用于生产IG样分子的方法和手段与流程

用于生产ig样分子的方法和手段
1.本技术是申请日为2021年05月20日，申请号为202180036298.x，发明名称为“用于生产ig样分子的方法和手段”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及分子生物学、医学和生物治疗学领域。它特别涉及用于治疗各种疾病的治疗性抗体领域。


背景技术：

3.在过去十年中，双特异性抗体已经成为使用两个抗体组合的替代方案。相似地，多价多聚体，能够结合三个或更多个相同或不同的抗原或表位，已经成为发展的技术领域。然而两个抗体的结合表示结合到相同或不同靶标上的不同表位的两个不同免疫球蛋白的混合物，结合到相同或不同靶标上的不同表位在双特异性抗体中通过单个免疫球蛋白实现。在多价多聚体中，可以实现结合到相同或不同靶标上的三个或更多个不同的表位。
4.通过结合到相同或不同靶标上的两个表位，与结合到相同表位的两个抗体的组合相比，双特异性抗体可具有相似的效果或更优的效果。这也可以适用于能够结合三个或更多个靶标的多价多聚体的形成。此外，因为igg格式(format)的双特异性抗体在单分子中结合两个不同的单价结合区和两个igg抗体的混合物在单制备中结合两个不同的二价结合分子，以及多价多聚体可结合三个或更多个结合区，这些格式的不同效果也已经观察。从技术和监管角度，如果这些双特异性或多价多聚体可以以基本上纯的方式有效形成并分离，这使得单一双特异性抗体或多价多聚体的开发不太复杂，这是因为制造、临床前和临床测试涉及单分子。因此，基于单一双特异性抗体或多价多聚体的疗法通过不太复杂且具有成本效益的药物开发过程促进，同时提供更有效的抗体疗法。
5.基于igg格式的双特异性抗体，所述抗体由两条重链和两条轻链组成，已经由多种方法生产。例如，双特异性抗体可以通过融合两个抗体分泌细胞系以创造新细胞系或通过使用重组dna技术在单细胞中表达两个抗体生产。这些方法产生多种抗体种类，因为来自每个抗体的相应重链可形成单特异性二聚体(也称为同二聚体)，其包含具有相同特异性的两条相同的配对重链，和双特异性二聚体(也称为异二聚体)，其包含具有不同特异性的两条不同的配对重链，以及被称为半体(half bodies)的未配对重链或轻链可能导致细胞产物的混合物。此外，来自每个抗体的轻链和重链可随机配对以形成非功能(non-functional)组合。这个问题，称为重链和轻链的错误配对，可以通过选择共享共同轻链(common light chain)作为双特异性表达的抗体来解决。最近，申请人已经展示了产生包含三条或更多条重链和三条或更多条轻链的多价多聚体的能力，其中重链或轻链，但优选轻链是共同链。
6.但即使当使用共同轻链时，在单细胞中两条或更多条包含驱使异二聚体形成的变体的重链和一条共同轻链的表达也可导致三个不同抗体种类和半体杂质。在fc中具有工程化改变的残基的重链的表达可促进异二聚体形成，但仍然可产生残留半体、同二聚体或由于工程化改变产生具有较低稳定性的异二聚体。双特异性抗体的表达仍然可导致两个单特
异性
‘
母体’抗体('parental'antibodies)和包含匹配的fc区的双特异性抗体的表达。形成的半体和/或单特异性抗体越多，细胞表达系统的整体效率越低，并且可能需要更昂贵和耗时的过程来分离感兴趣的双特异性或多价多聚体。因此，如果需要单一双特异性或多价多聚体产物，则需要从所得混合物中纯化感兴趣的双特异性抗体或多价多聚体。
7.在临床前、临床和商业制造的背景下，回收双特异性抗体或多价多聚体的需求很重要。尽管已经使用技术以进一步增加在母体抗体和双特异性抗体的混合物中双特异性抗体的百分数并减少错配重链和轻链的百分数，但对于双特异性格式和多价多聚体格式，仍然需要消除或最小化上述的一些缺点并增加生产的靶部分的量。尽管本领域之前已经描述了提高双特异性或多价多聚体的异二聚化配对的百分数，但在表达产物的混合物中仍然存在不想要的杂质。此外，异二聚化产物(双特异性抗体或多价多聚体)的分离，可能具有挑战性、效率较低或成本更高，取决于分离的手段(means，装置，工具)和感兴趣的靶部分的组成。
8.因此，仍然需要改善的和/或替代的技术用于生产和纯化生物疗法。


技术实现要素：

9.本发明提供了用于生产和纯化生物疗法如ig样分子、双特异性抗体和多价多聚体的新手段。它提供了用于提高在感兴趣的至少两个ch3结构域之间的相互作用，例如当多个ch3结构域存在于由单细胞形成的混合物中时的新手段(参见例如wo2013157954和wo2013157953)。
10.本文提供了包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽的分离的异二聚体蛋白，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，其中第一含人igg ch3的多肽在位置s364、k409和/或k360包含另外的氨基酸变体。
11.合适地，364氨基酸可以是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸。
12.合适地，409氨基酸可以是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸(glutamate)。
13.合适地，360氨基酸可以是天冬氨酸(aspartate)。
14.合适地，异二聚体蛋白可包含人igg1、igg2、igg3或igg4 ch3区。
15.合适地，异二聚体蛋白可包含人免疫球蛋白fc区。任选地，人免疫球蛋白fc区可包含igg1、igg2、igg3或igg4 fc区。
16.合适地，第一含ch3的多肽可以是抗体重链。
17.合适地，第二含ch3的多肽可以是抗体重链。
18.合适地，异二聚体蛋白还可包含一条或多条抗体轻链。
19.合适地，抗体轻链可以是共同抗体轻链(common antibody light chain)。
20.还提供了包含本文所述的分离的异二聚体蛋白的药物组合物。
21.还提供了编码本文所述的第一和第二含人igg ch3的多肽的分离的核酸。
22.还提供了包含本文所述分离的核酸的重组宿主细胞。
23.还提供了生产本文所述的分离的异二聚体蛋白的方法，所述方法包括在允许第一和第二含人igg ch3的多肽的表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞。
24.还提供了用于提高异二聚体蛋白的稳定性的方法，所述异二聚体蛋白包括含有氨
基酸变体l351d和l368e的第一含人igg ch3的多肽，以及含有氨基酸变体t366k和l351k的第二含人igg ch3的多肽，所述方法包括在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入第一含人igg ch3的多肽。
25.还提供了用于降低同二聚体蛋白的稳定性的方法，所述同二聚体蛋白包括含有氨基酸变体l351d和l368e的第一含人igg ch3的多肽，所述方法包括在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入第一含人igg ch3的多肽。
26.还提供了用于提高异二聚体蛋白的产量的方法，所述异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，所述方法包括在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入第一含人igg ch3的多肽。
27.还提供了用于提高异二聚体蛋白的纯度的方法，所述异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，所述方法包括(a)在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入第一含人igg ch3的多肽；和(b)使异二聚体蛋白经受离子交换色谱。
28.合适地，离子交换色谱可以是阳离子交换色谱。
29.合适地，364氨基酸可以是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸。
30.合适地，409氨基酸可以是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
31.合适地，360氨基酸可以是天冬氨酸。
32.合适地，异二聚体蛋白可包含人igg1、igg2、igg3或igg4 ch3区。
33.合适地，异二聚体蛋白可包含人免疫球蛋白fc区。任选地，人免疫球蛋白fc区可包含igg1、igg2、igg3或igg4 fc区。
34.合适地，第一含ch3的多肽可以是抗体重链。
35.合适地，第二含ch3的多肽可以是抗体重链。
36.合适地，异二聚体蛋白还可包含一条或多条抗体轻链。
37.合适地，抗体轻链可以是共同抗体轻链。
38.还提供了由本文所述的方法生产的异二聚体蛋白。
39.贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含”和“含有”以及它们的变型是指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。
40.贯穿本说明书的描述和权利要求，除非上下文另有要求，否则单数包含复数。特别地，当使用不定冠词时，这种规定应被理解为既考虑单数，又考虑复数。
41.结合本发明的具体方面、实施方式或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方式或实例，除非与之不相容。
42.以下进一步详细描述本发明的各方面。
附图说明
43.对于以下讨论，字母后跟数字，这表示根据eu编号的一级氨基酸序列中残基编号位置的氨基酸，例如k351，表示位置351的赖氨酸。字母后跟数字再跟另外的字母，这表示根据eu编号的残基的天然位置(例如，野生型人fc)中的氨基酸，以及工程化到该位置的残基
(例如，k409s，表示存在于野生型fc中位置409的赖氨酸，工程化变体是丝氨酸)。
44.在下文中，参考附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
45.图1：用于重链变体表达的矢量图(vector map)。
46.图2：对k360变体的单(a)和双(b)转染的sds-page结果。在非还原sds-page上看到的条带大小对应于：150kda(igg)、75kda(半体)、50kda(重链)和25kda(轻链)。
47.图3：对s364变体的单(a)和双(b)转染的sds-page结果。在非还原sds-page上看到的条带大小对应于：150kda(igg)、75kda(半体)、50kda(重链)和25kda(轻链)。
48.图4：对k409变体的单和双转染的sds-page结果。在非还原sds-page上看到的条带大小对应于：150kda(igg)、75kda(半体)、50kda(重链)和25kda(轻链)。
49.本文提及的专利、科学和技术文献建立了在提交时本领域技术人员可获得的知识。本文引用的已授权专利、公开和悬而未决专利申请以及其它出版物的全部公开内容在此以引用的方式并入本文，其程度如同每个被具体和单独地指出以引用的方式并入。在存在任何不一致的情况下，以本公开为准。
50.以下将进一步详细描述本发明的各方面。
具体实施方式
51.本发明提供了用于生产异二聚体多肽(如双特异性抗体或多价多聚体)的方法。它还提供了从单细胞产生的ch3结构域多肽的混合物中产生异二聚体分子的改善方法。本文还提供了相应的异二聚体蛋白、组合物、核酸和宿主细胞。本发明使得占优势地(在某些实施方式中，几乎是唯一的)具有高产量的异二聚体多肽的产生，并且减少不想要的种类(如半体或同二聚体)成为可能。本发明的方法基于异二聚体多肽在ch3界面(interface)的变体增加了异二聚体稳定性并减少了同二聚体形成。本文提供了方法和组合物的细节。
52.本文中术语“异二聚体”、“异二聚体复合物”或“异二聚体分子”可互换使用以指至少包含第一多肽和第二多肽的分子，其中在氨基酸序列上，第二多肽与第一多肽相差至少一个氨基酸残基。异二聚体可包含由第一和第二多肽形成的“异二聚体”或除存在第一和第二多肽的多肽时，可形成更高阶的三级结构。
53.除非上下文另外说明，否则术语“第一”多肽和“第二”多肽以及它们的变体，仅是通用标识符，不应被视为识别本发明的异二聚体的具体或特定的多肽或组分。
54.本领域描述了各种方法以促进感兴趣的某一抗体的形成，进而在所得混合物中减少不需要的抗体或副产物的含量。
55.对于抗体，众所周知，ch3-ch3相互作用是fc二聚的主要驱动力(ellerson jr.,et al.,j.immunol 1976(116)510-517；deisenhofer j.biochemistry 1981(20)2361-2370)。另外众所周知，当两个ch3结构域彼此相互作用时，它们在包含“接触”残基("contact"residues)(也称为接触氨基酸、界面残基或界面氨基酸)的蛋白质-蛋白质界面中相遇。第一ch3结构域的接触氨基酸与第二ch3结构域的一个或更多个接触氨基酸相互作用。在抗体的三维结构中接触氨基酸通常互相在(优选(优选)之内。来自一个ch3结构域的接触残基和来自不同的ch3结构域的接触残基之间的相互作用例如可以是范德华力、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳香侧链之间的吸引相互作用、二硫键或本领域技术人员已知的其他力。先前研究表明，在人igg1 ch3结构域界面约三分之一的接触氨基酸侧链可占
据对结构域折叠和关联的大部分贡献。可以进一步设想，其他(相邻)氨基酸残基可能影响蛋白质-蛋白质界面中的相互作用。
