雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用和药物

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用和药物。


背景技术：

2.肿瘤相关性贫血(cra)是一种高发的肿瘤并发症，肿瘤初诊患者中40％可罹患贫血，对癌症患者的生活质量和总体预后具有多种不良影响。临床上，治疗cra目前常采用人重组epo(rhepo)类红细胞生成素及静脉铁疗法，但临床数据表明人重组epo类红细胞生成素及静脉铁疗法仅在早期肿瘤患者中观察到一定的贫血改善作用，而在中晚期肿瘤患者中未见疗效。因此，需要加强治疗肿瘤相关性贫血的药物研究以提高肿瘤相关性贫血的治疗效果。


技术实现要素：

3.本发明提供了雷帕霉素在制备用于治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用，本发明的药物能够有效治疗肿瘤相关性贫血。
4.为了解决上述问题，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。
6.优选的，所述药物的应用包括以下任一项或者两项：
7.1)雷帕霉素可以有效治疗肿瘤相关性贫血；
8.2)雷帕霉素可以提高外周血血红蛋白含量、红细胞数量和红细胞压积中的一种或两种以上。
9.优选的，所述药物中雷帕霉素的有效作用剂量为1～2mg/kg/d。
10.本发明提供了雷帕霉素与epo联合使用在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。
11.优选的，所述epo包括人重组epo。
12.优选的，所述药物中雷帕霉素的有效作用剂量为1～2mg/kg/d，所述药物中人重组epo的有效作用剂量为50iu/kg/d。
13.本发明提供了一种治疗肿瘤相关性贫血的药物，包括雷帕霉素、epo和药学上可接受的辅料。
14.优选的，所述药物的剂型包括口服剂型、注射剂和栓剂中的一种或几种。
15.本发明的有益效果：本发明提供了雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。本发明原创性发现，与其他常见的贫血类型如失血性贫血、红细胞破坏过多以及骨髓造血异常等显著不同，cra发生的主要原因在于：肿瘤晚期激活的髓外造血机制使脾脏等髓外造血器官启动造血，但在肿瘤影响下这种髓外造血并未有效补充体内成熟红细胞，反而加速贫血，并抑制机体免疫功能加速肿瘤进程。具体表现为：(1)肿瘤髓外造血虽然可产生大量处于分化早期的红系前体细胞，但在肿瘤影响下该群细胞的线粒体自噬发生障碍，
导致氧化磷酸化异常，从而使得该细胞无法进入红系分化终末阶段，阻滞在红系分化的中早期阶段，这也是导致cra发生的关键所在。(2)红系前体细胞在肿瘤影响下可通过产生ros(活性氧)等发挥极强的免疫抑制作用，进而抑制t细胞抗瘤免疫反应，加速肿瘤进程。上述表现，同时也是传统的cra治疗方法如静脉铁疗法和促红细胞生成剂不能有效改善cra的关键原因。即人重组epo类红细胞生成素及静脉铁疗法这类药物虽然可一定程度促进红系前体细胞产生，但未解决关键的分化受阻问题，不仅不能有效治疗cra，还可能因为促进红系前体细胞产生，加速机体免疫抑制促进肿瘤进程。因此，本发明创造性的将雷帕霉素应用于制备肿瘤相关性贫血的药物。
16.本发明所述雷帕霉素可以通过促进线粒体自噬，清除红系前体细胞中异常的线粒体，解除异常的线粒体对红系前体细胞分化阻滞作用，进而用于治疗cra。实验结果表明：雷帕霉素确实可促进红系前体细胞的分化成熟，有效改善cra动物模型贫血状态。同时该治疗有效减少了红系前体细胞在体内的大量蓄积，解除了红系前体细胞抑制抗肿瘤免疫促进肿瘤进程的风险。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
18.图1为实施例1雷帕霉素给药示意图；
19.图2为实施例1雷帕霉素治疗肿瘤相关性贫血结果示意图；
20.其中，图2中a代表小鼠外周血外观；
