一种负载CCL25趋化因子与抗PDL1抗体的海藻酸钙水凝胶体系的构建及应用

一种负载ccl25趋化因子与抗pdl1抗体的海藻酸钙水凝胶体系的构建及应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤治疗药物领域，具体涉及一种负载ccl25趋化因子与抗pdl1抗体的海藻酸钙水凝胶体系的构建及应用。


背景技术：

2.近年来，免疫检查点阻断(icb)抗体、嵌合抗原受体(car)t细胞和肿瘤疫苗等免疫疗法在临床上取得巨大进展，使得免疫治疗成为多种恶性肿瘤的一线治疗方法。值得注意的是，这些免疫疗法的治疗效果极度依赖于t细胞的功能。例如，在某些类型的肿瘤中，cd8
+
t细胞浸润不足会导致icb抗体疗法的临床应答率低下。即使肿瘤组织中含有充分浸润的t细胞，这些t细胞的功能障碍或与肿瘤细胞的免疫逃逸也会导致治疗失败。因此，调控效应t细胞在肿瘤组织中的迁移、浸润和功能(细胞毒性、细胞因子释放)可能对免疫治疗效果和癌症预后产生积极影响。
3.近期的报道表明，ccr9
+
cd8
+
t细胞亚群，可以引发强大的抗肿瘤效果，从而有效地治疗肿瘤。然而，一般情况下ccr9
+
cd8
+
t细胞主要分布于胸腺和小肠中，在肿瘤组织中浸润比例很低。此外，ccr9
+
cd8
+
t细胞也表现出pd-1表达的增加，这使得高表达pd-l1的肿瘤细胞会通过pd-1/pd-l1轴的相互作用逃逸t细胞的杀伤。pd-1/pd-l1相互作用会抑制肿瘤浸润t细胞的增殖、存活和功能，最终导致肿瘤浸润t细胞的凋亡以及肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，增强ccr9
+
cd8
+
t细胞在肿瘤组织中的浸润同时提高其对肿瘤细胞的杀伤能力能够显著改善对肿瘤的抑制效果。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供一种水凝胶。
5.本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的水凝胶的制备方法。
6.本发明第三方面的目的，在于提供一种水凝胶体系。
7.本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的水凝胶、本发明第二方面的制备方法和/或本发明第三方面的水凝胶体系的应用。
8.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一个方面，提供一种水凝胶，包括凝胶基底以及负载于所述凝胶基底上的物质，所述物质包括趋化因子和/或抗pdl1抗体。
10.优选地，所述抗pdl1抗体为经过金刚烷修饰后的抗pdl1抗体。
11.优选地，所述经过金刚烷修饰后的抗pdl1抗体的制备方法包括以下步骤：
12.1)利用1-金刚烷甲酰氯对羧基化的peg进行修饰，得到金刚烷修饰的聚乙二醇；
13.2)将金刚烷修饰的聚乙二醇与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二甲基亚砜混合，第一次反应，加入抗pdl1抗体，第二次反应，得到金刚烷修饰后的抗pdl1抗体。
14.优选地，所述第一次反应的条件为2～6℃搅拌反应20～50min；进一步为2～4℃搅拌反应20～40min；更进一步为2～4℃搅拌反应30～40min。
15.优选地，所述第二次反应的条件为2～6℃搅拌反应10～14h；进一步为2～4℃搅拌反应11～13h；更进一步为2～4℃搅拌反应11～12h。
16.优选地，步骤1)具体包括：羧基化的peg、三乙胺和四氢呋喃混合，得到溶液a；1-金刚烷甲酰氯与四氢呋喃混合，得到溶液b；将溶液b缓慢滴加至溶液a，持续滴加3～4h，得到金刚烷修饰的聚乙二醇。
17.进一步优选地，所述羧基化的peg、三乙胺和1-金刚烷甲酰氯的摩尔比为1:1～2:1～2。
18.进一步优选地，所述三乙胺为经五氧化二磷回流除水后的三乙胺。
19.进一步优选地，所述四氢呋喃为经除水操作后的四氢呋喃。
20.进一步优选地，所述步骤1)还包括过滤、乙醚沉淀步骤。
21.进一步优选地，所述乙醚沉淀为采用-20℃下的无水乙醚进行沉淀。
22.优选地，2)中所述金刚烷修饰的聚乙二醇、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、抗pdl1抗体的质量比为1～2:0.05～0.1:0.05～1:1；进一步为1.5～2:0.05～0.8:0.05～0.9:1；更进一步为1.66:0.06:0.08:1。
23.优选地，所述凝胶基底为海藻酸钠、卡波姆、羧甲基壳聚糖、环糊精修饰的海藻酸钠中的一种或多种。
24.优选地，所述凝胶基底为环糊精修饰的海藻酸钠；进一步为β环糊精修饰的海藻酸钠。
25.优选地，所述β环糊精修饰的海藻酸钠由海藻酸钠与β环糊精发生酯化反应制备得到。