56.已经使用本领域中干扰抗体重链二聚的方法。已经描述本领域中多种工程化ch3结构域的手段以有利于异二聚化而不是同二聚化。用于生产给定感兴趣的双特异性抗体的方法是基于ch3-ch3界面内接触残基的静电工程化(electrostatic engineering)。
57.例如，在美国专利第9,248,182、9,358,286、9,248,182和9,758,805号中描述了基于ch3-ch3界面内的接触残基的静电工程化的用于生产给定感兴趣的双特异性抗体或多价多聚体的方法。使用组合的计算建模和迭代实验验证策略以识别新型电荷对电荷配对结构体(charge-to-charge paired construct)，称为“dekk”，接触残基通过引入改变电荷极性以支持有利于异二聚体形成的静电相互作用，同时通过电荷排斥减少同二聚化来识别。特别地，l351d/t366k配对导致异二聚体和非常少的同二聚体的有效形成。进一步使用计算分析以在异二聚体ch3界面的核心引入额外的静电相互作用，产生l351d、l368e/l351k、t366k变体或dekk，其显示出高产量异二聚体形成。此外，聚集、展开和体内半衰期的水平与天然抗体相似。dekk双特异性抗体的结构分析揭示不想要的相互作用。如计算建模所预测，残基asp-351和glu-368与残基lys-366在相反的(opposite，相对的)ch3结构域中相互作用。然而，由于igg骨架的局部变化形成稳定的盐桥相互作用，残基lys-351没有如预测的与asp-351相互作用而是与残基pro-352、ser-354和glu-357形成相互作用。这些相互作用可能为异二聚体分子的稳定性作出解释，使其成为开发新型双特异性抗体的非常有吸引力的平台。
58.本发明是基于双特异性或多价多聚体的ch3界面内包含变体氨基酸残基的异二聚体双特异性或多价多聚体，其可以与前述的dekk变体氨基酸残基或与本领域前述的其他增强异二聚化的手段(如杵臼结构(knob-in-hole)或fc(ch2和/或ch3结构域)的电荷工程化)联合使用。例如，使用前述dekk技术和在含有de变化的重链内在位置k360、s364和/或k409包括另外的氨基酸残基变化，与同二聚体配对(例如，dede ch3配对)相比，可以进一步提高产生异二聚体配对的效率。
59.此外，在包含所需的异二聚体的两条重链臂的一条过度表达的条件下，这可能导致这种臂的同二聚体的产生。例如，根据使用的dekk异二聚体工程化的条件，de链相对于kk链的量的过度表达可能会产生dede同二聚体。在位置k360、s364和/或k409(如本文所述)的变体的使用使得同二聚体不稳定，产生半体或单个重链臂(例如，de链而不是dede同二聚体)，这提供了更简单且更有效的纯化步骤，以及当与双特异性抗体或多价多聚体存在于混合物中时，在分析测试该分子中引起较少的干扰。
60.此外，半体的产生优于同二聚体，因为它们更容易在用于研究的蛋白质批次中通过凝胶过滤的手段分离出去，而同二聚体则相反，其在这种过滤中与异二聚体分离可能是不可分离的或更有挑战性的。此外，与同二聚体和异二聚体的峰相比，半体在阳离子交换色谱(ciex)上的峰与异二聚体峰的分离度更高，使得选择与纯双特异性或多价多聚体相关的保留更容易。
61.本文所述的一种或多种氨基酸变体的另一个特征是这种改变促进异二聚体的形成、稳定性和/或使同二聚体不稳定，从而增加表达系统的整体效率。
62.在一个方面，本文公开的发明提供了用于生产包含两个ch3结构域的异二聚体分
子(例如，双特异性抗体或多价多聚体)的方法，其中一个ch3结构域包含在位置k360、s364和/或k409的ch3变体残基，所述方法包括在宿主细胞中提供：
63.编码第一含ch3结构域的多肽链的第一核酸，以及
64.编码第二含ch3结构域的多肽链的第二核酸，
65.其中第一核酸编码一个或多个在位置k360、s364和/或k409的ch3结构域变体残基；所述方法还包括培养所述宿主细胞并允许所述两种核酸表达并从培养中收获所述异二聚体分子的步骤。
66.在另一个方面，本文公开的发明提供了用于生产异二聚体分子(例如，双特异性抗体或多价多聚体)的方法，所述异二聚体分子包含至少两个来自单宿主细胞的不同的ig样分子，其中所述两个ig样分子的每个包含能够形成干扰的两个ch3结构域并且其中每种异二聚体分子的ch3结构域包含一个或多个在位置k360、s364和/或k409的ch3结构域变体残基，所述方法包括在宿主细胞中提供：
67.a)编码第一含ch3结构域的多肽链的第一核酸，
68.b)编码第二含ch3结构域的多肽链的第二核酸，
69.c)编码第三含ch3结构域的多肽链的第三核酸，和
70.d)编码第四含ch3结构域的多肽链的第四核酸，
71.其中至少两个所述核酸提供有用于所述第一和第二含ch3结构域的多肽以及所述第三和第四ch3结构域优先配对的手段，并且其中所述核酸编码所述第一ch3结构域，所述第一ch3结构域包含一个或多个在位置k360、s364和/或k409的ch3结构域变体残基，以及所述核酸编码所述第三ch3结构域，所述第三ch3结构域包含一个或多个在位置k360、s364和/或k409的ch3结构域变体残基，所述方法还包括培养所述宿主细胞并允许表达所述至少四种核酸并从培养中收获所述至少两个不同的ig样分子的步骤。
72.另一个方面包含以上发明，其中所述第一和第二含ch3结构域的多肽的优先配对的所述手段不同于所述第三和第四ch3结构域的优先配对的手段。
73.在另一个方面，本文公开的发明提供了第一核酸，所述第一核酸编码第一含ch3结构域的多肽链，所述多肽链进一步包含分别在位置351和368的de，和第二核酸，所述第二核酸编码第二含ch3结构域的多肽链，所述多肽链包含在位置351和366的kk，其中所述一个或多个在位置k360、s364和/或k409的ch3结构域变体残基存在于第一含ch3结构域的多肽链，所述多肽链进一步包含在位置351和368的de。
74.在另一个方面，本文公开的发明提供了第一核酸，所述第一核酸编码第一含ch3结构域的多肽链，所述多肽链包含促进与第二含ch3结构域的多肽链异二聚化的变化，所述第二含ch3结构域的多肽链由第二核酸编码，所述多肽链包含促进异二聚化的互补变化，其中所述第一核酸还编码一个或多个ch3结构域变体残基(在位置k360、s364和/或k409)。
75.短语“离子交换树脂”是指带有负电荷并具有游离阳离子用于与通过或穿过固相的水溶液中的阳离子交换的固相。可以将一种或多种电荷配体连接到固相上来提供电荷，例如，通过共价连接。可替代地，或此外，电荷可以是固相的固有特性(例如，二氧化硅正是这种情况，其具有整体负电荷)。
76.如本文所用，术语“宿主细胞蛋白(hcp)”是指不同于重组细胞产物的蛋白，如异二聚体多肽(例如双特异性抗体或多价多聚体)，它是来源于生产抗体的来源，即宿主细胞的
蛋白质。对于可用作治疗的双特异性抗体，hcp优选从原始抗体试剂中去除。如本文所用，表达“去除的宿主细胞蛋白”是指包括除感兴趣的产物或靶分子(例如待纯化的双特异性抗体或多价多聚体)之外的，包括除宿主细胞蛋白本身之外的来源于宿主细胞的dna和细胞生长因子的所有杂质。因此，当去除宿主细胞蛋白时，可以显著增加靶分子的纯度。
77.通常需要生产超过一种异二聚体蛋白，例如为了更有效地干扰与疾病过程中涉及的多个生物通路或病原体的入侵、复制和/或传播。
78.超过一种异二聚体蛋白的混合物也特别地用于治疗某些疾病。例如，肿瘤细胞使用多种不同策略以在用抗体或小分子药物治疗期间产生耐药性。耐药性可涉及多种细胞表面受体和可溶分子，并且发展解决多种这种同时疾病和逃逸相关的机制的用于癌症的基于抗体的治疗被认为是有益的。如果涉及多于两种这种与疾病和逃逸相关的机制，双特异性、多价多聚体或异二聚体蛋白的混合物可提供创新和有吸引力的治疗形式。优选地，这种由单细胞生产以促进药物发展过程的异二聚体蛋白的混合物，从监管的角度和成本效益来看，它是不复杂的，并且从药物生产和临床发展的角度来看，它是可行的。在基于单细胞的方法中，需要使用能够控制和有效生产双特异性抗体的方法，从而减少或甚至完全取消从不需要的单特异性igg多肽中分离所需的双特异性igg多肽的混合物的需要。在现有技术下，虽然已经通过单细胞生产单特异性和双特异性抗体的混合物(wo2004/009618)，但这些混合物是几种不同双特异性和单特异性抗体的复杂混合物。本发明的进一步的目的是为在单细胞中生产定义的异二聚体蛋白(例如双特异性抗体)的混合物提供手段和方法。优选地，所提供的方法可导致(双特异性)抗体的混合物具有比例至少95％、至少97％或甚至超过99％的二聚体igg多肽，无论单体副产物的量如何，见下文。通常，在生产多个完整igg多肽的细胞中，半多肽(half polypeptides)(单体副产物)可能存在，其可通过本领域已知的尺寸排阻色谱简单地除去。
79.在一个实施方式中，本发明提供了用于在单细胞中生产定义的异二聚体多肽(例如双特异性抗体或多价多聚体)或至少两个不同的ig样分子的混合物，而不是感兴趣的单(双特异性)抗体的方法，其中其它不需要的二聚的抗体种类的形成减少或甚至不存在，优选在使用表达产物高通量筛选的背景下，其中使用ciex纯化是不切实际的并且同二聚体的存在，与半体相反，可以显著干扰实验方案和使实验结果有误差。通过在ch3界面(在位置k360、s364和/或k409)引入变体实现的同二聚体的减少或消除，这增强了似ch3结构域(like ch3 domains)的排斥，并可以增强不似ch3结构域(unlike ch3 domains)的吸引力。
80.这些变体可以在使用dekk ch3技术中被引入de链。可替代地，这些变体可以用其他促进不同重链(异二聚体形成)的配对优于相同重链(同二聚体形成)的配对的异二聚体技术，例如，如杵臼结构或fc的电荷工程化(例如，ch2和/或ch3结构域)被引入。所得混合物定义明确并且通过设计ch3结构域变体控制其组成。
81.此外，表达水平的调节和/或用于表达的不同转染比率影响了混合物的组成。在根据本发明的方法中，第一核酸编码优先与由第二核酸编码的ch3结构域配对的ch3结构域，或者，第一核酸编码优先与由第二核酸编码的ch3结构域配对的ch3结构域以及第三核酸编码优先与由第四核酸编码的ch3结构域配对的ch3结构域。本发明还提供了由本发明的方法可获得的至少两种不同ig样分子的混合物。
82.如本文所用，术语“所述第一和第二含ch3结构域的多肽的优先配对”是指所得的
包含第一含ch3结构域的多肽和/或第二含ch3结构域的多肽的二聚体将是由一个第一含ch3结构域的多肽与一个第二含ch3结构域的多肽配对组成的二聚体，具有包含第一含ch3结构域的多肽与另一个第一含ch3结构域的多肽配对以及第二含ch3结构域的多肽与另一个第二含ch3结构域的多肽配对的二聚体的有限形成。同样地，术语“所述第三和第四含ch3结构域的多肽的优先配对”是指所得的包含第三含ch3结构域的多肽和/或第四含ch3结构域的多肽的二聚体将是由一个第三含ch3结构域的多肽与一个第四含ch3结构域的多肽配对组成的二聚体，具有包含第三含ch3结构域的多肽与另一个第三含ch3结构域的多肽配对以及第四含ch3结构域的多肽与另一个第四含ch3结构域的多肽配对的二聚体的有限形成。因此，当在单细胞中引入编码四种不同(a、b、c、d)含ch3结构域的多肽的核酸，而不是10种不同的ig样二聚体(aa、ab、ac、ad、bb、bc、bd、cc、cd和dd)的混合物，产生了主要是两个双特异性ig样分子的混合物。使用这里列出的变体的普通技术人员应当理解也可以用该技术生成其他所需的组合。
83.在根据本发明的方法中，上述包含ch3结构域的多肽链的每个优选还包含识别靶表位的一个可变区或两个或更多个可变区。作为包含ch3结构域的多肽链的部分的可变区优选共享并且与共同轻链配对。在那种情况下，仅仅可变区的vh不同而在所有可变区中的vl基本相同。因此，一方面提供了根据本发明的方法，其进一步包括提供了所述具有编码共同轻链的核酸的宿主细胞。在一个实施方式中，包含ch3结构域的多肽链的每个可变区识别不同的靶表位。在一个实施方式中，包含4个ch3结构域的多肽链的所述4个可变区的每个识别不同的靶表位。例如，如果第一核酸编码还包含对抗原a具有特异性的可变结构域的重链，第二核酸编码还包含对抗原b具有特异性的可变结构域的重链，第三核酸编码还包含对抗原c具有特异性的可变结构域的重链，以及第四核酸编码还包含对抗原d具有特异性的可变结构域的重链，然后将生产包含对ab具有特异性的双特异性ig样分子和对cd具有特异性的双特异性ig样分子的混合物。由于用于所述第一和第二含ch3结构域的多肽以及所述第三和第四含ch3结构域的多肽的优先配对的手段，单特异性抗体(具有aa、bb、cc或dd特异性)或双特异性抗体(具有ac、ad、bc或bd特异性)的形成被降低或甚至不存在。这发生在对所述第一和第二含ch3结构域的多肽以及所述第三和第四含ch3结构域的多肽使用的异二聚化工程化不同的情况下。当然，为了生产定义的包含超过两个不同ig样分子(例如ab和cd)的混合物，也可以使用另外的核酸，例如编码第五和第六含ch3结构域的多肽。
84.可替代地，所述包含对抗原a和b具有特异性的可变结构域的重链可包含额外的对抗原c或d具有特异性的可变结构域，通过接头(linker)连接，从而形成多价多聚体，其中重链a和b可通过异二聚化工程化二聚，如dekk，并且通过在一条重链中包括以上变化(使同二聚体形成不稳定)，产生半体，减少了同二聚体。
85.值得注意的是，在根据本发明的方法中使用的核酸的比率不需要1:1:1:1并且表达的所得ig样分子的比率不需要1:1。可以使用本领域已知的手段生产最佳比率的抗体的混合物。例如，核酸的表达水平和因此生产的所得ig样分子的比率可以通过使用不同的基因元件如启动子、增强子和抑制子或通过控制编码抗体的dna构建体的拷贝数的基因组整合位点来调节。优选地，如表达的包含氨基酸变体l351d和l368e以及变体残基在位置s364、k409和/或k360的第一含人igg ch3的多肽的量高于包含氨基酸变体t366k和l351k的第二含人igg ch3的多肽的量。优选地，第一含人igg ch3的多肽与第二含人igg ch3的多肽的重