21.b代表小鼠尾静脉外周血血红蛋白(hgb)含量、红细胞(rbc)数量及红细胞压积(hct)；
22.c代表小鼠脾脏红系分化各阶段比例；
23.图3为实施例2雷帕霉素和人重组epo治疗肿瘤相关性贫血给药示意图；
24.图4为实施例2雷帕霉素和人重组epo治疗肿瘤相关性贫血结果示意图；
25.图4中a为代表外周血外观、小鼠脾脏大小及重量；
26.b为小鼠尾静脉外周血血红蛋白(hgb)含量、红细胞(rbc)数量及红细胞压积(hct)结果；
27.c为小鼠脾脏红系分化各阶段比例；图4中epo代表rhepo；
28.图5为实施例1肿瘤相关性贫血小鼠模型血常规结果示意图。
具体实施方式
29.本发明提供了雷帕霉素在制备用于治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。
30.本发明所述雷帕霉素的化学式为c
51h79
nc
51h79
no
13o13
，分子量为914.17，结构如式1所示：
[0031][0032]
本发明对雷帕霉素的来源没有特殊限定，本领域技术人员常规购买即可。本发明所述的雷帕霉素优选为注射剂。本发明所述雷帕霉素在pubchem化学物质编号为329830232。本发明优选所述雷帕霉素可以从天然物质中提取，可以根据雷帕霉素化学性质人工合成。在本发明实施例中，本发明所述的雷帕霉素优选购买于sigma，货号v900930 vetec
tm
，reagent grade(试剂级)，纯度≥95％。
[0033]
本发明所述药物的应用优选包括以下任一项或者两项：
[0034]
1)有效治疗肿瘤相关性贫血；
[0035]
2)提高外周血血红蛋白含量、红细胞数量和红细胞压积中的一种或两种以上；更优选为有效治疗肿瘤相关性贫血、提高外周血血红蛋白含量、提高红细胞数量和提高红细胞压积。
[0036]
本发明所述雷帕霉素制备的药物中雷帕霉素的有效作用剂量优选为1～2mg/kg/d，更优选为2mg/kg/d。在本发明实施例中，雷帕霉素的有效作用剂量优选为2mg/kg/d。本发明所述雷帕霉素的给药频率优选为间隔1d给药一次。本发明原创性发现，cra发病机制在于肿瘤影响红系前体细胞线粒体自噬导致其正常成熟分化受阻，本发明基于雷帕霉素对线粒体自噬的调控基础上，开创性地将雷帕霉素应用于肿瘤相关性贫血的治疗中，并在小鼠荷瘤模型中观测到贫血显著缓解。
[0037]
本发明提供了雷帕霉素与epo联合使用在制备用于治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。在本发明中，所述epo优选包括人重组epo。本发明所述epo包括人重组epo，本发明所述人重组epo可显著促进红系前体细胞生成，将所述雷帕霉素与人重组epo联合使用，人重组epo增加红系前体细胞产生，雷帕霉素解除红系前体细胞成熟分化阻滞，双管齐下将从红系前体细胞产生源头及终末分化阶段干预，该雷帕霉素与人重组epo联合治疗方法可消除人重组epo单用治疗无效的情况，更进一步增效荷瘤晚期难治性贫血的治疗效果。本发明所述人重组epo(rhepo)优选购买于peprotech，货号600-05。
[0038]
本发明所述雷帕霉素和epo制备的药物中雷帕霉素的有效作用剂量为1～2mg/kg/d，更优选为2mg/kg/d。本发明所述药物中雷帕霉素的有效作用剂量优选为2mg/kg/d，人重组epo的有效作用剂量优选为50iu/kg/d。
[0039]
本发明所述雷帕霉素的给药频率优选为间隔1d给药。
[0040]
本发明提供了一种治疗肿瘤相关性贫血的药物，所述药物为上述技术方案所述的雷帕霉素、epo和药学上可接受的辅料。在本发明中，所述epo优选包括人重组epo。
[0041]
本发明所述药物的剂型包括口服剂型、注射剂和栓剂中的一种或几种。
[0042]