26.优选地，所述β环糊精修饰的海藻酸钠的制备方法包括以下步骤：将海藻酸钠分散于n,n-二甲基甲酰胺中，并加热至40～60℃；加入甲苯磺酸，搅拌反应20～30min；加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和β-环糊精，搅拌反应20～26h；洗涤，即得到β环糊精修饰的海藻酸钠。
27.进一步优选地，所述海藻酸钠、甲苯磺酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、β-环糊精的质量比为1:1～1.5:0.5～1:0.1～0.5；进一步为1:1～1.3:0.6～1:0.1～0.2；更进一步为1:1.3:0.96:0.1。
28.优选地，所述趋化因子为cxc趋化因子、cc趋化因子、cx3c趋化因子和c趋化因子中的一种或多种。
29.优选地，所述趋化因子包括ccl1、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl6、ccl7、ccl8、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、cl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl9、cxcl8、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、il8、xcl1、xcl2和cx3cl1中的一种或多种。
30.优选地，所述趋化因子为cc趋化因子；进一步为ccl25。
31.本发明第二个方面，在于提供本发明第一方面地水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将凝胶基底、负载于所述凝胶基底上的物质混合，反应，即得到水凝胶。
32.优选地，所述反应为将凝胶基底、负载于所述凝胶基底上的物质的混合物于cacl2溶液中反应。
33.优选地，所述凝胶基底与所述负载于所述凝胶基底上的物质的质量比为1:0.00001～0.5；进一步为1:0.00001～0.4；更进一步为1:0.00001～0.3。
34.优选地，所述凝胶基底与所述cacl2的质量浓度比为1:0.1～0.5；进一步为1:0.2～0.5；更进一步为1:0.3～0.5。
35.本发明第三个方面，在于提供一种水凝胶体系，包括本发明第一方面的水凝胶和抗pdl1抗体。
36.优选地，所述抗pdl1抗体为经过金刚烷修饰后的抗pdl1抗体。
37.优选地，所述水凝胶通过病灶处(瘤内)给药的方式进行，所述抗pd1抗体通过静脉给药的方式进行。
38.负载ccl25趋化因子与apdl1抗体的水凝胶(alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
)，其能够通过招募、固定和再活化，多层次地促进t细胞的抗肿瘤功能来调节免疫微环境，从而显著促进该体系的抗肿瘤效果。该策略主要通过βcd修饰的海藻酸钠(alg-βcd)水凝胶来实现，该水凝胶可以负载趋化因子ccl25，并且具有丰富的的超分子结合位点βcd。负载于水凝胶中的趋化因子ccl25能够招募ccr9
+
cd8
+
t细胞进入肿瘤组织。同时水凝胶中的βcd能够将ad-apdl1抗体固定于水凝胶中。此外，通过尾静脉注射的ad-apd1能够结合在ccr9
+
cd8
+
t细胞表面，以“搭便车”的形式被招募进入肿瘤组织中，并进一步固定在alg-βcd水凝胶中。然后，固定的ad-apdl1和ad-apd1促进了cd8
+
t细胞和肿瘤细胞的相互作用，并恢复cd8+t细胞的杀伤功能与活力。基于这一策略，ccr9
+
cd8
+
t细胞可以被有效地招募到肿瘤组织中，并显著促进其活化和抗肿瘤功能，最终在小鼠黑色素肿瘤(b16f10)原位和术后模型中实现显著的抗肿瘤与抑制复发的效果(图10)。
39.本发明第四个方面，在于提供本发明第一方面的水凝胶、本发明第二方面的制备方法和/或本发明第三方面的水凝胶体系在(1)～(12)中任一项中的应用；
40.(1)制备抗肿瘤的产品；
41.(2)制备抑制肿瘤复发的产品；
42.(3)提高t细胞趋化能力；
43.(4)制备提高t细胞趋化能力的产品；
44.(5)促进t细胞对肿瘤细胞的相互作用；
45.(6)制备促进t细胞对肿瘤细胞的相互作用的产品；
46.(7)缓解t细胞的耗竭；
47.(8)制备缓解t细胞的耗竭的产品；
48.(9)调节肿瘤免疫微环境；
49.(10)制备调节肿瘤免疫微环境的产品；
50.(11)抑制肿瘤体积变大；
51.(12)制备抑制肿瘤体积变大的产品。
52.优选地，所述产品包括但不限于药物、试剂和试剂盒。
53.优选地，所述t细胞包括ccr9
+
cd8
+
t细胞。
54.本发明的有益效果是：
55.本发明提供的水凝胶不仅可以招募t细胞至特定的肿瘤病灶区域，增强肿瘤组织中t细胞的浸润，还可以调节被招募t细胞的功能，并进一步调节肿瘤免疫微环境，抑制肿瘤生长与术后复发。
