用ddh2o溶解重悬浓缩；将浓缩液用100～500da、1kda、2kda、5kda和10kda分子截留量的透析袋对不同分子量大小的物质进行分段，透析基质采用ddh2o。将分段后的透析液按统一比例进行浓缩，并混匀在1/2ms半固体培养基内，并将长势一至的野生型拟南芥幼苗(7天龄)，移栽于固体培养基表面，经过五天的培育后测量拟南芥根系发育指标，明确活物质所在的区段(1000-2000da)，对1000-2000da截流区段的活性透析液进行nano-hplc-ms质谱检测，分离纯化得到含有14个氨基酸的促进植物根系发育的小肽。
36.最终筛选的促进植物根系发育小肽的提取分离方法为：发酵培养短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)并离心收集发酵液的上清液，所述的上清液经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析，洗脱液采用水：甲醇＝9:1；将经过sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后的洗脱液冷冻干燥48h，用去离子水对冻干粉或浸膏溶解重悬浓缩，采用1kda～2kda分子截流量的透析袋对浓缩液进行分离，使用hplc对透析袋透析得到的活性物质进行除杂，最后得到所述的植物根系发育促生肽rdpp的纯品。
37.实施例2：
38.验证本发明所述的植物根系发育促生肽rdpp对模式双子叶植物拟南芥的促生效果：
39.1.拟南芥的半固体培养试验：
40.拟南芥种子表面消毒：将拟南芥种子至于75％(v/v)的无水乙醇中，浸泡4～5钟，用去离子水清洗4～5次，然后置于2％(v/v)次氯酸钠中，浸泡4～5分钟。用去离子水清洗4～5次，去除清洗液后备用。
41.拟南芥播种：将拟南芥种子点播在1/2ms培养基表面，4℃低温春花三天后放置光照培养箱内。培养条件：温度22/18℃，光周期(16h光/8h暗)，光照强度为150μmol/m2/s，湿度55％～70％。
42.rdpp准备：将rdpp用去离子水稀释到1μm、3μm和10μm的终浓度，并均匀的涂布于1/2ms固体无菌培养基上。
43.rdpp处理拟南芥：挑选长势一致的7天龄拟南芥幼苗，移栽于涂布不同浓度rdpp的1/2ms固体培养基上为处理组，涂布有双蒸水的1/2ms固体培养基作为对照组。五天后测量各组拟南芥生理指标。
44.结果见图1和表1，与对照组相比，rdpp对拟南芥的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp终浓度为3μm时，促生效果最佳，根长增加了23.9％，侧根数增加了121.4％，侧根密度增加了78.9％。
45.表1组培中不同浓度rdpp对拟南芥根系发育的影响
[0046][0047]
2.拟南芥水培实验：
[0048]
拟南芥种子表面消毒：按上述方法。
[0049]
拟南芥播种：按上述方法。
[0050]
rdpp准备：将rdpp用液体1/2ms(不含蔗糖)稀释到1μm、3μm和10μm的终浓度，均匀的加入12孔板中(每孔1ml)。
[0051]
rdpp处理拟南芥：挑选长势一致的7天龄拟南芥幼苗，移栽于装有不同浓度rdpp的1/2ms液体培养基(不含蔗糖)为处理组，不含rdpp的1/2ms液体培养基(不含蔗糖)为对照组。六天后测量各组拟南芥生理指标。
[0052]
结果见图2和表2，与对照组相比，rdpp对拟南芥的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp终浓度为3μm时，促生效果最佳，根长增加了51.3％，侧根数增加了248.6％，侧根密度增加了134.9％。
[0053]
表2水培中不同浓度rdpp对拟南芥根系发育的影响
[0054][0055]
3.拟南芥无菌土培实验：
[0056]
拟南芥种子表面消毒：按上述方法。
[0057]
拟南芥播种：按上述方法。
[0058]
rdpp准备：将rdpp用液体1/2ms(不含蔗糖)稀释到3μm的终浓度，均匀的加入无菌土中。
[0059]
rdpp处理拟南芥：挑选长势一致的7天龄拟南芥幼苗，移栽于装有rdpp的无菌土中为处理组，不含rdpp的无菌土为对照组。六天后测量各组拟南芥生理指标。
[0060]
结果见图3和表3，与对照组相比，rdpp对拟南芥的生长发育起到显著的促进作用，当生物活性小肽浓度为3μm时，根长增加了50.4％，侧根数增加了197.09％，侧根密度增加了101.8％，根鲜重增加了170.4％
[0061]
表3无菌土培中rdpp对拟南芥根系发育的影响
[0062][0063]
实施例3：
[0064]
验证本发明所述的植物根系发育促生肽rdpp对双子叶番茄的促生效果：