量比在1:1至10:1之间。更优选地，含de的多肽的量在1:1至5:1之间，更优选地在1:1至3:1或在1:1至2:1之间。
86.本发明的一方面提供了根据本发明的方法，其中所述的用于所述第一和第二含ch3结构域的多肽的优先配对的手段不同于所述的用于所述第三和第四含ch3结构域的多肽的优先配对的手段。
‘
不同’是指设计用于所述第一和第二含ch3结构域的多肽的优先配对的手段，使得第一和第二链的优先配对被支持。该设计使得在第一和第三和/或第四含ch3结构域的多肽链之间基本没有相互作用发生。换句话说，在所述第一含ch3结构域的多肽和所述第三或第四多肽之间的二聚化被减少至几乎为零，依次类推。第三和第四含ch3结构域的多肽可以是野生型或可包含不同于用于第一和第二ch3结构域的优先配对的手段的用于优先配对的手段。
87.本发明提供了用于具有在混合物中高比例的双特异性抗体的ig样分子的定义明确的混合物的有效并可控生产的方法。在需要两个双特异性的系统中甚至获得至少95％、至少97％或更多的(两个)双特异性的比例。这意味着仅获得至多5％、至多3％或更少的单特异性二价副产物。值得注意的是，单体副产物、半分子(half molecules)的量是不重要的，因为这些半分子容易使用它们的尺寸差异从二聚体中分离，并且例如，不会交联受体。因此，本文所述的发明提供用于在重链臂中ch3变体的使用，其在双特异性抗体表达后减轻同二聚体的生产有利于半体，同时保留双特异性抗体的稳定性，这促进双特异性的纯化并减轻对高通量筛选和分析所需的双特异性抗体的同二聚体干扰。优选地，在ch3结构域中本发明提供的变体减轻同二聚体副产物的量，并增加异二聚体靶分子的形成，以及减轻产生的半体的量，从而增加表达系统的整体效率，并简化从hcp中的靶分子的下游分离。
88.在另一个实施方式中，第一和第二含ch3结构域的多肽链的可变区识别不同的靶表位，而第三和第四含ch3结构域的多肽链的可变区识别相同的靶表位。这将导致一种双特异性ig样分子和一种单特异性ig样分子的主要生产。例如，如果第一和第二含ch3结构域的多肽链的可变区识别不同的靶表位并且如果第三和第四含ch3结构域的多肽链的可变区均识别相同的靶表位，所述相同的靶表位不同于由第一和第二ch3结构域识别的靶表位，则将形成对ab或cc具有特异性的ig样分子的混合物。因此，还提供了根据本发明的方法，其中由第三和第四含ch3结构域的多肽链的可变区识别的靶表位是相同的，但不同于由第一和第二含ch3结构域的多肽链的可变区识别的靶表位。
89.可替代地，当第一和第二含ch3结构域的多肽链的可变区识别不同的靶表位并且当第三和第四含ch3结构域的多肽链的可变区均识别与第一和第二含ch3结构域的多肽链的相同的表位，则将形成对ab和aa或ab和bb具有特异性的ig样分子的混合物。根据本发明的方法，其中由第三和第四含ch3结构域的多肽链的可变区识别的靶表位与由第一或第二含ch3结构域的多肽链的可变区识别的靶表位相同因此也特此提供。
90.在一些实施方式中，本发明的异二聚体多肽是免疫球蛋白样(ig样)多肽。如本文所用的术语
‘
ig样多肽’是指具有至少一个免疫球蛋白(ig)结构域的蛋白质部分。所述ig样多肽包括含有至少免疫球蛋白ch3结构域的功能的序列，优选序列包含igg1 ch3结构域。具有至少ch3结构域的蛋白质部分还可以配备有特异性结合部分。本发明的包含用于优先配对的手段的ch3结构域，因此可用于两个包含ch3结构域的蛋白质部分的优先配对以设计所需的异二聚体结合分子或结合分子的混合物。可以被工程化为包含ch3结构域的蛋白质部
分的结合部分可以是任何结合剂，包括但不限于，单链fvs、单链或串联双体vhh、vhh、fab、锚蛋白重复蛋白或dart、tcr样抗体、dart、tcr样抗体、微蛋白、或在一个实施方式中，结合部分是抗体可变区(vh/vl组合)。作为含ch3结构域的多肽链的部分的可变区优选共享共同轻链。在那种情况下，仅仅可变区的vh不同而在整个可变区中的vl基本相同。
91.可替代地，或此外，其他多肽可以被工程化为本发明的ch3结构域，包括细胞因子、激素、可溶性配体、受体和/或肽。
92.在一个实施方式中，所述ig样多肽包含全长fc主链。在另一个实施方式中，ig样多肽是抗体。这些抗体的可变区优选共享共同轻链，但它们在其vh区可以不同。如本文所用的术语
‘
抗体’是指属于蛋白质的免疫球蛋白家族，包含一个或多个结合抗原上表位的结构域的蛋白质分子，其中这种结构域源于抗体的可变区或与抗体的可变区共享序列同源性。抗体在本领域已知并包括几种亚型，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igd、ige和igm。根据本发明的抗体可以是任何这些亚型，或这些的功能衍生物和/或片段。在一个实施方式中，生产的ig样分子是igg、iga、igd、ige或ige亚型的抗体。在一个实施方式中，生产的ig样分子是igg亚型的抗体，因为igg抗体，例如，具有与其他亚型抗体相比更长的半衰期。
93.用根据本发明的方法生产的抗体可具有任何来源的序列，包括鼠类、禽类，例如鸡和人序列。抗体可由仅来自一种来源的序列组成，如完全人抗体，或它们可具有超过一种来源的序列，导致例如嵌合或人源化抗体。抗体结合可以用特异性和亲和性来表达。特异性决定了结合结构域所结合的抗原或其表位。亲和性是结合到特定抗原或表位的力的衡量。如本文所用的术语
‘
抗原’是指可以结合抗体的抗原结合位点的物质或分子。此外，抗原的混合物可视为
‘
抗原’，本领域技术人员应当理解，肿瘤细胞或病毒颗粒的裂解物可表示为
‘
抗原’，而这种肿瘤细胞裂解物或病毒颗粒制剂存在许多抗原决定簇。抗原包含至少一个，但通常更多个表位。如本文所用的术语
‘
表位’是指通过免疫系统，特别是通过抗体，b细胞或t细胞识别的抗原的部分。
94.术语
‘
ch3结构域’是本领域众所周知的。igg结构具有四条链，两条轻链和两条重链；每条轻链具有两个结构域，可变和恒定轻链(vl和cl)以及每条重链具有四个结构域，可变重链(vh)和三个恒定重链结构域(ch1、ch2、ch3)。重链的ch2和ch3结构域区叫做fc(可结晶片段)部分、fc片段、fc主链或简单fc。igg分子是异四聚体，具有两条通过在铰链区的二硫键(-s-s-)连接到一起的重链和两条通过-s-s-二硫键连接到重链的轻链。重链包括通过在ch3-ch3结构域界面的相互作用和通过在铰链区的相互作用二聚化。铰链二硫键的数量在免疫球蛋白亚型之间不同(papadea和check 1989)。免疫球蛋白分子的fc段是重链的两个c末端恒定区，ch2和ch3结构域的二聚体。其生理功能包括与补体系统和与多种细胞表面的特定受体的相互作用。已知的两条单独重链的ch3结构域之间的相互作用在驱动重链二聚化中起重要作用。因此，ch3结构域指导抗体重链的结合(deisenhofer j.,biochemistry 1981(20)2361-2370；miller s.,j.mol.biol.1990(216)965-973；padlan,advances in protein chemistry 1996(49)57-133)。本发明的ch3变体因此可用于与其他抗体结构域的
结合以产生双特异性或单特异性的全长抗体。由vh/vl组合定义的抗体的特异性通常不影响由ch3结构域驱动的重链二聚化行为。
95.ch3-ch3界面内的接触残基可以是带电荷的氨基酸或在生理条件下中性的氨基酸残基。本文所用的术语
‘
带电荷的氨基酸残基’或
‘
带电荷的残基’是指带有带电侧链的氨基酸残基。这些可以是带正电荷的侧链，如可以存在于精氨酸(arg，r)、组氨酸(his，h)和赖氨酸(lys，k)或可以是带负电荷的侧链，如可以存在于天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)。如本文所用的术语
‘
中性氨基酸残基’或中性残基是指所有不具有带电侧链的其他氨基酸。这些中性残基包括丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、天冬酰胺(asn，n)、谷氨酰胺(glu，q)、半胱氨酸(cys，c)、甘氨酸(gly，g)、脯氨酸(pro，p)、丙氨酸(ala，a)、缬氨酸(val，v)、异亮氨酸(iie，i)、亮氨酸(leu，l)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、酪氨酸(tyr，y)和色氨酸(trp，t)。
96.如本文所用，术语
‘
ch3-ch3结构域界面’或
‘
ch3界面’、
‘
ch3-ch3配对’、
‘
结构域界面’或简单
‘
界面’是指分离的含ch3结构域的多肽的两个ch3结构域之间的结合，其是氨基酸残基相互作用的结果，所述相互作用包括第一ch3结构域的氨基酸和第二ch3结构域的氨基酸之间的至少一个相互作用。这种相互作用是例如通过范德华力、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳香侧链之间的吸引相互作用、二硫键的形成或本领域技术人员已知的其他力。
97.本发明还提供了制备用于至少两个不同的ig样多肽的生产的宿主细胞的方法，所述方法包括引入所述编码至少第一和第二含ch3结构域的多肽链的宿主细胞核酸序列的步骤，其中至少两个所述核酸序列提供了用于所述第一和第二含ch3结构域多肽的优先配对的手段，其中所述核酸序列连续或同时引入。同样地，宿主细胞已经可以引入所述宿主细胞的编码至少第一和第二含ch3结构域的多肽链的核酸序列，其中整合编码可变区的核酸与编码ch3结构域的核酸相邻，使得宿主细胞可用作用于不同的可变区的整合的主细胞，所述可变区用于不同的异二聚体分子的生产，其中至少两个所述编码至少第一和第二ch3结构域的核酸序列为所述第一和第二含ch3结构域的多肽的优先配对提供了手段。
98.本发明的另一方面为制备用于异二聚体多肽的生产的宿主细胞提供了方法，所述方法包括引入宿主细胞所述编码至少第一和第二含ch3结构域的多肽链的核酸序列的步骤，其中所述第一含ch3结构域的多肽链包含带正电的氨基酸残基，其中野生型ch3通常在该位置具有中性氨基酸残基，并且其中所述第二含ch3结构域的多肽链包含带负电的氨基酸残基，其中野生型ch3通常在该位置具有中性氨基酸残基，其中所述核酸序列连续或同时引入。所述用于制备所述宿主细胞的方法优选还包括引入所述宿主细胞编码共同轻链的核酸序列的步骤，或可替代地，所述方法暂时将所述核酸序列整合到已经具有编码共同轻链的核酸序列的宿主细胞中，但优选稳定整合到宿主细胞中。
99.本文也提供了包含编码至少第一、第二、第三和第四含ch3结构域的多肽链的核酸序列的重组宿主细胞，其中至少两个所述核酸为所述第一和第二含ch3结构域的多肽以及所述第三和第四含ch3结构域的多肽提供优先配对的手段。
100.本发明还提供了包含编码至少第一和第二含ch3结构域的多肽链的核酸序列的重组宿主细胞，其中所述第一含ch3结构域的多肽链包含带正电荷的氨基酸残基，其中野生型ch3通常在该位置具有中性氨基酸残基，以及其中所述第二含ch3结构域的多肽链包含带负
电荷的氨基酸残基，其中野生型ch3通常在该位置具有中性氨基酸残基。
101.根据本发明的重组宿主细胞还可包含编码共同轻链的核酸。
102.根据本发明的“宿主细胞”可以是任何能够表达重组dna分子的宿主细胞，包括细菌如，例如埃希菌属(escherichia)(例如大肠杆菌(e.coli))、肠杆菌属(enterobacter)、沙门氏菌属(salmonella)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)，酵母菌如酿酒酵母(s.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、毕赤酵母(p.pastoris)、念珠菌(candida)或解脂耶氏酵母(yarrowia)，丝状真菌如脉孢菌(neurospora)、米曲霉(aspergillus oryzae)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)，昆虫细胞如草地贪夜蛾sf-9或sf-21细胞，并且优选哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、bhk细胞，小鼠细胞包括sp2/0细胞和ns-0骨髓瘤细胞，灵长类细胞如cos和vero细胞，mdck细胞、brl 3a细胞、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、永生化原代细胞，人细胞如w138、hepg2、hela、hek293、ht1080或胚胎视网膜细胞如per.c6等。通常，选择的表达系统将涉及哺乳动物细胞表达载体和宿主，使得抗体可以适当糖基化。人细胞系可用于获得具有完全人糖基化模式的抗体。根据本领域技术人员通常已知的方法，细胞生长或增殖的条件(参见tissue culture,academic press,kruse和paterson,编辑(1973))和重组产物的表达条件可以有些不同，并且通常进行方法的优化以增加产物比例和/或相对于彼此的细胞生长。通常，可以在哺乳动物细胞生物技术：一种实用方法(m.butler,ed.,irl press,1991)中找到用于最大化哺乳动物细胞培养的产量的原则、方案和实用技术。在重组宿主细胞中抗体的表达在本领域中已经被广泛描述。编码轻链和重链的核酸可以作为染色体外拷贝存在和/或稳定嵌入到宿主细胞的染色体中。
103.本发明的另一方面提供了根据本发明的重组宿主细胞的培养或由根据本发明的方法可获得或获得的重组宿主细胞的培养，所述培养生产一种或多种异二聚体多肽。