56.进一步的，通过将金刚烷与环糊精的超分子相互作用以促进t细胞与肿瘤细胞的相互作用，缓解t细胞的耗竭，显著促进t细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
57.本发明提供的alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系，该体系在体内实现的招募、固定和再活化，多层次地促进t细胞的抗肿瘤功能来调节免疫微环境的策略，显著促进了抗肿瘤的效果，不仅可以消灭原位肿瘤，还能术后肿瘤的复发。该负载ccl25趋化因子与apdl1抗体的水凝胶体系为抗肿瘤免疫治疗提供了新的有效策略，具有较高的临床转化前景。
附图说明
58.图1为β环糊精修饰的海藻酸钠(alg-βcd)的制备以及表征结果，其中，a为alg-βcd的制备原理，b为红外光谱仪分析结果，c为热重分析结果。
59.图2为alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶的透射电镜图(tem)图。
60.图3为alg-βcd的水凝胶的药物释放效果图。
61.图4为alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶在不同缓冲液中的稳定性图。
62.图5为ad-peg-cooh的合成示意图以及核磁共振氢谱(1h-nmr)图。
63.图6为等温滴定量热法测定ad-apd1抗体与β-cd的相互作用，其中，a为等温滴定量热法测定1-金刚烷胺与β-cd的相互作用，b为等温滴定量热法测定ad-apd1抗体与β-cd的相互作用。
64.图7为alg-βcd
ccl25
水凝胶在体外对t细胞的趋化，其中a为实验示意图，b为含不同浓度ccl25的alg-βcdccl25水凝胶中细胞数量结果统计图，c为激光共聚焦显微镜图。
65.图8为alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系在体内的抗肿瘤效果，其中，a为试验过程图，b为小鼠肿瘤体积结果统计图，c为小鼠肿瘤重量结果统计图，d为小鼠肿瘤实图，图中****代表p＜0.001，**代表p＜0.01。
66.图9为alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系在术后肿瘤模型抑制肿瘤复发的效果，其中，a为试验过程图，b为小鼠肿瘤体积结果统计图，c为小鼠肿瘤重量结果统计图，d为小鼠肿瘤实图，图中****代表p＜0.001，***代表p＜0.005。
67.图10为alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系抗肿瘤的原理图。
具体实施方式
68.现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
69.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
70.实施例1β环糊精修饰的海藻酸钠(alg-βcd)的制备
71.本实施例通过海藻酸钠上的羧基与β环糊精上的羟基之间的酯化反应制备β环糊精修饰的海藻酸钠(alg-βcd)，具体制备方法如下：
72.称取3.0g的海藻酸钠(alg)分散于20ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，将溶液加热
至50℃，向其中加入对3.9g的甲苯磺酸(ptsa)，搅拌反应30min后，随后加入2.9g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)以及0.3g的β-环糊精(βcd)，并在持续的搅拌下反应24h；反应结束后，使用无水乙醇对产物进行反复洗涤，将洗涤后的所得产物进行冻干，并将冻干后的产物即为β环糊精修饰的海藻酸钠，命名为alg-βcd(图1中a)。
73.通过红外光谱与热重分析对得到的alg-βcd进行表征分析。红外光谱的具体方法如下：分别称取5mg的alg、βcd、alg-βcd与0.5g的溴化钾进行共混并压片，随后使用红外光谱仪对各个样品进行检测分析。结果如图1中b所示，alg-βcd在1730cm-1
处具有明显的羰基伸缩振动吸收峰，表明alg-βcd的成功合成。热重分析的具体方法如下：分别称取2mg的alg、βcd、alg-βcd加入热重分析仪的坩埚中，随后在升温程序中对各个样品的质量变化进行检测分析。结果表明，合成的alg-βcd中βcd的质量比为9.14％(图1中c)，表明alg-βcd的成功合成。
74.实施例2金刚烷修饰抗体ad-apd1与ad-apdl1的合成
75.(1)ad-peg-cooh的合成