[0065]
番茄田间培养实验
[0066]
番茄品种的选择：田间番茄种植的品种，优选耐低温、优良的抗病性、商品性良好的品种如合作903。
[0067]
番茄幼苗的准备：番茄播种前，将种子放置于阳光下干晒2～3天，完全去除水分后将种子浸没于去离子水中5～6小时，将浸泡好的种子用湿纱布包裹好，置于30℃培养箱内，每12h更换一次去离子水，待半数以上的种子露白后即可进行播种。育苗基质为购置的营养土，将营养土装入育苗穴盘，每穴播种两粒种子，播种后将育苗穴盘上覆盖一层保鲜膜，以作保湿和保温之用，将处理好的育苗穴盘均匀摆放于温室内，日间28℃夜间18℃，待种子出芽后将保鲜膜去除。
[0068]
番茄幼苗的移栽：试验地设在江苏省农业科学院试验田，耕种田块的选择避免茄科类连作土壤，番茄幼苗移栽前，对田间小区土壤进行深耕，翻耕深度约30cm即可，将整个田间小区划分两大区，为施肥区(当地常规施肥量)和非施肥区，在施肥区和非施肥区内各设置三个小区：对照小区和两个多肽浓度处理小区。划分后平整田块、起垄作畦，对番茄幼苗3～5叶期进行移栽，每块小区四垄，栽种行距约40～50cm、栽种株距约为30～40cm。
[0069]
rdpp的准备：将小肽溶解于去离子水中，配置为终浓度为300μm的母液备用，待移栽前用清水将母液稀释至3μm和0.3μm。
[0070]
rdpp处理番茄幼苗：番茄幼苗移栽后将稀释好多肽溶液浇灌于其根部，利于生物活性小肽及时作用于幼苗的生长。并分别于移栽前、移栽后和番茄花期测量植株的各项生理指标。
[0071]
结果见表4，rdpp对番茄的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp施用浓度为3μm时，非施肥区：相比对照组株高增加了30.1％，根长增加了23.1％，茎粗增加了20.4％，叶绿素值增加了8.9％，地上部根鲜重增加了47.3％，地上部干重增加了46.7％，根鲜重增加了
59.1％，根干重增加了56.7％。
[0072]
表4田间试验中rdpp对番茄生长发育的影响
[0073][0074][0075]
实施例4：
[0076]
验证本发明所述的植物根系发育促生肽rdpp对双子叶大豆的促生效果：
[0077]
大豆田间培养实验：
[0078]
大豆品种的选择：田间大豆种植品种优选：优良的发芽率、抗病性、成柱性、耐寒、耐涝以及高产等特性如中黄37。
[0079]
大豆播种的准备：试验地设在江苏省农业科学院试验田，首先对田间小区进行除草和深耕，将整个田间小区划分三个小区：对照小区和两个多肽处理小区；大豆为高需水作物，需提升生长周期中的灌溉频率，确保各时期的灌溉量，提升田间大豆的出苗率。
[0080]
大豆的种植：大豆的种植方式采取直播式和密植式种植，以确保大豆的出苗率和田间产量。栽种行距约40～50cm、栽种株距约为40～50cm，增加大豆营养吸收的供给。待种植7天后对大豆进行补苗和除杂，保证大豆的生长间距及优良苗株的生长环境。
[0081]
rdpp的准备：将小肽溶解于去离子水中，配置为终浓度为300μm的母液备用，待移栽前用清水将母液稀释至3μm和0.3μm。
[0082]
生物活性肽处理大豆幼苗：大豆出苗后至大豆3～5叶期间，将稀释好的小肽溶液浇灌于其根部，利于生物活性多肽及时作用于幼苗的生长。并于大豆苗期进行破坏性取样，测量大豆植株的各项生理指标。
[0083]
结果见表5，移栽前与对照组相比，rdpp对大豆的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp施用浓度为3μm时，相比对照组株高增加了9.3％，叶绿素值增加了7.9％，地上部根鲜重增加了36.3％，地上部干重增加了35.8％，根鲜重增加了21.9％，根干重增加了2.6％。
[0084]
表5田间试验中rdpp对大豆生长发育的影响
[0085][0086]
实施例5：
[0087]
验证本发明所述的植物根系发育促生肽rdpp对单子叶玉米的促生效果：
[0088]
1.玉米半固体培养试验：
[0089]
玉米种子的选取：选取高产抗病的优良品种郑单958。
[0090]
玉米种子表面消毒：挑选大小一致的玉米种子至于75％的无水乙醇中，泡2～3分钟，用去离子水清洗4～5次，然后置于1％次氯酸钠中，浸泡20分钟。用去离子水清洗4～5次，去除清洗液后备用。
[0091]
玉米播种：将玉米种子点播在1/2ms固体培养基表面，放置于30℃培养箱内，暗培养72h后观察玉米萌发情况。
[0092]
rdpp准备：将rdpp用去离子水稀释到0.1μm、0.3μm和1μm的终浓度，并均匀的涂布于1/2ms固体无菌培养基上。
[0093]
rdpp处理玉米：挑选萌发一致的玉米幼苗，移栽于涂布不同浓度rdpp的1/2ms固体培养基上为处理组，涂布有双蒸水的1/2ms固体培养基作为对照组。4天后测量各组玉米生理指标。