104.为获得编码含ch3结构域的多肽的核酸序列的表达，本领域技术人员众所周知的是，可以将能够驱动这种表达的序列功能性连接到编码含ch3结构域的多肽的核酸序列。功能性连接旨在描述编码含ch3结构域的多肽或其前体的核酸序列连接到能够驱动表达的序列，使得这些序列可以驱动含ch3结构域的多肽或其前体的表达。本领域中可获得的有用表达载体，例如invitrogen的pcdna载体系列。当参考支配编码多肽的转录和翻译的序列，适当地整合编码感兴趣的多肽的序列时，所得的表达盒可用于生产感兴趣的多肽，称为表达。驱动表达的序列可包括启动子、增强子等以及它们的组合。这些应当在宿主细胞中能够起作用，从而驱动功能化连接到它们的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或受调节的，并且可以从各种来源获得，包括病毒、原核或真核来源，或人工设计的。感兴趣的核酸的表达可以来自天然启动子或其衍生物或来自完全异源启动子。一些用于真核细胞中表达的众所周知并经常使用的启动子包含源于病毒的启动子，如腺病毒，例如e1a启动子，源于巨细胞病毒(cmv)的启动子，如cmv立即早期(ie)启动子，源于猿猴病毒40的启动子(sv40)等。合适的启动子还可以源于真核细胞，如金属硫蛋白(mt)启动子、延伸因子1a(ef-1a)启动子、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。任何能够驱动宿主细胞中感兴趣的序列的表达的启动子或增强子/启动子都适用于本发明。在一个实施方式中，能够驱动表达的序列包含来自cmv启动子的区，优选包含cmv立即早期基因增强子/启动子的核酸
–
735至+95的区。本领域技术人员应当意识到，本发明使用的表达序列可以适当地与可以稳定或增
强表达的元件组合，例如绝缘子、基质附着区、star元件(wo 03/004704)等。这可增强表达的稳定性和/或水平。
105.已经广泛描述了重组宿主细胞中的蛋白生产，例如在current protocols in protein science,1995,coligan je,dunn bm,ploegh hl,speicher dw,wingfield pt,isbn 0-471-11184-8；bendig,1988中。培养细胞以允许其代谢、和/或生长和/或驱动和/或生产感兴趣的重组蛋白。这可以通过本领域技术人员众所周知的方法实现，并且包括但不限于为细胞提供营养。方法包括附着于表面生长、悬浮生长或它们的组合。几种培养条件可以通过本领域众所周知的方法优化以优化蛋白质产量。培养可以在例如盘、烧瓶、滚瓶或在生物反应器中进行，使用分批、分批补料、连续系统、中空纤维等。为通过细胞培养获得大规模的重组蛋白的(连续)生产，使用能够悬浮生长的细胞，并且细胞能够在不存在动物源或人源血清或动物源或人源血清组分的情况下被培养。因此，由于不存在源于培养基的额外动物或人蛋白，纯化更容易并提高了安全性，同时因为合成培养基的最好的重现性，该系统也非常可靠。
106.免疫球蛋白样多肽在宿主细胞中表达并通过本领域技术人员通常已知的方法从细胞中收获，或优选从细胞培养基中收获。收获后，这些ig样多肽可以通过使用本领域已知的方法分离。这种方法可包括沉淀、离心、过滤、尺寸排阻色谱、亲和色谱、阳离子和/或阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱等。对于包含igg多肽的抗体的混合物，可以适当地使用蛋白a或蛋白g亲和色谱(参见美国专利4,801,687和5,151,504)。
107.在使用亲和色谱捕获后，正交抛光步骤用于去除任何剩余的工艺相关的杂质，其可以包括同二聚体、电荷变体、hcp和dna。通常，为获得分离的双特异性抗体或多价多聚体，进行了以下步骤，包括宿主细胞培养、收获澄清，然后是蛋白质捕获、阴离子交换色谱，包括去除宿主细胞dna，然后使用ciex以去除宿主细胞蛋白、浸出的蛋白a和潜在的聚集体，然后进行额外的步骤，如病毒过滤。本领域技术人员知道这些步骤的顺序可以被修改，或单独的步骤被替换或消除。例如，用于第二抛光步骤的替代包括疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
108.根据本发明的方法生产免疫球蛋白样多肽和/或其混合物优选具有共同轻链。因此，还提供的是，根据本发明的方法，还包括提供具有编码共同轻链的核酸的所述宿主细胞。这是能够与至少两条不同重链配对的轻链，从而形成功能抗原结合域。功能抗原结合域能够特异结合到抗原。在一个实施方式中，使用能够与根据本发明的方法生产的所有重链配对的共同轻链，从而形成功能抗原结合域，使得避免不匹配的重链和轻链的错配。一方面，仅使用具有一个相同氨基酸序列的共同轻链。可替代地，本领域技术人员将认识到，“共同”也是指氨基酸序列不相同的轻链的功能等价物。存在许多所述轻链的变体，其中存在基本不影响功能结合域形成的突变(缺失、取代、添加)。这种变体也因此能够结合不同重链并形成功能抗原结合域。如本文所用，术语
‘
共同轻链’因此是指可以相同或具有一些氨基酸序列差异，同时在与重链配对后保留所得抗体的结合特异性的轻链。例如，可以制备或发现不相同但仍然功能等价的轻链，例如通过引入和测试保守氨基酸改变，和/或当与重链配对时，在不或仅部分促进结合特异性的区的氨基酸的改变等。某些共同轻链和这种功能等价变体的组合包含在术语“共同轻链”之内。参考wo 2004/009618对共同轻链的使用的具体描述。优选地，本发明中使用的共同轻链是种系样轻链，更优选种系轻链，优选重排种系人κ轻
链，更优选重排种系人κ轻链igvκ1-39/jκ或igvκ3-20/jκ。共同轻链优选包含如上所述的轻链可变区，具有0-5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或它们的组合。另一个优选共同轻链是人κ轻链igvκ1-39/igjκ5。优选地，本发明的抗体包含人κ轻链igvκ1-39/igjκ5的可变区。另一个优选共同轻链是人κ轻链igvκ3-15/igjκ1。优选地，本发明的抗体包含人κ轻链igvκ3-15/igjκ1的可变区。另一个优选共同轻链是人κ轻链igvκ3-20/igjκ1。优选地，本发明的抗体包含人κ轻链igvκ3-20/igjκ1的可变区。另一个优选共同轻链是人λ轻链igvλ3-21/igjλ3。优选地，本发明的抗体包含人κ轻链igvλ3-21/igjλ3的可变区。
109.可替代地，本领域技术人员可以选择，作为使用共同轻链并且避免不匹配重链和轻链的错配的替代，用于重链和轻链强制配对的手段，例如，如在wo2009/080251、wo2009/080252和/或wo2009/080253中描述的。
110.发明人之前已经描述具有带电残基的ch3氨基酸的表达，其中野生型ch3在该位置具有中性氨基酸残基，使得两个ch3结构域的替代电荷导致稳定的相互作用(例如，第一ch3具有在位置351和366的正电荷残基以及第二ch3具有在位置351和368的负电荷残基)。本发明的变化和修饰的重链可以与以上促进异二聚化的手段或本领域技术人员已知的其他这样做的手段结合。本文公开的发明还提供了促进ch3结构域异二聚化的能力，并且也可以基于在ch3界面的氨基酸残基变体，增加异二聚化的稳定性或降低同二聚体的稳定性，并且优选上述益处的组合。
111.根据本发明的异二聚体与野生型二聚体相比更稳定(野生型二聚体定义为与其同二聚体(aa或bb)相反的没有ch3工程化的双特异性igg(ab))，并且更容易从混合物和杂质中分离。令人惊讶地，甚至可以进一步增加混合物中感兴趣的一种或多种ig样多肽的比例。本领域已知的用于异二聚体(例如双特异性抗体)的优先生产的方法通常涉及一些不需要的二聚体副产物的生产。例如，使用本领域技术人员已知的杵臼结构技术的感兴趣的双特异性抗体的比例据报道最多为87％，而其中用相反电荷的氨基酸取代带电接触氨基酸的静电工程化方法，也导致比例据报道高达96％。本发明人已经成功引入进一步增加感兴趣的异二聚体多肽的比例的变化。
112.本发明涉及包含在位置k360、s364和/或k409至少一个变体残基的ch3结构域。以下将更具体描述这些变体残基。字母后跟数字再跟另外的字母，这表示根据eu编号的残基的天然位置(例如，野生型人fc)中的氨基酸，以及工程化到该位置的残基(例如，k409s，表示存在于野生型fc中位置409的赖氨酸，工程化变体是丝氨酸)。对于eu编号参见例如：http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/hu_ighgnber.html。
113.本发明的一个实施方式提供了用于从单细胞中生产异二聚体多肽的方法，其中所述异二聚体多肽包含在位置k360、s364和/或k409的氨基酸变体，所述方法包括在所述细胞中提供
114.a.编码第一含ch3结构域的多肽链的第一核酸，
115.b.编码第二含ch3结构域的多肽链的第二核酸，
116.其中第一含ch3结构域的多肽包含在位置k360、s364和/或k409的变体，所述方法还包括培养所述宿主细胞和允许所述两种核酸表达以及从培养中收获所述异二聚体ig样多肽的步骤。
117.因此，本发明的一个实施方式提供了异二聚体多肽，其中所述异二聚体多肽包含
两个ch3结构域，其中所述第一含ch3结构域的多肽链包含de氨基酸变体，并且其中所述第二含ch3结构域的多肽链包含kk氨基酸变体以及，其中在所述第一含ch3结构域的多肽链中在一个或多个位置k360、s364和/或k409的一个或多个残基与人野生型残基相比是变体。
118.本发明的一个实施方式提供了用于从单细胞中生产异二聚体多肽的方法，所述方法在所述细胞中提供。
119.a.编码第一含ch3结构域的多肽链的第一核酸，
120.b.编码第二含ch3结构域的多肽链的第二核酸，
121.其中第一含ch3结构域的多肽链包含de和在位置k360、s364和/或k409的另外的氨基酸变体，
122.其中第二含ch3结构域的多肽链包含kk，以及
123.所述方法还包括培养所述宿主细胞和允许所述两种核酸表达以及从培养中收获所述异二聚体ig样多肽的步骤。
124.在另一个实施方式中，在位置k360、s364和/或k409的变体残基与其他异二聚化的变化组合，包含，例如杵臼结构、在ch3区的相反电荷取代或其他本领域技术人员已知的技术。
125.在一个实施方式中，方法还包括提供具有编码共同轻链的核酸的所述宿主细胞的步骤，其具有如本文之前所述的优势。
126.如本文别处所述，所述的异二聚体蛋白包含第一含ch3的多肽和第二含ch3的多肽，其中所述第一含ch3的多肽包含在位置s364、k409和/或k360的另外的氨基酸变体。任选地，第一和第二ch3多肽是人的。
127.例如，本文所述的第一含ch3的多肽可包含s364v氨基酸。
128.可替代地，本文所述的第一含ch3的多肽可包含s364i氨基酸。
129.在另一个实例中，本文所述的第一含ch3的多肽可包含s364t氨基酸。
130.在进一步的实例中，本文所述的第一含ch3的多肽可包含s364q氨基酸。
131.可替代地，本文所述的第一含ch3的多肽可包含s364l氨基酸。
132.本文所述的第一含ch3的多肽可包含在位置k409的氨基酸变体作为替代或除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
133.因此，本文所述第一含ch3的多肽可包含k409i氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
134.可替代地，本文所述的第一含ch3的多肽可包含k409l氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
135.在另一个实例中，本文所述的第一含ch3的多肽可包含k409e氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
136.本文所述的第一含ch3的多肽可包含在位置k360的氨基酸变体作为替代或除氨基酸在位置s364的变体(如以上详细所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)和/或在位置k409的变体(如以上详细所述，例如k409i、k409l或k409e)之外。
137.因此，本文所述的第一含ch3的多肽可包含k360d氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上详细所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外和/或任选地除氨基酸在位置k409的变体(如以上具体所述，例如k409i、k409l或k409e)之外。
138.在一个实例中，异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置s364、k409和/或k360的另外的氨基酸变体。任选地，所述第一含人igg ch3的多肽还包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k。
139.例如，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v氨基酸。
140.可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i氨基酸。
141.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t氨基酸。
142.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q氨基酸。