76.通过1-金刚烷甲酰氯对羧基化的peg进行修饰，得到金刚烷修饰的聚乙二醇(ad-peg-cooh)，具体方法如下：将ho-peg113-cooh、三乙胺(经五氧化二磷回流除水后的三乙胺)溶解于四氢呋喃(thf，经除水操作后的四氢呋喃)中，得到溶液a；另取1-金刚烷甲酰氯溶解于thf中，得到溶液b。将溶液b缓慢滴加于溶液a中，0℃持续滴加反应4h(其中ho-peg113-cooh、三乙胺、1-金刚烷甲酰氯的摩尔比为1:1.1:1.1)；反应结束后过滤并将所得产物经冷乙醚(-20℃的无水乙醚)沉淀，即得到金刚烷修饰的聚乙二醇，命名为ad-peg-cooh。
77.称取10mg制备的ad-peg-cooh，加入0.8ml的dmso-d6，溶解后进行核磁共振氢谱的检测。结果如图5所示，1h-nmr的结果表明ad-peg-cooh的成功合成。
78.(2)金刚烷修饰抗体ad-apd1与ad-apdl1的成功合成
79.称取8.3mg的ad-peg-cooh、0.4mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、0.3mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解于二甲基亚砜(dmso)中，并在搅拌条件下持续反应30min；随后，向上述溶液中加入5mg的抗pdl1抗体(apdl1,bioxcell,clone:10f.9g2)或抗pd1抗体(apd1,bioxcell,clone:rmp1-14)，并在4℃搅拌条件下持续反应12h；反应结束后，将上述溶液使用超滤管进行过滤除杂，得到金刚烷修饰抗体，命名为ad-apdl1或ad-apd1。
80.将得到的ad-apd1抗体进行进一步的表征，首先通过等温滴定量热法(itc)检测其与环糊精的相互作用的能力。如图6所示，ad-apd1抗体仍然保留了与环糊精良好的超分子作用效果，表明金刚烷的成功修饰。
81.实施例3负载趋化因子ccl25与ad-apdl1抗体的alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶的制备
82.alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶的制备方法，包括以下步骤：取10mg实施例1制备的alg-βcd溶解于超纯水中，配置成浓度为10mg/ml的alg-βcd溶液，向1ml alg-βcd溶液中加入0.2μg的ccl25(biolegend,cat#,589306)和2mg由实施例2制备得到的ad-apdl1，搅拌混合后，加入至1ml浓度为20mm的cacl2溶液中，反应后即得到原位水凝胶alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
。
83.对制备得到的alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶的结构进行表征，具体如下：将alg-β
cd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶进行冻干，并使用扫描电子显微镜进行拍摄。结果显示，alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶具有三维疏松多孔的结构，且孔径在100～200μm范围内(图2)。
84.实施例4
85.本实施例用于考察实施例1制备得到的alg-βcd的药物缓释特性以及稳定性。具体如下：
86.将1ml alg-βcd(10mg/ml)、1ml cacl2(20mm)和2mg bsa(选择bsa作为水凝胶药物释放的模型药物)混合形成水凝胶。将制备好的水凝胶(1ml)加入10ml的离心管中，随后加入2ml的pbs。将上述离心管置于37℃的摇床中轻轻摇晃，并在预定时间点收集上清液，用新鲜pbs替换原有的pbs。随后使用bca试剂盒检测bsa的释放量。
87.结果如图3所示，alg-βcd与钙离子形成的水凝胶对牛白蛋白bsa具有明显的缓释效果，其在12天时，仍能保持良好的释放效果。并且其在多种缓冲液(h2o、dmem和pbs)中的长时间存在，也同样表明alg-βcd的水凝胶能够维持较长时间的结构稳定性(图4)。
88.实施例5alg-βcd
ccl25
水凝胶对t细胞的趋化能力
89.alg-βcd
ccl25
水凝胶的制备方法，包括以下步骤：取10mg实施例1制备的alg-βcd溶解于超纯水中，配置成浓度为10mg/ml的alg-βcd溶液，向1ml alg-βcd溶液中加入0.2μg的ccl25，搅拌混合后，加入至1ml浓度为20mm的cacl2溶液中，反应后即得到水凝胶alg-βcd
ccl25
。
90.使用ibidiμ-slide chemotaxis3d进一步研究含有不同浓度梯度的alg-βcd
ccl25
水凝胶在体外对t细胞的趋化作用。具体如下：将制备好的含有ccl25(浓度分别为200、100、50和25ng/ml)的alg-βcd