肿瘤相关性贫血(cra)是一种高发的肿瘤并发症，其发病机理显著区别于其他非肿瘤情况下贫血疾病，目前cra在面对常规rhepo(人重组epo)类红细胞生成素及静脉铁疗法治疗时疗效不佳。本发明利用epo(促红细胞生成素)促进大量红系前体细胞产生，开创性地将rapamycin(雷帕霉素)与传统促红系生成药物epo联用，人重组epo增加红系前体细胞产生，雷帕霉素解除红系前体细胞成熟分化阻滞，双管齐下将从红系前体细胞产生源头及终末分化阶段干预，该雷帕霉素与人重组epo联合治疗方法可消除人重组epo单用治疗无效的情况，更进一步增效荷瘤晚期难治性贫血的治疗作用。
[0043]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0044]
实施例1
[0045]
1肿瘤相关性贫血小鼠模型的建立
[0046]
肿瘤相关性贫血小鼠模型的建立：将8～10周龄的c57bl/6小鼠腋下接种1
×
106个小鼠肺腺癌细胞，接种次数为1次，接种后饲养14d，荷瘤14d肿瘤发展至1.0cm～1.2cm开始出现贫血状态，并通过血常规检测指标来确认肿瘤相关性贫血小鼠模型的成功构建，结果见图5。
[0047]
2雷帕霉素治疗肿瘤相关性贫血
[0048]
确认c57bl/6小鼠荷瘤14天成功构建肿瘤相关性贫血小鼠模型后，给予荷瘤小鼠腹腔注射雷帕霉素(sigma，货号v900930)治疗肿瘤相关性贫血，腹腔注射雷帕霉素剂量为2mg/kg，每间隔1天给药一次，连续给药3次，雷帕霉素腹腔注射时间分别为荷瘤15天、荷瘤17天、荷瘤19天，一周后观测治疗疗效，给药示意图见图1。治疗疗效主要以小鼠外周血外观、小鼠尾静脉外周血血红蛋白、红细胞、红细胞压积以及脾脏红系各阶段分化比例为评价指标。血常规检测外周血血红蛋白(hgb)、外周血红细胞(rbc)及外周血红细胞压积(hct)；将脾脏制备为未裂红单细胞悬液，利用ter119-fitc、cd44-pb、cd71-pc7、cd45-pe、cd11b-pc5.5、l/d-ac7流式染色方案检测红系原始红细胞，早幼红细胞，中幼红细胞，晚幼红细胞以及成熟红细胞各阶段比例。
[0049]
对照组小鼠：c57bl/6小鼠荷瘤第14天成功构建肿瘤相关性贫血小鼠模型后，给予荷瘤小鼠腹腔注射生理盐水0.2ml，每间隔1天给药一次，连续给药3次，生理盐水腹腔注射时间分别为荷瘤15天、荷瘤17天、荷瘤19天，一周后观测治疗疗效。
[0050]
小鼠尾静脉外周血血红蛋白(hgb)、红细胞(rbc)及红细胞压积(hct)采用血常规检测，脾脏红系分化各阶段比例测定时将小鼠脾脏制备为未裂红单细胞悬液，利用ter119-fitc、cd44-pb、cd71-pc7、cd45-pe、cd11b-pc5.5、l/d-ac7流式染色方案检测红系原始红细胞rⅰ，早幼红细胞rⅱ，中幼红细胞rⅲ，晚幼红细胞rⅳ以及成熟红细胞r
ⅴ
各阶段比例。
[0051]
结果见表1和图2，图2中a代表小鼠外周血外观，b代表血红蛋白(hgb)含量、红细胞(rbc)数量及红细胞压积(hct)测定结果；c代表脾脏红系分化各阶段比例测定结果。图5为实施例1肿瘤相关性贫血小鼠模型血常规结果示意图。根据图5可确认肿瘤相关性贫血小鼠模型的成功构建。
[0052]
表1雷帕霉素治疗肿瘤相关性贫血的效果数据
[0053][0054][0055]
实施例2雷帕霉素(rapa)联合人重组epo治疗肿瘤相关性贫血
[0056]
采用肿瘤相关性贫血小鼠模型制备方法同实施例1。
[0057]
试验组1：荷瘤14天的肿瘤相关性贫血c57bl/6小鼠给予腹腔注射rapa2mg/kg，ip，间隔1天给药，连续给药3次，3次rapa注射时间分别为荷瘤15天、荷瘤17天、荷瘤19天，同时每天腹腔注射rhepo 50iu/kg，rhepo每天注射，rhepo共注射7次，注射时间分别为荷瘤14天、荷瘤15天、荷瘤16天、荷瘤17天、荷瘤18天、荷瘤19天、荷瘤20天。给药示意图见图3。
[0058]
试验组2：荷瘤14天的肿瘤相关性贫血c57bl/6小鼠给予腹腔注射rapa 2mg/kg，ip，间隔1天给药，连续给药3次，3次rapa注射时间分别为荷瘤15天、荷瘤17天、荷瘤19天，连续给药3次。
[0059]
对照组1：荷瘤14天的肿瘤相关性贫血c57bl/6小鼠每天腹腔注射rhepo(购买于peprotech，货号600-05)50iu/kg，连续给药7次，每天1次，注射时间分别为荷瘤14天、荷瘤15天、荷瘤16天、荷瘤17天、荷瘤18天、荷瘤19天、荷瘤20天。