143.可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l氨基酸。
144.本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含在位置k409的氨基酸变体作为替代或除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
145.因此，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k409i氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
146.可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k409l氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
147.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k409e氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外。
148.本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含在位置k360的氨基酸变体作为替代或除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)和/或在位置k409的变体(如以上具体所述，例如k409i、k409l或k409e)之外。
149.因此，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k360d氨基酸，任选地除氨基酸在位置s364的变体(如以上具体所述，例如s364v、s364i、s364t、s364q或s364l)之外和/或任选地除氨基酸在位置k409的变体(如以上具体所述，例如k409i、k409l或k409e)之外。
150.在一个实例中，所述的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置s364、k409和/或k360的另外的氨基酸变体。
151.因此，在一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置s364的另外的氨基酸变体。
152.在具体实例中，364氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸。
153.在一个实施方式中，364氨基酸是缬氨酸。
154.在一个实施方式中，364氨基酸是异亮氨酸。
155.在一个实施方式中，364氨基酸是苏氨酸。
156.在一个实施方式中，364氨基酸是谷氨酰胺。
157.在一个实施方式中，364氨基酸是亮氨酸。
158.在另一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置k409的另外的氨基酸变体。
159.在具体实例中，409氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
160.在一个实施方式中，409氨基酸是异亮氨酸。
161.在一个实施方式中，409氨基酸是亮氨酸。
162.在一个实施方式中，409氨基酸是谷氨酸。
163.在另一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置k360的另外的氨基酸变体。
164.在具体的实例中，360氨基酸是天冬氨酸。
165.本文所述的氨基酸变体可以指在本发明的异二聚体蛋白的“de”臂内在位置s364、位置k409或位置k360的单个变化。在本发明的另外的实施方式中，异二聚体蛋白具有在选自位置：s364、k409或k360的至少两个变化。在本发明的进一步的实施方式中，异二聚体蛋白具有在位置s364、k409和k360的至少三个另外的变化。
166.因此，在一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置s364和k409的另外的氨基酸变体，其中364氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸以及409氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
167.例如，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v氨基酸和k409i氨基酸。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v氨基酸和k409l氨基酸。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v氨基酸和k409e氨基酸。
168.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i氨基酸和k409i氨基酸。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i氨基酸和k409l氨基酸。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i氨基酸和k409e氨基酸。
169.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t氨基酸和k409i氨基酸。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t氨基酸和k409l氨基酸。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t氨基酸和k409e氨基酸。
170.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q氨基酸和k409i氨基酸。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q氨基酸和k409l氨基酸。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q氨基酸和k409e氨基酸。
171.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l氨基酸和k409i氨基酸。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l氨基酸和k409l
氨基酸。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l氨基酸和k409e氨基酸。
172.在另一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置s364和k360的另外的氨基酸变体，其中364氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸以及360氨基酸是天冬氨酸。
173.例如，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v氨基酸和k360d氨基酸。
174.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i氨基酸和k360d氨基酸。
175.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t氨基酸和k360d氨基酸。
176.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q氨基酸和k360d氨基酸。
177.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l氨基酸和k360d氨基酸。
178.在另一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置k409和k360的另外的氨基酸变体，其中409氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸以及360氨基酸是天冬氨酸。
179.例如，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k409i氨基酸和k360d氨基酸。
180.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k409l氨基酸和k360d氨基酸。
181.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含k409e氨基酸和k360d氨基酸。
182.在另一个实施方式中，所提供的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e以及所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一含人igg ch3的多肽包含在位置s364、k409和k360的另外的氨基酸变体，其中364氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；409氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸；以及360氨基酸是天冬氨酸。
183.例如，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v、k409i和k360d。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v、k409l和k360d。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364v、k409e和k360d。
184.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i、k409i和k360d。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i、k409l和k360d。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364i、k409e和k360d。
185.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t、k409i和
k360d。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t、k409l和k360d。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364t、k409e和k360d。
186.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q、k409i和k360d。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q、k409l和k360d。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364q、k409e和k360d。
187.在另一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l、k409i和k360d。可替代地，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l、k409l和k360d。在一个实例中，本文所述的第一含人igg ch3的多肽可包含s364l、k409e和k360d。
188.在特定实施方式中，360氨基酸是天冬氨酸和364氨基酸是异亮氨酸。
189.在另一个实施方式中，360氨基酸是天冬氨酸和364氨基酸是苏氨酸。
190.在进一步的实施方式中，360氨基酸是天冬氨酸和364氨基酸是缬氨酸。
191.在另一个实施方式中，360氨基酸是天冬氨酸和409氨基酸是谷氨酸。
192.在进一步的实施方式中，364氨基酸是亮氨酸和409氨基酸是亮氨酸。
193.在另一个实施方式中，364氨基酸是苏氨酸和409氨基酸是谷氨酸。
194.可以通过本领域已知的任何合适的手段产生变体多肽。本文所述的变体可以基于人igg ch3结构域，但与本文所述的人igg ch3氨基酸的相应位置具有一个或多个母体氨基酸(在位置360、364和/或409)不同。