ccl25
水凝胶和cd8+t细胞悬液(5
×
105)分别添加到ibidiμ-slide chemotaxis3d的两个单独的小室中。水凝胶与t细胞之间逐渐形成趋化因子浓度梯度。将上述ibidiμ-slide chemotaxis3d在37℃孵育4h后，用激光共聚焦显微镜观察并计数水凝胶中的cd8+t细胞。
91.结果如图7所示，alg-βcd
ccl25
水凝胶在体外具有较强的t细胞趋化能力，并且该趋化效果与水凝胶中趋化因子的浓度成正比。
92.实施例6
93.一种alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系，包括实施例4制备得到的alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
水凝胶和实施例2制备得到的ad-apd1。
94.实施例7
95.一种alg
ccl25
/ad-apd1水凝胶体系，包括alg
ccl25
水凝胶和实施例2制备得到的ad-apd1。
96.alg
ccl25
水凝胶的制备方法为：取10mg的alg溶解于超纯水中，配置成浓度为10mg/ml的alg溶液，向1ml的alg溶液中加入0.2μg的ccl25，搅拌混合后，加入至1ml浓度为20mm的cacl2溶液中，反应后即得到alg
ccl25
水凝胶。
97.实施例8
98.一种alg-βcd
ccl25
/ad-apd1水凝胶体系，包括实施例5制备得到的alg-βcd
ccl25
水凝胶和实施例2制备得到的ad-apd1。
99.实施例9
100.一种alg
ccl25&ad-apdl1
水凝胶体系，包括alg
ccl25&ad-apdl1
水凝胶和实施例2制备得到的
ad-apd1。
101.alg
ccl25&ad-apdl1
水凝胶的制备方法为：取10mg的alg溶解于超纯水中，配置成浓度为10mg/ml的alg溶液，向1ml alg溶液中加入0.2μg的ccl25和2mg由实施例2制备得到的ad-apdl1，搅拌混合后，加入至1ml浓度为20mm的cacl2溶液中，反应后即得到alg
ccl25&ad-apdl1
水凝胶。
102.实施例10alg-βcd
ccl25&ad-apdl1/ad-apd1
水凝胶体系在体内的抗肿瘤效果
103.选择4周的c57bl/6j雌性小鼠，在小鼠右侧背部注射2
×
105个b16-f10细胞的悬液，常规饲养6天，待肿瘤体积约为50mm3时，进行下一步实验。
104.将肿瘤体积约50mm3的小鼠随机分为7组，每组x只，7组分别为g1：pbs，g2：ad-apd1，g3：apd1，g4：alg
ccl25
/ad-apd1，g5：alg-βcd
ccl25
/ad-apd1，g6：alg
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1，g7：alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1。通过静脉注射pbs(g1)或ad-apd1(5mg/kg)(g2、g4、g5、g6和g7)或apd1(5mg/kg)(g3)，同时向肿瘤内注射50μl含ccl25(5μg)和ad-apdl1(100μg)的alg或alg-βcd溶液(即g1、g2和g3不注射任何物质，g4注射alg
ccl25
水凝胶，g5注射alg-βcd
ccl25
水凝胶、g6注射alg
ccl25&ad-apdl1
水凝胶，g7注射alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶)。每隔1天监测肿瘤体积和体重。治疗12天后，对小鼠进行安乐死，并切除小鼠肿瘤组织，测量肿瘤重量。
105.结果如图8所示，在小鼠体内经alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系治疗后，小鼠的肿瘤生长与其他组相比得到明显抑制，表明通过对t细胞的趋化，固定，以及增强其与肿瘤细胞的相互协作用的策略显著改善了该原位水凝胶体系的抗肿瘤效果。
106.实施例11alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系在术后肿瘤模型抑制肿瘤复发的效果
107.将含有2
×
105个b16-f10细胞的悬液被接种至到小鼠右侧背部。常规饲养10天后，将上述小鼠随机分为7组(g1：pbs，g2：ad-apd1，g3：apd1，g4：alg
ccl25
/ad-apd1，g5：alg-βcd
ccl25
/ad-apd1，g6：alg
