汉麻中萜烯酚酸物质的制备及其在抗紫外辐射中的应用

1.本发明属于植物次生代谢产物提取与分离领域，具体涉及一种汉麻中萜烯酚酸物质的制备及其应用。


背景技术：

2.太阳光是地球能量的主要来源，光线中紫外光由于波长短、能量高，到达地面后对生物体造成较大影响。紫外辐射可造成dna损伤、膜脂氧化、电子传递链受损产生活性氧、破坏光合作用系统、破坏生物大分子等，通常会导致遗传突变和其它生理响应最终造成生物量的减少甚至细胞死亡。紫外光线中依据其波长不同可分为三类：uv-a（315-400 nm）、uv-b（280-315 nm）和uv-c（200-280 nm）。从其生物的效应来看，uv-a一般无杀伤力，并且很少被臭氧吸收，属于弱效应波。uv-b可以破坏生物大分子，大部分可以被臭氧层吸收，约有10 %的uv-b会到达地面，属于强效应波。已有研究证实，异源的次生代谢产物会导致植物细胞膜脂的变化，引起细胞膜渗透性能改变，从而破坏膜的基本功能，导致植物结构功能及代谢紊乱而衰老，因而目前未有将异源的次生代谢产物应用于植物抗紫外的报道。
3.萜烯酚酸化合物是一类特殊的汉麻植物内源次生代谢物，其主要分为三类：植物萜烯酚酸化合物、内源性萜烯酚酸化合物和合成萜烯酚酸化合物。其中，最为人们熟知的植物萜烯酚酸化合物是四氢大麻酚（thc）和大麻二酚（cbd）。先前的研究表明，植物萜烯酚酸化合物可用于治疗各种疾病，包括炎症、帕金森病、糖尿病、肥胖、自闭症和几种皮肤病等。四氢大麻酚酸（thca）是thc的酸性前体，在植物体内，由其前体物质大麻萜酚酸（cbga）在氧化环化酶thcas的催化下合成。然而，除药用价值外，萜烯酚酸化合物的紫外吸收性能及其在抗紫外应用的研究甚少报道。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的无法在有效保护植物叶片抗紫外损伤的同时不影响植物的正常生长状态这一缺点和不足，本发明提供了一种从汉麻中提取的具有紫外线吸收能力的萜烯酚酸物质的制备方法，该方法具有便捷且高效的特点。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，其是将汉麻组织碾碎，按1l/100g的量用甲醇进行超声波辅助提取，并放置过夜，所得上清液浓缩至干后，采用硅胶柱层析进行分离提纯，再通过uplc-ms/ms技术进行进一步分离，获得所述萜烯酚酸物质。
6.进一步地，所述汉麻组织包括汉麻的花。
7.进一步地，所述超声波辅助提取的超声功率为40 khz，时间为30 min。
8.进一步地，所述硅胶柱层析采用的硅胶规格为15-25 μm、120，采用的洗脱剂为甲醇/水混合溶液，其洗脱程序为100 vol%甲醇洗脱30 min、75 vol%甲醇洗脱30 min、50 vol%甲醇洗脱30 min、25 vol%甲醇洗脱30 min、纯水洗脱30 min。
9.进一步地，所述uplc-ms/ms技术采用ymc pack ods-a色谱柱，其色谱柱规格为孔
径12 nm，粒径 5 μm，进样量为1 μl；质谱分析采用负模式电喷雾电离（esi-）模式，毛细管电压为2.80kv；锥形气体为50 l/h，脱溶气体为600 l/h，源温度为120 ℃，脱溶温度为380 ℃；扫描时间为0.1 s，碰撞能量为25 kv。
10.进一步地，所得到的萜烯酚酸物质包括四氢大麻酚酸（thca，）、大麻色烯酸（cbca，）和大麻二酚酸（cbda，）中的至少一种。
11.所得萜烯酚酸物质具备紫外线吸收能力，将其与甲醇混合后施加于植物叶片表面，能够起到保护叶片抵抗紫外线辐射的作用，且可维持植物的正常生长状态。同时，所得萜烯酚酸物质还可作为添加剂加入到化妆品或化工材料中，以化妆品或化工材料的抗紫外辐射性能。
12.本发明的显著优势在于：本发明首次从汉麻中提取得到一种具有紫外线吸收能力的萜烯酚酸物质，其提取方法简单，所得萜烯酚酸物质能在有效保护植物叶片抗紫外损伤的同时不影响植物维持正常生长状态，其还可用于提高化妆品或化工材料的抗紫外性能，因而有着广泛的应用前景。
附图说明
13.图1为实施例1所得萜烯酚酸化合物的质谱图（a）和质谱离子碎片化峰图（b）。
14.图2为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca的高效液相色谱图。
15.图3为实施例2中thca、cbca和cbda的紫外吸收图。
16.图4为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于苔藓植物地钱叶片后经紫外处理的表型图（a），叶片活性氧水平测定结果（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
17.图5为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于单子叶植物水稻叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
18.图6为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于单子叶植物玉米叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
19.图7为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物拟南芥叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
20.图8为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物烟草叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
21.图9为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物番茄叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
22.图10为实施例1所得萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物大豆叶片后经紫外处
理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。
具体实施方式
23.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