195.人igg ch3结构域的序列是本领域众所周知的。通过在多肽中一个或多个氨基酸的不同，改变了在这些位置的侧链。本文所述的氨基酸变化可以通过手段的变化引入编码ch3结构域的核酸或ch3结构域本身，所述手段包括使用分子生物学的遗传手段或通过酶或化学手段。本文所述的用于产生变体的合适的方法是本领域众所周知的。例如，变体核酸可通过编码变体序列的核酸合成从头产生并通过任何数量的供应商订购。相似地，变体核酸可通过本领域众所周知的突变技术产生。如果需要，这种编码变体多肽的核酸随后可以被克隆到宿主细胞、表达和分析。使用众所周知的程序进行这些操作，并且在molecular cloning-a laboratory manual,3rded.(maniatis,cold spring harbor laboratory press,纽约,2001)和current protocols in molecular biology(john wiley&sons)中描述了各种可能使用的方法，通过引用将两者整体并入。编码变体的核酸可以整合到表达载体以表达蛋白。表达载体通常包括与控制或调节序列连接的启动子、可选择的标记、任何融合配偶体和/或额外的元件。在合适的以诱导或引起蛋白表达的条件下，可以通过培养用核酸转化的宿主细胞来产生变体，优选表达载体，所述表达载体包含编码变体的核酸。可以使用多种合适的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如，atcc细胞系目录中描述了多种可以使用的细胞系，所述目录可从美国类型培养物保藏中心获得，通过引用整体并入。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且随使用的宿主细胞变化。
196.在本发明的一个方面，提供了根据本发明的用于生产至少两个不同的ig样分子或用于生产异二聚体ig样分子的方法，其中每种含ch3结构域的多肽链还包含识别不同表位的可变区，其中靶表位位于相同分子上。与其中仅靶向一个表位的情况相比，这通常允许更有效地抵抗所述靶分子的(生物)功能。例如，异二聚体免疫球蛋白样分子可同时结合到存在于，例如对肿瘤细胞增殖至关重要的生长因子受体或可溶性分子上的2个表位，从而有效
阻断几种导致不受控增殖的独立信号通路，并且至少两个ig样分子的任何组合可同时结合到存在于这种生长因子受体或可溶性分子上的2个，或甚至3或4个表位。
197.在一个实施方式中，靶分子是可溶性分子。在另一个实施方式中，靶分子是膜结合分子。
198.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的用于生产一种或多种异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中每种含ch3结构域的多肽链还包含识别靶表位的可变区，其中靶表位位于不同分子上。在这种情况下，每种不同的靶分子可以是可溶性分子或膜结合分子。在一个实施方式中，不同靶分子是可溶性分子。可替代地，一个靶分子是可溶性分子，而第二个靶分子是膜结合分子。在另一个替代方案中，两个靶分子均是膜结合分子。在一个实施方式中，不同靶分子在相同细胞上表达，而在其他的实施方式中，不同靶分子在不同细胞上表达。作为非限制性实例，任何异二聚体免疫球蛋白样分子或至少两个免疫球蛋白样分子的任何组合可适用于同时阻断多种膜结合受体、中和多种可溶性分子如肿瘤细胞的细胞因子或生长因子或中和不同的病毒血清型或病毒株。
199.根据本发明的一个实施方式提供了用于生产一种或多种异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中至少一种所述靶表位位于肿瘤细胞上。可替代地，或此外，至少一种所述靶表位位于效应细胞的表面上。例如，这是适合于募集用于肿瘤细胞杀灭的t细胞或nk细胞。例如，通过特异结合到位于免疫效应细胞上的靶分子，至少一种根据本发明的方法生产的ig样分子能够募集免疫效应细胞，优选人免疫效应细胞。在另一个实施方式中，所述免疫效应细胞在免疫球蛋白样分子结合到靶分子后被活化。例如，效应器机制的募集可包含通过施用根据本发明的方法生产的免疫球蛋白样分子来重定向免疫调节的细胞毒性，所述免疫球蛋白样分子能够结合到细胞毒触发分子如t细胞受体或fcγ受体，从而活化下游的免疫效应通路。如本文所用的术语
‘
免疫效应细胞’或
‘
效应细胞’是指在哺乳动物免疫系统中天然细胞库中的细胞，所述细胞能够被活化以影响靶细胞的活力。免疫效应细胞包括淋巴谱系的细胞如自然杀伤(nk)细胞、包括细胞毒性t细胞的t细胞，或b细胞，而且骨髓谱系的细胞可视为免疫效应细胞，如单核细胞或巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。因此，所述效应细胞优选nk细胞、t细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或中性粒细胞。
200.因此，在本发明的一方面提供了根据本发明的用于生产异二聚体免疫球蛋白样多肽的方法，其中每个含ch3结构域的多肽链还包含识别靶表位的可变区。在一个实施方式中，含ch3结构域的多肽链的2个可变区的每个识别相同靶表位但具有不同亲和力。在另一个实施方式中，含ch3结构域的多肽链的2个可变区的每个识别不同靶表位。在另一个实施方式中，不同靶表位位于相同靶分子上，所述靶分子可以是膜结合分子或可溶性分子。在另一个实施方式中，不同靶表位位于不同靶分子上，所述靶分子可以表达在相同细胞或不同细胞上。可替代地，不同靶分子可以是可溶性分子或一个靶分子可以是可溶性分子，而第二个靶分子是膜结合分子。在一个实施方式中，至少一个异二聚体免疫球蛋白样多肽的靶分子位于肿瘤细胞上。在另一个实施方式中，至少一个异二聚体ig样多肽的靶分子位于效应细胞上。
201.在一个实施方式中，提供了根据本发明的用于生产一种或多种异二聚体免疫球蛋白样多肽的方法，其中所述多肽是抗体。在一个实施方式中，抗体是igg、iga、igd、ige或igm亚型。在一个实施方式中，抗体是igg亚型。在另一个实施方式中，抗体是igg1亚型。
202.还提供的是根据本发明的方法可获得的异二聚体免疫球蛋白样多肽或至少两个ig样多肽的混合物。所述异二聚体多肽或多肽的混合物包含两个ch3结构域，其中所述两个ch3结构域的一个包含氨基酸变体l351d和l368e并且其中所述两个ch3结构域的另一个包含氨基酸变体t366k和l351k，所述氨基酸变体包括野生型ch3序列的一种或多种变体，其增强异二聚化和/或使同二聚体形成不稳定，并且优选实现这些益处的组合，所述氨基酸变体包含根据eu编码在位置360、364和409的变化。
203.如前所述，这些氨基酸变体引起所述两个ch3结构域的优先配对。在所述两个ch3结构域的一个中的氨基酸变体l351d和l368e以及在所述两个ch3结构域的另一个中的氨基酸变体t366k和l351k，在本文中一起称为dekk。具有氨基酸变体l351d和l368e的ch3结构域也被称为
‘
de侧’、“de臂”或“de”以及具有氨基酸变体t366k和l351k的ch3结构域也被称为
‘
kk侧’、“kk臂”或“kk”。本文所述的氨基酸变化(在位置k360、s364和/或k409)可以单独引入或优选与其他变化引入，以促进异二聚化，并且更优选在dekk主链上，并且更优选在de侧上。然而在氨基酸位置360、364和409的变体能够增强异二聚体的稳定性和/或使同二聚体不稳定。
204.也提供的是药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的任何方法可获得的异二聚体免疫球蛋白样多肽或至少两个多肽的混合物。在一个实施方式中，异二聚体多肽是抗体或多价多聚体。所述药物组合物可包含异二聚体免疫球蛋白样多肽，或至少两个包含单特异性或双特异性ig样分子的多肽的混合物，或单特异性和双特异性ig样多肽的组合。此外，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的载体。如本文所用，这种
‘
药学上可接受的载体’包括生理上相容的溶剂、盐、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。取决于施加途径(例如，静脉内、皮下、关节内等)，ig样多肽可以用材料涂覆以保护ig样多肽免受酸和其他可能使ig样多肽失活的自然条件的作用。
205.在一个实施方式中，本发明提供了异二聚体抗体，所述异二聚体抗体包含具有第一人igg ch3区的第一重链和具有不同于第一人igg ch3区的第二人igg ch3区的第二重链，其中第一人ch3区包含igg ch3氨基酸变体l351d和l368e以及第二人ch3区包含人igg ch3氨基酸变体t366k和l351k，并且其中第一人igg ch3区在位置k360、s364或k409包含另外的氨基酸变体。异二聚体抗体优选包含一条或多条抗体轻链。第一和第二人igg ch3区优选是人igg1、igg2、igg3或igg4区。第一和第二人igg ch3区优选是igg1 ch3区。第一重链可包含不同于第二重链的重链可变区的重链可变区。包含与合适轻链相关的不同重链可变区的抗体可变结构域可结合不同表位和/或抗原。第一重链和/或第二重链可包含多于一个可变区。包含一条或两条具有多于一个可变区的重链的异二聚体抗体可与合适的互补可变区一起形成三个或更多个可变结构域。具有两个或更多个结合不同表位和/或抗原的可变结构域的异二聚体抗体也称为双、三、四等特异性抗体。这种抗体也统称为多特异性抗体。
206.为了清楚并简要描述的目的，本文将特征描述为相同或分开的实施方式的部分，然而，应当理解，本发明的范围可包括具有所述所有或一些特征的组合的实施方式。
207.进一步通过以下实施例说明本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明，而仅用于阐明本发明。
208.除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。此外，如本文所用，单数术语“一个”、“一种”包括复
数指代。除非另有说明，否则核酸以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左到右书写。应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能随本领域技术人员所用的背景而变化。
209.本发明的方面由以下非限制性实施例证明。
210.实施例
211.实施例1：计算机预测
212.包含dekk(l351d、l368e/l'351k、t'366k)的人igg fc变体用作起始模型。wo2013/157954；de nardis et al,j.biol.chem.(2017)292(35)14706
–
14717。在计算机上进行结构研究以鉴别在ch3 dekk/dede界面中的关键接触残基。使用高歧义驱动蛋白质-蛋白质对接(high ambiguity driven protein-protein docking)(haddock，一种模拟生物分子复合物对接的信息驱动的对接方法，例如蛋白质或核酸)分析这些残基以识别显著减少dede同二聚体形成的变体，而不会显著负面影响或提高dekk界面的稳定性。总共选择了18个人igg ch3变体用于体外分析，均在dekk背景下。18个变体的每个在人igg de ch3结构域在以下位置之一具有不同的变体氨基酸：k360、s354、s364或k409。
213.实施例2：体外sds-page实验
214.除l351d、l368e(de)突变之外，还生成了ch3中具有所有建议变体的igg载体。为此目的，生成了18个构建体。使用单个de*重链以及de*和kk重链的组合转染进行生产，其中*表示上述18种变化之一。使用bspei和aflii限制酶将构建体克隆到mg1122c1708(图1)中。在连接产物上进行菌落/序列pcr以检索所有变体。少量制备所有确认的变体，然后通过测序以确认ch2、ch3和vh身份。将单个de*构建体(标记为pgxxxx igg)以及与带有不同vh的kk构建体组合的de*构建体(标记为pbxxxxx双特异性igg)转染到293ff细胞中。孵育7天后(37℃，8％co2，155rpm)，收集细胞上清液，然后进行蛋白a纯化(酸性洗脱)和缓冲液交换至pbs ph 7.4。因此，用octet测量样品的igg浓度。
215.sds-page分析
216.用非还原sds-page分析所有生产和纯化的igg。对于每个生产板，在每个孔中上样相同量的igg样品，通常上样1μg(如果这不可能，则将量调整为具有最低浓度的样品)。这允许在样品之间进行直接比较。用肉眼检查凝胶的全部igg和半体含量。chemidoc mp imager软件也可用于量化每个凝胶中全部igg和半体的相对量。
217.单(pgxxxx)转染中的大量半体表示变体同二聚体不稳定。双转染(pbxxxxx)中igg条带证实形成了异二聚体。
218.选择在单转染中主要形成半体(与包含kk ch3区的mg4539c1452对照样品相比)以及在双特异性转染中主要形成完整igg的de*-ch3变体，以在后续研究中进行进一步表征(图2至图4和表1)。与对照样品(k360、s364和k409)相比，计算机中鉴定的总共四个位置的三个在体外具有提高的特性。总共选择了9个变体进行进一步研究。
[0219][0220]
表1：sds-page实验中观察到的结果总结。所有都在包含de的ch3的背景下。
[0221]
sds-page实验之后，进行了进一步的计算机haddock分析，以鉴定与对照组相比可以进一步提高的有潜在希望的双变体(表2，第10至15行)。
[0222]
ꢀꢀ
实验结果#dekk参照1k360d在双特异性生产中的半体较少2s364i在单次生产中的半体较多3s364q在单次生产中的半体可能较多4s364t在单次生产中的半体较多5s364v在单次生产中的半体较多6s364l在单次生产中的额外条带7k409i在单次生产中的半体较多8k409l在单次生产中的额外条带9k409e在单次生产中的额外条带10s364i/k360d以下描述后续实验11s364t/k360d以下描述后续实验12s364t/k409e以下描述后续实验13k360d/k409e以下描述后续实验14s364v/k360d以下描述后续实验15s364l/k409l以下描述后续实验
[0223]
表2：选择用于进一步研究的突变总结
[0224]
