一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法与流程

1.本发明属于分析领域，具体涉及一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法。


背景技术：

2.寡核苷酸药物是指含有10～30个碱基的rna或dna分子及其类似物，可以在基因水平上干扰致病蛋白质的产生，从而达到治疗疾病的目的，因此也是近年来药物研发领域中的热点之一。合成寡核苷酸在作为治疗剂治疗各种疾病(例如癌症和病毒性疾病)方面的重要性日益突显。寡核苷酸类药物包括反义寡核苷酸、小干扰rna(sirna)和适配体。反义寡核苷酸和sirna均通过阻止mrna翻译从而阻止蛋白质合成。适配体通过形成适配体-蛋白质复合物，从而抑制蛋白质的生物学功能。
3.寡核苷酸药物的分子量较大，通常为6000～8000，在水中几乎以阴离子形式存在，会形成一个负电荷聚集的分子体。根据这样的结构特征，常用的分析方法有反相离子对色谱、亲水色谱、阴离子交换色谱和毛细管电泳等。其中，反相离子对色谱具有分离度高、结果稳定、操作简便、易与ms检测器对接及可同时分离n-1杂质等优势。
4.至今fda已批准了数个寡核苷酸药物上市，而处于临床研发阶段的药物数量更多，因此，开展寡核苷酸分析方法的研究工作十分必要和紧迫。