[0094]
结果见图4和表6，与对照组相比，rdpp对玉米的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp终浓度为0.3μm时，对侧根的促生效果最佳，增加了115.64％；当生物活性多肽终浓度为1μm时，对种子根的促生效果最佳，增加了增加了63.03％。
[0095]
表6组培实验中rdpp对玉米生长发育的影响
[0096][0097]
2.玉米水培试验：
[0098]
玉米种子的表面消毒：按上述方法。
[0099]
玉米的播种：按上述方法。
[0100]
玉米的育苗：挑选长势一致的玉米幼苗，移栽至装有100ml的1/2ms半固体培养基的组培瓶中培养48h。
[0101]
rdpp准备：将rdpp用1/2ms液体稀释到0.003μm、0.03μm和0.3μm的终浓度，分装至50ml的锥形瓶中(每瓶20ml多肽稀释液)备用。
[0102]
rdpp处理玉米：挑选萌发一致的玉米幼苗，从组培瓶移栽于装有不同浓度rdpp的1/2ms液体培养基内，并标记为处理组，只装有1/2ms液体培养基作为对照组。5天后测量各组玉米生理指标。
[0103]
结果见图5和表7，与对照组相比，rdpp对玉米的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp终浓度为0.3μm时，株高增加了30.7％，根长增加了27.1％，茎粗增加了38.5％，地上部鲜重增加了70.1％，地上部干重增加了144.4％，根鲜重增加了209.8％，根干重增加了235.7％。
[0104]
表7水培实验中rdpp对玉米生长发育的影响
[0105][0106]
[0107]
3.玉米盆栽培养试验：
[0108]
玉米种子的表面消毒：按上述方法。
[0109]
玉米的播种：按上述方法。
[0110]
玉米的育苗：挑选长势一致的玉米幼苗，移栽至装有100ml的1/2ms半固体培养基的组培瓶中培养48h。
[0111]
供试土壤：供试土壤为南京汤山贫瘠荒地土，选取大田20～40cm的耕层土，经自然风干、磨细、过5mm；将过筛后的风干土壤装至pvc花盆中，上口径16cm、底部内径12cm、高11.5cm，桶底均匀分布5～8个小孔，桶底铺有纱网，以保证良好的透水通气条件。
[0112]
rdpp准备：将rdpp用去离子水稀释到0.003μm、0.03μm和0.3μm的终浓度备用。
[0113]
rdpp处理玉米：挑选长势一致的玉米幼苗，移栽于含水量充足的供试土壤中，将稀释后的rdpp溶液浇灌于玉米幼苗根部，并标记为处理组，浇灌去离子水的作为对照组。并放置于阳光房内，种植期间保证充足的光照时间、光照强度、浇灌频率，21天后测量各组玉米生理指标。
[0114]
结果见图6和表8，与对照组相比，rdpp对玉米的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp终浓度为0.3μm时，株高增加了30.7％，茎粗增加了38.5％，地上部干重增加了144.4％，根干重增加了235.7％。
[0115]
表8盆栽实验中rdpp对玉米生长发育的影响
[0116][0117]
4.玉米田间培养试验：
[0118]
玉米播种的准备：试验地设在江苏省农业科学院试验田，种植前对土壤进行深耕，增加土壤的肥沃度和透气度，以供玉米幼苗正常生长；将整个田间小区划分两大区，为施肥区(当地常规施肥量)和非施肥区，在施肥区和非施肥区内各设置三个小区：对照小区和两个多肽浓度处理小区。
[0119]
玉米的播种：将玉米种子直播于划分好的小区内，种植行距80cm、株距25cm。
[0120]
rdpp的准备：将小肽溶解于去离子水中，配置终浓度为300μm的母液备用，多肽处理前用清水将母液稀释至3μm和0.3μm。
[0121]
rdpp处理玉米：田间管理后，待玉米株高约为25cm时添加多肽，之后每隔7天添加一次多肽，共添加三次，并分别于苗期、拔节期和喇叭口期进行破坏性取样，测量株高、茎粗、干鲜重等生理指标。
[0122]
结果见图7和表9，与对照组相比，rdpp对玉米的生长发育起到显著的促进作用。拔节期：非施肥小区，当rdpp终浓度为3μm时，株高增加了8.2％，根长增加了7.9％，茎粗增加了14.8％，叶绿素含量增加了14.1％，地上部鲜重增加了33.4％，地上部干重增加了31.7％，根鲜重增加了61.4％，根干重增加了53.2％。
[0123]
表9田间实验中不同时期rdpp对玉米生长发育的影响
[0124][0125][0126]
玉米田间产量的测量：
[0127]
在玉米成熟时,各小区选取5株有代表性的植株测定小区穗数、亩收获穗数、平均穗粒数(粒)、百粒重,再对各小区所有玉米进行脱粒测产,并按14％含水量折合成亩产量。