总之，在ch3的de臂的3个位置上总共产生了18个变体。实施单转染以获得同二聚体，以及实施具有共同kk臂的双转染以获得双特异性igg。sds-page分析表明，5个dekk变体比dekk对照样品在单臂生产中显示更多的半体污染物。由于双特异性igg在双转染实验中的结果，尽管在单次生产中的sds-page结果异常，但仍选择了进一步的3个变体。使用haddock分析表现良好的突变组合，从中选择了6个额外的组合进行进一步分析。
[0225]
实施例3：体外稳定性结果和生物物理学表征
[0226]
生产15个选定的变体作为双特异性(cd137(mf6744
–
之前发表在美国公开第2020/0017595a1号；us公开第2019/00352401a2号中)x纤维蛋白原(mf1122))，de:kk的比率为1:1
和3:1，其中过度表达de臂以研究其同二聚体形成。
[0227]
进一步使用ciex-hplc(阳离子交换-高效液相色谱)、hp-sec(高效尺寸排阻色谱)和nms(原生质谱)技术表征igg。此外，分析解链和聚集温度tm和tagg进行稳定性分析。选择显著减少同二聚体形成并且如通过高tm/tagg所示，表现良好的fc稳定性的变体用于大规模蛋白生产。
[0228]
使用的vh重量不同(重量单克隆igg mf1122 144905和mf6744145932kda)并因此可以在nms上分离同二聚体和异二聚体。它们在ciex rt(13.3min和9.7min)上不同并因此可以在ciex中分离同和异二聚体，特别是因为它们将分别与kk和de结合。fab具有高tm。高tm fab允许鉴别变体ch3的解链温度(tm)。
[0229]
使用uncle仪器(unchained labs产品代码200-1037)在tm/tagg分析中分析产生的dna比率1:1的igg。解链温度(tm)通过跟踪氨基酸在温度升高后的固有荧光变化来确定(光谱范围250-720nm)。聚集温度(tagg)通过测定tm的同时测量静态光散射(sls)来确定，使用266nm和473nm的波长的激光并以90
°
角检测散射光。dls(动态光散射)分析是使用用于tm/tagg测定的以0.3℃/min的速率的25℃-95℃的线性温度斜坡，通过荧光和sls采集(blue&uv，曝光时间1000ms，uv266：过滤器4，blue473：过滤器3)进行的。
[0230]
这允许以1:1的kk:de比率测定非加压样品的tm/tagg。所有样品为300μg/ml，如表4所示。
[0231]
压力测试
[0232]
通过对修饰的igg加压进行小型稳定性分析，这些分析均在pbs中进行。
[0233]
每个样品的三个100μl等分试样以300μg/ml产生(如表3所示)。
[0234]
以下压力施加到样品：
[0235]-5x ft(冻融)(样品在-80c反复储存至少1小时，然后在室温下完全解冻)；
[0236]-在50℃下2天(将样品放入在50℃的水浴或温育箱中温育2天)；
[0237]-在4℃储存(作为非加压对照)。
[0238]
随后用dls分析加压样品，直接与非加压样品(保持在4℃)比较，以确定样品中聚集体的存在。
[0239]
虽然观察到变体在tm/tagg中存在一些差异，但它们均被认为是稳定的分子(表3和4)。
[0240][0241]
表3：dls结果的总结，pk1＝峰1，pk2＝峰2，dia＝直径
[0242]
[0243][0244]
表4：使用uncle设备产生的tm结果总结。注意，这里所有测试的样品都具有pbcode pb31852作为其唯一标识编号(例如p33、p34等)的前缀。例如在表5中为简单起见，该命名法也缩写为实施例部分中的唯一标识编号(例如pb31852p33缩写为p33)。例如，在表3中可以找到对应于每个唯一标识的变体氨基酸的详细信息。
[0245]
hp-sec
[0246]
根据本领域已知的标准方法在hp-sec上分析产生的igg。agilent1260系列hplc系统，tosoh tsk-gel g3000swxl cat#808541，带有tosoh tsk保护柱swxl cat#808543，运行缓冲液：200mm napo4、50mm nacl，ph 7.0，上样量为20μg。与dls分析相比，hp-sec分析用于检测更小的聚集体(表5)，并在1x f/t循环后进行，以代表在-80℃下储存后通常用于实验的样品。
[0247]
[0248][0249]
表5：hp-sec的结果总结(其中p48和p64是对照de臂)，主峰代表biclonics和/或同源二聚体igg，迟延洗脱峰包含半体。
[0250]
压力测试表明，dekk变体相当稳定，仅在严重加压后才显示聚集。
[0251][0252]
表6：在样品保持在4℃后，hp-sec的结果总结
[0253]
[0254][0255]
表7：在样品加热到50℃持续2天后，hp-sec的结果总结
[0256][0257]
表8：在样品5x冻融后，hp-sec的结果总结
[0258]
ciex-hplc
[0259]
在ciex-hplc上分析产生的igg。agilent 1260系列hplc系统，tosoh tskgel sp-stat柱cat#21964，使用的缓冲液：a)25mm napo4，ph 6.0和b)25mm napo4，1m nacl，ph 6.0，以0.5ml/min使用0-30％的缓冲液b的线性梯度分析(每毫升增加2％ b)，上样10μg样品。分析产生的谱的峰形、保留时间，双特异性/污染物比率以及双特异性和污染物之间的分离(在3:1转染样品中最显著)。wt pg1122和wt pg6744之间的分离为～3.7min，其通过kk/de和其他变体增加。如预期的，wt dekk ctrl.在10.25(biclonic)和7.8min(dede同二聚体)
处显示出峰。1:1或1:3产量的比率具有几乎相同的保留时间(rt)值。
[0260]
虽然一些样品在一次或两次生产中显示了由dede同二聚体组成的早期洗脱种类，但其他样品没有任何可检测的早期洗脱种类。
[0261]
最值得注意的是，在s354q变体(两次生产)、s364t变体和wt(3:1生产)中观察到大量早期洗脱种类，但所有其他样品的含量均《10％。所有样品均显示前峰。与主峰的高度相比，在1:3生产中观察到较大的前峰，其比率在1:1生产中观察到的峰大了约3倍。不希望受限于该理论，本发明人认为de*半体种类不与柱结合并在“前峰”(柱的死体积)中洗脱，这是由于额外的负电荷存在于一些变体中。
[0262]
许多变体在防止同二聚体形成中非常成功，并且从缺乏早期洗脱峰明显看出。
[0263]
总之，对于产生的18个igg中的15个，根据ciex-hplc，即使在(修饰的)de-臂的3:1过表达中，也只有非常少量或不存在量的dede同二聚体。这表明与dekk对照相比，大多数额外的变体成功地预防或减轻了同二聚体的形成(表9)。
[0264][0265][0266][0267]
表9：ciex-hplc的结果总结；rt＝保留时间，电荷差＝与原始de构建体相比的额外(负)电荷，空白栏：无检测峰(1％阈值)
[0268]
labchip
[0269]
为了确定biclonic生产的样品中igg(dekk+dede)和半体的量，使用了labchip。perkin elmer labcihp gxii touch ht使用protein clear hr试剂盒(cat#cls960014)和蛋白表达分析labchip(cat#760499)，根据制造商的说明进行分析，样品浓度为0.3μg/μl。观察到变体之间的de半体形成显著不同，并且如预期的，3:1生产包含更多的de半体(表10)。
[0270][0271]
表10：labchip的数据总结
[0272]
nms
[0273]
对于所有产生的igg，在nms分析中分析100μg/样品(方法参见rosati et al,anal chem.2012aug 21；84(16):7227-32)。研究了各个种类(双特异性、同二聚体、半体)之间的相对比率。
[0274]
成功分析了所有16个样品，并且通过该技术可以鉴别出igg种类。对照dekk样品在1:1生产中导致95％双特异性。在1:1生产中，dekk变体异二聚体形成的百分比从74％至100％不等。总共12个样品包含》90％ dekk异二聚体。与dekk对照相比，同二聚体形成在14个样品中显著减少。在3:1生产中，形成了8个样品≤2％ dede同二聚体。
[0275]
总之，在3:1生产中。14个变体显著减少了同二聚体形成(与dekk对照相比)并且形成了8个变体几乎没有同二聚体(表11)。
[0276][0277][0278]
表11：nms的结果总结
[0279]
结果总结
[0280]
使用不同的方法检测了半体：-labchip、hp-sec和nms。虽然获得的值在绝对值上不同以及nms检测出比其它方法更少的半体，但关于变体在减少dede同二聚体形成方面的功用的最终结论是一致的(表12)。对于dekk、igg衍生的污染物和聚集体，使用了不同技术表征样品，并且虽然这些值在绝对值上不同，但从获得的数据中可以得出一致结论(表13-15)。
[0281]
变体labchip％半体3：1hp-sec％半体3：1nms～％半体3：1de+s364v38.2841.6327.7de+s364l20.1620.616.8de+s364i33.338.8725.0de+s364t27.7830.3621.7de+k409i42.7844.8530.0de+k409l10.8514.949.8de+k409e14.3116.5812.5de+s354q6.367.666.0
de+s364t_k409e37.4440.2627.2de+k360d_s364i35.344.3726.1de+k360d_s364t22.6231.0118.4de+k360d_s364v41.8444.1129.5de+k360d_k409e12.513.3911.1de+s364l_k409l20.879.9617.3de+s364t_k409e39.4240.8528.3仅de8.5111.027.8
[0282]
表12：通过个同实验方法进行半体形成测定的概述
[0283][0284][0285]
表13：如通过ciex和nms测定的同二聚体形成的概述
[0286][0287][0288]
表14：如通过ciex和nms测定的同二聚体形成的概述
[0289]
[0290][0291]
表15：如通过dls和hp-sec测定的稳定性分析的概述
[0292]
总之，基于在异二聚体多肽的ch3界面的变化，本文提供的变体增加了异二聚体稳定性并减少了同二聚体形成。
[0293]
实施例4：
[0294]
表16列出了变体在dekk异二聚体形成(就产量、纯度和de污染物的形成方面)上的影响，如果有，进一步研究。在这个具体的实施例中，具有在de重链中的变体的双特异性蛋白以如提及的不同的de:kk比率与含kk的重链一起生产，使用蛋白-a纯化和通过ciex分析以及通过labchip/sds-page分析。
[0295]
克隆：
[0296]
使用sfii和xhoi将de侧的抗tt和kk侧的抗cd3的vh序列克隆到包含以下变体的载体中：k360d_k409e(seq id no:12)、s364l_k409l(seq id no:14)、s364l(seq id no:2)和s364t_k409e(seq id no:13)。对连接产物进行菌落/序列pcr以检索所有变体。少量制备所有确认的变体，然后测序。igg通过将单个de*构建体(标记为pgxxxx igg)和以不同的de:kk比率(表16)的de*构建体与kk构建体组合(标记为pbxxxxx双特异性igg)转染到293ff细胞生产。温育7天后(37℃，8％co2，155rpm)，收集细胞上清液，然后进行蛋白a纯化(酸性洗脱)以及缓冲交换至pbs ph 7.4。测量样品的igg浓度。随后通过hp-sec、ciex和lab-chip/sds-page表征蛋白。
[0297]
#变体de：kk比率1dekk 2dekk2∶13dekk1∶14dekk1∶2
5dekk 6k360d k409e 7k360d k409e2∶18k360d k409e1∶19k360d k409e1∶210s364l k409l 11s364l k409l2∶112s364l k409l1∶113s364l k409l1∶214s364l 15s364l2∶116s364l1∶117s364l1∶218s364t k409e 19s364t k409e2∶120s364t k409e1∶121s364t k409e1∶2
[0298]
表16：在24孔格式上的双特异性和单臂的生产
[0299]
hp-sec：
[0300]
根据实施例3中所述的方案，通过hp-sec分析单臂生产。使用相似量的每种igg，但不少于10ug。对于所有变体，de臂在天然条件下以》75％半体、～10-20％同二聚体和一些聚集体的形式运行(表17)。
[0301][0302]
表17：单臂生产的hp-sec分析
[0303]
ciex分析
[0304]
通过ciex分析igg蛋白(实施例3中所述的方案)。作为对照，分析单臂生产以能够分配双特异性样品中检测到的峰。对于所有样品，调节注入的蛋白量。对于每种样品，将包含单臂的样品的蛋白量调节到5ug。在浓度过低的情况下注入最大可能体积(100ul)。具有抗tt重链(vh；seq id no:16)的wt-de同二聚体的预期保留时间(rt)是13min；具有抗cd3重链(vh；seq id no:17)的kk半体的rt是26min。kk-kk二聚体的保留时间使其洗脱太晚而无法被检测。样品中组分的定量没有考虑前峰。将属于同一种类(pb、de或kk)的峰相加并作为一个值相加。从ciex柱洗脱的样品组成是基于每种峰面积的百分数。
[0305]
当比较相同的比率时，对于所有研究的变体，在测试条件下提高了异二聚体的纯度(表18)。改变de:kk比率的影响使得kk dna增加，从而增加了kk多肽的翻译，导致de污染物的减少。