技术实现要素：

5.本发明针对现有寡核苷酸纯度分析方法研究匮乏，目的在于提供一种寡核苷酸反相离子对的纯度分析方法。实现以下发明目的：
6.采用反相离子对高效液相色谱法来分析，具有组分峰分离效果好、分辨率高、分析精度高、重现性好，易与ms对接，操作简易等优点，达到对寡核苷酸质量进行有效控制的目的。
7.为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
8.本发明提供了一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，所述寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法包括：
9.1)配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；
10.2)配制流动相a，流动相b与流动相c，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用高效液相色谱仪对样品溶液进行检测，检测寡核苷酸纯度；
11.3)采用面积归一化法进行纯度结果计算。
12.作为本发明的一种优选方案，步骤1)中，所述样品溶液的浓度为0.8-1.0mg/ml，溶解样品所用的容积为纯化水。
13.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，高效液相色谱仪为agilent1290超高效液相色谱仪，配紫外检测器和全波长检测。
14.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，色谱柱为thermo scientific
tm
dionex
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dnapac
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rp，色谱柱规格为长度100mm，内径3.0mm，填料粒径为4.0μm。
15.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，所述的流动相a为20mm teaa/100mm hfip，3％acn；流动相b为20mm teaa/100mm hfip，12％ acn，流动相c为acn。
16.作为本发明的一种优选方案，洗脱梯度为：0min，100％流动相a：0％流动相b：0％流动相c；45min，20％流动相a：80％流动相b：0％流动相c；45.2min，40％流动相a：0％流动相b：60％流动相c；50min，40％流动相a：0％流动相b：60％流动相c；50.1min，100％流动相a：0％流动相b：0％流动相c；60min，100％流动相a：0％流动相b：0％流动相c。
17.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，检测条件为：检测波长260nm；流速0.4ml/min；进样体积10μl；柱温60℃；进样盘温度4℃，稀释剂/空白为纯化水。
18.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，过滤所用的微孔膜为0.22μm。
19.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，超声脱气的时间为5min。
20.采用以上技术方案，本发明具有以下有益效果：
21.(1)本发明分析方法色谱条件范围宽，适用于各类序列和不同长度的寡核苷酸纯度检测。
22.(2)本发明可与质谱对接联用，快速分析样品纯度和分子量。
23.(3)本发明分析梯度范围宽，可以此为基础，微调梯度，达到各类寡核苷酸最佳分离效果。
24.(4)本发明分析方法分析精密度高。
25.(5)本发明分析方法操作简易，分析全部自动化，检测由仪器完成，无论有无实验基础，只要经过操作培训，即可进行操作。
26.(6)本发明分析方法达到对寡核苷酸质量进行有效控制的目的。
附图说明
27.图1是本发明方法分析样品检测所得结果。
具体实施方式
28.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.本发明中所用仪器包括所用仪器
30.1)waters premier超高效液相色谱仪，配紫外检测器和全波长检测。
31.2)色谱柱thermo scientific
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dionex
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dnapac
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rp(3.0
×
100mm,4μm)。
32.3)超声波脱气装置。
33.本发明提供了一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，包括仪器选择、检测条件的设定、样品处理、检测；
34.本发明的分析方法包括：
35.1)配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；
36.2)配制流动相a，流动相b与流动相c，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用高效液相色
谱仪对样品溶液进行检测，检测寡核苷酸纯度；
37.3)采用面积归一化法进行纯度结果计算。
38.使用本发明所述的检测方法，检测寡核苷酸纯度。
39.检测条件的设定，流动相a、流动相b与流动相c的体积比如表1所示：
40.表1.洗脱梯度
41.time(min)a％b％c％010000452080045.240060504006050.1100006010000
42.所述的流动相a为20mm teaa/100mm hfip，3％acn；流动相b为20mm teaa/100mm hfip，12％acn；流动相c为acn。
43.所述的检测条件设定，检测波长260nm；流速0.4ml/min；进样体积10μl；柱温60℃；进样盘温度4℃。
44.所述的仪器选择，使用waters premier超高效液相色谱仪，色谱柱thermo scientific
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dnapac
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rp(3.0
×
100mm,4μm)。
45.实施例1
46.本实施例
47.1)样品处理：准确称取10mg样品置于10ml容量瓶中，加入少量纯化水溶解后定容；
48.2)将配制好的流动相a，流动相b与流动相c经0.22μm膜过滤，超声脱气5分钟后，置于高效液相色谱仪上，脱气使用。
49.3)待出峰后，使用面积归一化法进行纯度结果计算。
50.结果见图1与表2，本发明分析方法主峰保留时间20.194min，处于图谱中间位置；主峰峰高459.94mau；主峰理论板数达到7000以上，峰形较好；样品纯度72.91％，分析精密度高；误差小，分析结果稳定；梯度范围宽，可以此为基础，微调梯度，达到各类寡核苷酸最佳分离效果。
51.表2.数据结果
[0052][0053]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法包括：1)配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；2)配制流动相a，流动相b与流动相c，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用高效液相色谱仪对样品溶液进行检测，检测寡核苷酸纯度；3)采用面积归一化法进行纯度结果计算。2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤1)中，所述样品溶液的浓度为0.8-1.0mg/ml，溶解样品所用的容积为纯化水。3.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤2)中，高效液相色谱仪为agilent1290超高效液相色谱仪，配紫外检测器和全波长检测。4.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤2)中，色谱柱为thermo scientific
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rp，色谱柱规格为长度100mm，内径3.0mm，填料粒径为4.0μm。5.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤2)中，所述的流动相a为20mm teaa/100mm hfip，3％acn；流动相b为20mm teaa/100mm hfip，12％acn，流动相c为acn。6.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，洗脱梯度为：0min，100％流动相a：0％流动相b：0％流动相c；45min，20％流动相a：80％流动相b：0％流动相c；45.2min，40％流动相a：0％流动相b：60％流动相c；50min，40％流动相a：0％流动相b：60％流动相c；50.1min，100％流动相a：0％流动相b：0％流动相c；60min，100％流动相a：0％流动相b：0％流动相c。7.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤2)中，检测条件为：检测波长260nm；流速0.4ml/min；进样体积10μl；柱温60℃；进样盘温度4℃，稀释剂/空白为纯化水。8.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤2)中，过滤所用的微孔膜为0.22μm。9.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，其特征在于，步骤2)中，超声脱气的时间为5min。

技术总结
本发明公开了一种寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法，包括配制样品溶液：称取样品置于容量瓶中，溶解后定容，得到样品溶液；配制流动相A，流动相B与流动相C，经微孔膜过滤，超声脱气后，采用高效液相色谱仪对样品溶液进行检测，检测寡核苷酸纯度；采用面积归一化法进行纯度结果计算。本发明采用寡核苷酸反相离子对液相色谱分析方法色谱条件范围宽，适用于各类序列和不同长度的寡核苷酸纯度检测，可与质谱对接联用，快速分析样品纯度和分子量，梯度范围宽，可以此为基础，微调梯度，达到各类寡核苷酸最佳分离效果，达到对寡核苷酸质量进行有效控制的目的。效控制的目的。效控制的目的。


技术研发人员：侯丽强 刘婷 李泽亚 安婷婷
受保护的技术使用者：杭州诺泰诺和生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/7/25