[0060]
对照组2：c57bl/6小鼠荷瘤第14天成功构建肿瘤相关性贫血小鼠模型后，给予荷瘤小鼠腹腔注射生理盐水0.2ml，每间隔1天给药一次，连续给药3次，生理盐水腹腔注射时间分别为荷瘤15天、荷瘤17天、荷瘤19天，一周后观测治疗疗效。
[0061]
一周后处死小鼠，观测脾脏大小及重量；检测治疗后小鼠尾静脉外周血血红蛋白(hgb)含量、外周血红细胞(rbc)数量及外周血红细胞压积(hct)；脾脏制备未裂红单细胞悬
液，利用ter119-fitc、cd44-pb、cd71-pc7、cd45-pe、cd11b-pc5.5、l/d-ac7流式染色方案检测红系原始红细胞rⅰ，早幼红细胞rⅱ，中幼红细胞rⅲ，晚幼红细胞rⅳ以及成熟红细胞r
ⅴ
各阶段比例。
[0062]
结果见表2和图4，图4中a代表小鼠脾脏大小及重量，b代表小鼠尾静脉外周血血红蛋白(hgb)、红细胞(rbc)及红细胞压积(hct)；c代表脾脏分化各阶段比例。
[0063]
c57bl/6小鼠腋下接种1
×
106个肺腺癌细胞后继续饲养14d时作为起始点，第二天腹腔注射给予雷帕霉素2mg/kg治疗，每间隔1天给药一次，连续给药3次；与此同时，每日给予50iu/kg人重组epo，腹腔注射，连续给药7天，一周后观测治疗疗效，治疗疗效以脾脏大小、脾脏红系各阶段分化比例、外周血血红蛋白、红细胞、红细胞压积为评价指标。给药示意图见图3。
[0064]
表2雷帕霉素联合人重组epo治疗肿瘤相关性贫血的效果数据
[0065]
[0066][0067][0068]
综上，本发明rapa(雷帕霉素)与epo(促红细胞生成素)联用后疗效更佳，且可消除
epo单用治疗无效的情况，更进一步逆转荷瘤晚期难治性贫血的发生。
[0069]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的应用包括以下任一项或两项：1)有效治疗肿瘤相关性贫血；2)提高外周血血红蛋白含量、红细胞数量和红细胞压积中的一种或两种以上。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物中雷帕霉素的有效作用剂量为1～2mg/kg/d。4.雷帕霉素与epo联合使用在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述epo包括人重组epo。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述药物中雷帕霉素的有效作用剂量为1～2mg/kg/d，所述药物中人重组epo的有效作用剂量为50iu/kg/d。7.一种治疗肿瘤相关性贫血的药物，其特征在于，包括雷帕霉素、epo和药学上可接受的辅料。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括口服剂型、注射剂和栓剂中的一种或几种。

技术总结
本发明属于生物医药领域，具体涉及雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用和药物。本发明提供了雷帕霉素在制备治疗肿瘤相关性贫血的药物中的应用。本发明所述雷帕霉素可以促进线粒体自噬功能，清除红系前体细胞中异常的线粒体，解除异常线粒体对红系前体细胞分化阻滞作用，进而用于治疗肿瘤相关性贫血(CRA)；该雷帕霉素与人重组EPO联合治疗方法可消除人重组EPO单用治疗无效的情况，更进一步增效荷瘤晚期难治性贫血的治疗作用。实验结果表明：雷帕霉素可促进红系前体细胞的分化成熟，有效改善CRA动物模型贫血状态，有效减少红系前体细胞在体内的大量蓄积，解除红系前体细胞介导的抗肿瘤免疫抑制所带来的促进肿瘤进程的风险。程的风险。程的风险。


技术研发人员：朱波 张琎 胡春燕 龙海霞 杨丽 黄佳妮 周丽
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/7/25