24.实施例1汉麻中萜烯酚酸物质的提取1）将100 g汉麻新鲜花组织碾碎，加入1 l的甲醇浸泡2 h，然后使用40 khz超声波辅助提取30 min，并浸泡过夜；2）将所得上清液收集至500 ml烧杯中，使用旋转蒸发仪进行浓缩；3）所得浓缩物于硅胶柱（硅胶柱规格为12-25 μm，120）中进行上样，并采用甲醇/水进行梯度洗脱，其洗脱程序为100 vol%甲醇洗脱30 min，然后降为75 vol%、洗脱30 min，再降为50 vol%、洗脱30 min，之后降为25 vol%，洗脱30 min，最后用纯水洗脱30 min；4）采用uplc-ms/ms技术对收集的洗脱液进行检测，即采用ymc pack ods-a色谱柱（色谱柱规格为孔径12 nm，粒径 5 μm）进行超高相液相色谱分离，样品进样量为1 μl；质谱分析采用负模式电喷雾电离（esi-）模式，毛细管电压为2.80 kv。锥形气体为50 l/h，脱溶气体为600 l/h，源温度为120 ℃，脱溶温度为380 ℃；采用数据依赖的ms/ms模型，扫描时间为0.1 s，碰撞能量为25 kv。采用unifi软件采集uplc-ms/ms数据，并利用正品标准品进行保留时间和参考质谱鉴定，然后将产物收集于50 ml离心管中。结果证实得到的萜烯酚酸化合物为四氢大麻酚酸（thca）、大麻二酚酸（cbda）和大麻色烯酸（cbca）。
25.图1为所得萜烯酚酸化合物thca、cbca及cbda的质谱检测图。从图中可见，所得化合物为thca、cbca及cbda。
26.图2为所得萜烯酚酸化合物thca的高效液相色谱图。从图中可见，所得thca的纯度达95.12 %。
27.实施例2紫外线吸收能力测试对实施例1获得的萜烯酚酸物质的紫外线吸收能力进行检测，其检测方法为：将所得thca、cbda和cbca的标准原液用甲醇稀释至1 μm，用uplc-pda检测；检测条件为：反相柱（2.1
×
100 mm，1.7 μm，waters acquity uplc shield rp18），温度为40℃，并由acquity uplc光电二极管阵列探测器监测；使用由含0.1 %甲酸的甲醇（溶剂a）和含0.1 %甲酸的超纯水（溶剂b）组成的二元溶剂体系进行分离，其洗脱梯度如下：溶剂a经3分钟从50 %线性梯度洗脱到80%，然后经11分钟增加到100 %，并保持1分钟，然后经2分钟下降到50 %，再平衡3分钟。
28.图3为thca、cbca和cbda的紫外吸收图。由图中可见，三种萜烯酚酸化合物thca、cbca和cbda均有紫外吸收能力，且thca在uv-b波段的紫外吸收能力较其余三种萜烯酚酸化合物更强。
29.实施例3将实施例1获得的萜烯酚酸物质thca与甲醇复合施加于苔藓植物地钱、单子叶植物水稻、玉米及双子叶植物拟南芥、大豆、番茄及烟草表面，以考察其保护植物叶片抵抗紫外线辐射的作用。其具体操作为：分别称取1、2.5和4 mg的萜烯酚酸物质thca，溶于1 ml的70 %（v/v）甲醇溶液中，混匀，得到相应浓度的样品溶液，用移液器吸取200μl上述溶液分别
均匀涂膜于苔藓植物地钱、单子叶植物水稻、玉米及双子叶植物拟南芥、大豆、番茄及烟草的叶片表面，并以70 %甲醇溶液为空白对照，然后将各种植物于uv-b灯（波长280 nm-320 nm，强度为53.6 mw
·
cm-2
）下进行辐照处理，并通过对叶片光合速率测定及氮蓝四唑（nbt）染色衡量叶片损伤程度。
30.所用拟南芥、烟草、番茄、大豆、水稻和玉米在以下条件下从种子开始在土壤中生长：温度为21
±
2 ℃，光周期为16/8小时，相对湿度为60%，白光光强为200 μmol
·
m-2
·
s-1
。将地钱takaragaike-1 (tak-1)的雌性菌种培养在含2%琼脂的无菌半强度gamborg's b5固体培养基(gamborg et al.，1968)上，于温度22℃、白光强度为100 μmol m-2
s-1
的条件下培养，光周期为16/8小时。可见光强度和质量的测量采用hr-350光谱仪（hipoint，中国台湾），宽谱uv-b辐射强度(280 nm-320 nm)的测量采用uv-254 uv-b紫外辐射计（北京师范大学光电仪器厂）。
31.nbt染色方法按照以下步骤：称取0.066 g nbt，溶于50 ml 50 mm 磷酸缓冲液（ph = 7.5）中，配置成0.15% 的nbt染色工作液；取处理后的新鲜植物叶片于15 ml 离心管中，加入nbt染色工作液，使叶片充分浸没；静置染色12 h，弃染色工作液，加入无水乙醇，80 ℃水浴加热以脱叶绿素；脱色完成后浸没于60 %甘油溶液中等待组织回软，拍照。
32.图4为萜烯酚酸化合物thca涂抹于苔藓植物地钱叶片后经紫外处理的表型图（a），叶片活性氧水平测定结果（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，苔藓植物地钱经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的地钱生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，地钱叶片经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片活性氧（ros）水平的测定发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的ros水平要显著低于其他处理，与健康地钱叶片的ros水平相接近。
33.图5为萜烯酚酸化合物thca涂抹于单子叶植物水稻叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，水稻经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的水稻生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，水稻经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片进行nbt染色发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的nbt蓝黑色沉淀面积要显著小于其他处理。
34.图6为萜烯酚酸化合物thca涂抹于单子叶植物玉米叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，玉米经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的玉米生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，玉米经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片进行nbt染色发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的nbt蓝黑色沉淀面积要显著小于其他处理。