[0306][0307]
表18：单臂生产的ciex分析
[0308]
在单臂生产中，减少了变体的dede同二聚体并增加了de半体(表19)。结果与使用hp-sec产生的数据一致。
[0309][0310]
表19：对于单臂生产的labchip/sds-page
[0311]
变体对纯度的影响
[0312]
使用ciex结果估计每个样品中存在的双特异性蛋白的量，以了解双特异性蛋白的纯度。在包括蛋白a纯化的这个实施例中，提高了异二聚体pb蛋白的纯度。通过增加de:kk比率提高纯度(表20)。
[0313][0314]
表20：测试的变体对纯度的影响
[0315]
使用的序列：
[0316]
》mv1708_de_s364v[seq id no:1]
[0317]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcgtcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
[0318]
》mv1708_de_s364l[seq id no:2]
[0319]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
[0320]
cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa
[0321]
agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcct
[0322]
gcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctc
[0323]
ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg
[0324]
tgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgc
[0325]
gaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc
[0326]
cggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctc
[0327]
tatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgct
[0328]
ccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccg
[0329]
ggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
[0330]
》mv1708_de_s364i[seq id no:3]
[0331]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc
[0332]
tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
[0333]
cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa
[0334]
agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcct
[0335]
gcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctc
[0336]
ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg
[0337]
tgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcatcctgacctg
[0338]
cgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcag
[0339]
ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcct
[0340]
ctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc
[0341]
tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcc
[0342]
gggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
[0343]
》mv1708_de_s364t[seq id no:4]
[0344]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc
[0345]
tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
[0346]
cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa
[0347]
agccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcct
[0348]
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[0349]
ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg
[0350]
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[0351]
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[0352]
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[0353]
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[0354]
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[0355]
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[0356]
》mv1708_de_s364q[seq id no:5]
[0357]
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[0358]
tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
[0359]
cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa
[0360]
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读者的注意力是针对与本技术有关的与本说明书同时或之前提交的并且与本说
明书一起公开供公众查阅的所有文献和文件，以及所有这些文献和文件的内容通过引用并入本文。
[0483]
本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或工艺的所有步骤，可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些这种特征和/或步骤是互斥的组合。
[0484]
本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的每种特征，可以通过服务于相同、等价或类似目的的替代特征代替，除非另有明确说明。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每种特征仅是通用系列的等价或相似特征的一个实例。
[0485]
本发明不限于任何前述实施方式的细节。本发明延伸至在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的特征的任何新的一种或任何新的组合，或者如此公开的任何方法或工艺的步骤的任何新的一种或任何新的组合。

技术特征：
1.一种分离的异二聚体蛋白，所述分离的异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中，所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e并且所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，并且其中，所述第一含人igg ch3的多肽在位置s364、k409和/或k360包含另外的氨基酸变体。2.根据权利要求1所述的分离的异二聚体蛋白，其中：a)364氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；和/或b)409氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸；和/或c)360氨基酸是天冬氨酸。3.根据权利要求1或2所述的分离的异二聚体蛋白，其中，所述异二聚体蛋白包含人igg1、igg2、igg3或igg4 ch3区。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的异二聚体蛋白，其中，所述异二聚体蛋白包含人免疫球蛋白fc区，任选地其中，所述人免疫球蛋白fc区包含igg1、igg2、igg3或igg4 fc区。5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的异二聚体蛋白，其中：a)第一含ch3的多肽是抗体重链；和/或b)第二含ch3的多肽是抗体重链；和/或c)所述异二聚体蛋白还包含一条或多条抗体轻链；和/或d)所述抗体轻链是共同抗体轻链。6.一种药物组合物，包含权利要求1-5中任一项所述的分离的异二聚体蛋白。7.一种分离的核酸，编码权利要求1-5中任一项所述的第一含人iggch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽。8.一种重组宿主细胞，包含权利要求7所述的分离的核酸。9.一种生产权利要求1至5所述的分离的异二聚体蛋白的方法，包括在允许所述第一含人igg ch3的多肽和所述第二含人igg ch3的多肽的表达的条件下，培养权利要求8所述的重组宿主细胞。10.一种用于提高异二聚体蛋白的稳定性的方法，所述异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e，所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，所述方法包括在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入所述第一含人iggch3的多肽中。11.一种用于降低同二聚体蛋白的稳定性的方法，所述同二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽，所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e，所述方法包括在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入所述第一含人igg ch3的多肽中。12.一种用于提高异二聚体蛋白的产量的方法，所述异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中，所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e并且所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，所述方法包括在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入所述第一含人igg ch3的多肽中。13.一种提高异二聚体蛋白的纯度的方法，所述异二聚体蛋白包含第一含人igg ch3的多肽和第二含人igg ch3的多肽，其中，所述第一含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体l351d和l368e并且所述第二含人igg ch3的多肽包含氨基酸变体t366k和l351k，所述方法包括
(a)在位置s364、k409和/或k360将氨基酸变体引入所述第一含人igg ch3的多肽中；以及(b)使所述异二聚体蛋白经受离子交换色谱。14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中：a)364氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；和/或b)409氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酸；和/或c)360氨基酸是天冬氨酸。15.一种通过权利要求9所述的方法生产的异二聚体蛋白。

技术总结
本发明提供了一种用于生产IG样分子的方法和手段。本发明涉及可用于治疗人类疾病的异二聚体蛋白及其生产和收集方法。二聚体蛋白及其生产和收集方法。二聚体蛋白及其生产和收集方法。


技术研发人员：科内利斯
受保护的技术使用者：美勒斯公司
技术研发日：2021.05.20
技术公布日：2023/7/25