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1，g7：alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1)，并进行切除肿瘤手术，术后留下1％的残留肿瘤以模拟术后残留。然后，通过小鼠静脉注射pbs(g1)或ad-apd1(5mg/kg)(g2、g4、g5、g6和g7)或apd1(5mg/kg)(g3)。手术创面注射50μl含ccl25(5μg)和ad-apdl1(100μg)的alg或alg-βcd溶液(即g1、g2和g3不注射任何物质，g4注射alg
ccl25
水凝胶，g5注射alg-βcd
ccl25
水凝胶、g6注射alg
ccl25&ad-apdl1
水凝胶，g7注射alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
原位水凝胶)。每隔1天监测肿瘤体积和体重。
108.如图9所示，在经alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系治疗后的小鼠的术后肿瘤组织生长得到显著抑制，而其他治疗组的小鼠术后肿瘤组织均有较为明显的复发生长。以上结果表明alg-βcd
ccl25&ad-apdl1
/ad-apd1水凝胶体系不仅对原位肿瘤具有显著的抑制效果，且对术后肿瘤的复发同样具有十分明显的抑制能力。
109.上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种水凝胶，包括凝胶基底以及负载于所述凝胶基底上的物质，所述物质包括趋化因子和/或抗pdl1抗体。2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述抗pdl1抗体为经过金刚烷修饰后的抗pdl1抗体；优选地，所述凝胶基底为海藻酸钠、卡波姆、羧甲基壳聚糖、环糊精修饰的海藻酸钠中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述趋化因子为cxc趋化因子、cc趋化因子、cx3c趋化因子和c趋化因子中的一种或多种；优选地，所述趋化因子为cc趋化因子。4.根据权利要求2或3所述的水凝胶，其特征在于，所述经过金刚烷修饰后的抗pdl1抗体的制备方法包括以下步骤：1)利用1-金刚烷甲酰氯对羧基化的peg进行修饰，得到金刚烷修饰的聚乙二醇；2)将金刚烷修饰的聚乙二醇与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二甲基亚砜混合，第一次反应，加入抗pdl1抗体，第二次反应，得到金刚烷修饰后的抗pdl1抗体。5.根据权利要求4中所述的水凝胶，其特征在于，2)中所述第一次反应的条件为2～6℃搅拌20～50min；优选地，2)中所述第二次反应的条件为2～6℃搅拌10～14h。6.权利要求1～5中任一项所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将凝胶基底、负载于所述凝胶基底上的物质混合，反应，即得到水凝胶。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述反应为将凝胶基底、负载于所述凝胶基底上的物质的混合物于cacl2溶液中反应；优选地，所述凝胶基底与所述负载于所述凝胶基底上的物质的质量比为1:0.00001～0.5。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶基底与所述cacl2的质量浓度比为1:0.1～0.5。9.一种水凝胶体系，包括权利要求1～5中任一项所述的水凝胶和抗pdl1抗体；优选地，所述抗pdl1抗体为经过金刚烷修饰后的抗pdl1抗体。10.权利要求1～5中任一项所述的水凝胶、权利要求6～8任一项所述的制备方法和/或权利要求9所述的水凝胶体系在(1)～(12)中任一项中的应用；(1)制备抗肿瘤的产品；(2)制备抑制肿瘤复发的产品；(3)提高t细胞趋化能力；(4)制备提高t细胞趋化能力的产品；(5)促进t细胞对肿瘤细胞的相互作用；(6)制备促进t细胞对肿瘤细胞的相互作用的产品；(7)缓解t细胞的耗竭；(8)制备缓解t细胞的耗竭的产品；(9)调节肿瘤免疫微环境；(10)制备调节肿瘤免疫微环境的产品；(11)抑制肿瘤体积变大；(12)制备抑制肿瘤体积变大的产品。

技术总结
本发明属于肿瘤治疗药物领域，公开了一种负载CCL25趋化因子与抗PDL1抗体的海藻酸钙水凝胶体系的构建及应用，具体公开了一种水凝胶，包括凝胶基底以及负载于所述凝胶基底上的物质，所述物质包括趋化因子和/或抗PDL1抗体。本发明提供的水凝胶不仅可以招募T细胞至特定的肿瘤病灶区域，增强肿瘤组织中T细胞的浸润，还可以调节被招募T细胞的功能，并进一步调节肿瘤免疫微环境，抑制肿瘤生长与术后复发。抑制肿瘤生长与术后复发。


技术研发人员：杨显珠 朱跃强 金靓洁
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/25