[0128]
结果见表10，与对照组相比，rdpp显著提高了田间玉米的产量。非施肥小区，当rdpp终浓度为3μm时，小区穗数增加了28.6％，亩收获穗数增加了39.9％，平均穗粒数(粒)增加了2.5％，百粒重增加了4.5％，理论产量(公斤/亩)增加了50.1％。
[0129]
表10田间实验中rdpp对玉米产量的影响
[0130][0131]
实施例5：
[0132]
验证本发明所述的植物根系发育促生肽rdpp对单子叶水稻的促生效果：
[0133]
水稻半固体培养试验：
[0134]
水稻种子的选取：选取高产抗病的优良品种隆平206。
[0135]
水稻种子表面消毒：挑选大小一致的水稻种子至于75％的无水乙醇中，浸泡2～3分钟，用去离子水清洗4～5次，然后置于1％次氯酸钠中，浸泡30分钟。用去离子水清洗4～5次，去除清洗液后备用。
[0136]
水稻播种：将水稻种子点播在1/2ms固体培养基表面，放置于30℃培养箱内，暗培养72h后观察水稻萌发情况。
[0137]
rdpp准备：将rdpp用去离子水稀释到0.1μm、0.3μm和1μm的终浓度，并均匀的涂布于1/2ms固体无菌培养基上。
[0138]
rdpp处理水稻：挑选萌发一致的水稻幼苗，移栽于涂布不同浓度rdpp的1/2ms固体培养基上为处理组，涂布有双蒸水的1/2ms固体培养基作为对照组。4天后测量各组水稻生理指标。
[0139]
结果见图8和表11，与对照组相比，rdpp对水稻的生长发育起到显著的促进作用，当rdpp终浓度为0.3μm时，对侧根的促生效果最佳，增加了64.8％；当rdpp终浓度为1μm时，对种子根的促生效果最佳，增加了增加了26.1％。
[0140]
表11组培实验中rdpp对水稻生长发育的影响
[0141][0142]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

技术特征：
1.一种促进植物根系发育的小肽，其特征在于：该小肽的氨基酸序列为glu-pro-asp-ser-glu-glu-glu-pro-lys-glu-pro-glu-ala-ile。2.权利要求1所述小肽的提取分离方法，其特征在于，发酵培养短小芽孢杆菌并收集发酵液的上清液，所述的上清液经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后冷冻干燥，用去离子水对冻干粉或浸膏溶解重悬浓缩，采用1kda～2kda分子截流量的透析袋对浓缩液进行分离，对透析液使用hplc进行除杂，分离纯化得到促进植物根系发育的小肽。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sephadex lh-20凝胶色谱柱层析的洗脱液为体积比为9:1的水-甲醇。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，经sephadex lh-20凝胶色谱柱层析后的活性物质冷冻干燥40～55h。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养短小芽孢杆菌的发酵培养基为msgg培养基。6.权利要求1所述的小肽在促进植物生长发育或促进植物根系发育中的应用。7.权利要求1所述的小肽在制备促进植物生长发育制剂中的应用。8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的植物为模式植物、粮食作物或叶菜类作物。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥、番茄、大豆、玉米或水稻。

技术总结
本发明公开了一种促进植物根系发育的小肽及其应用，该小肽的氨基酸序列为Glu-Pro-Asp-Ser-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-Glu-Pro-Glu-Ala-IlE。该小肽是一种来自芽孢杆菌的新型植物根系发育促生肽RDPP。本申请从短小芽孢杆菌中分离并纯化出一种分子量大小为1598Da的植物根系发育促肽RDPP，摸索了RDPP发酵最适培养基，发酵条件及分离方法，鉴定出RDPP的氨基酸序列；通过对模式植物拟南芥生长发育的促生试验，验证了RDPP的活性。通过水培、盆栽和田间试验明确，RDPP对大豆、玉米和水稻等粮食作物，番茄等叶菜类作物具有广谱的促生长效果，显著提高农作物的产量。高农作物的产量。高农作物的产量。


技术研发人员：张瑞福 付严松 缪有志 张楠 郑文君 徐志辉 邵佳慧
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/7/22