35.图7为萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物拟南芥叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，拟南芥经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加
了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的拟南芥生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，拟南芥经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片进行nbt染色发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的nbt蓝黑色沉淀面积要显著小于其他处理。
36.图8为萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物烟草叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，烟草经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的烟草生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，烟草经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片进行nbt染色发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的nbt蓝黑色沉淀面积要显著小于其他处理。
37.图9为萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物番茄叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，番茄经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的番茄生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，番茄经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片进行nbt染色发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的nbt蓝黑色沉淀面积要显著小于其他处理。
38.图10为萜烯酚酸化合物thca涂抹于双子叶植物大豆叶片后经紫外处理的表型图（a），氮蓝四唑nbt染色的表型图（b）及叶片光合速率测定结果图（c）。由图中可见，在表型上，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，大豆经高强度uv-b照射后的生长状态愈好，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸的大豆生长状态最好；对叶片的光合速率测定发现，随着施加萜烯酚酸溶液浓度的提高，大豆经高强度uv-b照射后叶片的光合速率下降愈缓；对叶片进行nbt染色发现，施加了4 mg/ml高浓度萜烯酚酸叶片的nbt蓝黑色沉淀面积要显著小于其他处理。
39.从图4至图10所展示的结果可知，萜烯酚酸化合物thca的强uv-b吸收能力可推广至苔藓植物、单子叶植物及双子叶植物上，其能加强植物叶片对紫外线的抗性，减轻胁迫程度。
40.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，其特征在于：将汉麻组织碾碎，按1l/100g的量用甲醇进行超声波辅助提取，并放置过夜，所得上清液浓缩至干后，采用硅胶柱层析进行分离提纯，再通过uplc-ms/ms技术进行进一步分离，获得所述萜烯酚酸物质。2.根据权利要求1所述的汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，其特征在于：所述汉麻组织包括汉麻的花。3.根据权利要求1所述的汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，其特征在于：所述超声波辅助提取的超声功率为40 khz，时间为30 min。4.根据权利要求1所述的汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，其特征在于：所述硅胶柱层析采用的硅胶规格为15-25 μm、120 ，采用的洗脱剂为甲醇/水混合溶液，其洗脱程序为100 vol%甲醇洗脱30 min、75 vol%甲醇洗脱30 min、50 vol%甲醇洗脱30 min、25 vol%甲醇洗脱30 min、纯水洗脱30 min。5.根据权利要求1所述的汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，其特征在于：所述uplc-ms/ms技术采用ymc pack ods-a色谱柱，其色谱柱规格为孔径12 nm，粒径为5 μm；其质谱分析采用负模式电喷雾电离模式，毛细管电压为2.80 kv；锥形气体为50 l/h，脱溶气体为600 l/h，源温度为120 ℃，脱溶温度为380 ℃；扫描时间为0.1 s，碰撞能量为25 kv。6.一种如权利要求1-5任一方法制备得到的萜烯酚酸物质，其特征在于：其包括thca、cbca、cbda和cbga中的至少一种。7.一种如权利要求6所述的萜烯酚酸物质在保护植物叶片抵抗紫外线辐射中的应用，其特征在于：将所述萜烯酚酸物质与甲醇混合后施加于植物叶片表面，其起到保护叶片抵抗紫外线辐射的作用。8.一种如权利要求6所述的萜烯酚酸物质在提升化妆品或化工材料抗紫外辐射性能中的应用。

技术总结
本发明公开了一种汉麻中萜烯酚酸物质的制备方法，属于植物次生代谢产物提取与分离领域。其是以甲醇为溶剂，采用超声波辅助提取获得提取液后，经浓缩，硅胶柱层析及UPLC-MS/MS技术分离纯化而制得。所得萜烯酚酸物质能在有效保护植物叶片抗紫外损伤的同时不影响植物维持正常生长状态，且其还可用于提高化妆品或化工材料的抗紫外性能，因而有着广泛的应用前景。景。景。


技术研发人员：刘圆圆 欧阳雨锃 吴琴琴 李珉轩 谷雨 彭莉媛
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/7/25