一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法

1.本发明属于药物新功能开发技术领域，尤其涉及一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellμlar carcinoma,hcc)具有恶性程度高、患者预后差等特点，其独特的免疫抑制微环境极大地限制了放化疗的收益，患者整体的5年生存率低于20％。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,tams)是促进hcc免疫抑制微环境形成的关键，尽管tams在m1促炎表型和m2免疫抑制表型间不断发生动态转化，但随着肿瘤进展tams趋向于m2免疫抑制表型，并通过释放tgfβ、il-10等调节性细胞因子导致cd8+t细胞功能失调触发t细胞耗竭，为hcc细胞的免疫逃逸提供“保护伞”。
3.目前认为m2巨噬细胞标志分子精氨酸酶1(arg1)通过催化l-精氨酸促进亚精胺(spermidine)等多胺的合成。大量研究数据支持亚精胺能够促进巨噬细胞m2表型极化，其作用机制与线粒体蛋白翻译合成、线粒体自噬-溶酶体途径等质量控制信号有关。提示亚精胺代谢通路在m2巨噬细胞中的独特地位可能成为tams表型重塑的突破口。本课题组前期基于蛋白质组学测序发现，在缺氧驱动的肿瘤免疫抑制性微环境中，亚精胺合酶(spermidine synthase,srm)在hcc细胞外泌体中富集；巨噬细胞通过捕获hcc细胞外泌的srm，显著增强亚精胺代谢通路，通过促进线粒体氧化磷酸化诱导m2免疫抑制表型极化，发挥促肝癌作用。
[0004]“药物再定位”或“老药新用”是突破传统药物研发模式高投入高风险等瓶颈问题、加快临床转化的有效途径。因此，本课题组在目前国内外已上市的药物中筛选srm的潜在抑制剂，期望基于成药已建立的药理学、药效学以及毒理学等前期研究促进本研究的基础理论进一步转化应用。申请人通过分析目前已知的科研用srm小分子抑制剂dcsah和adodato的特征药效团，筛选了zinc15(https://zinc.docking.org/)数据库中29533个已上市的药物，并将筛选得到的6个候选化合物与pdb数据库中srm蛋白结(https://www.rcsb.org/structure/2o0l)进行分子对接，以挖掘srm的潜在抑制剂，结果表明黄素腺嘌呤二核苷酸(flavine ademine dinucleotide，fad)的打分函数排在最前列，且优于目前已知的两种科研用抑制剂；进一步生物学验证发现fad能够显著下调巨噬细胞的亚精胺代谢通路，同时抑制线粒体氧化磷酸化复合体亚基的表达，提示fad能够作为亚精胺代谢通路抑制剂发挥巨噬细胞免疫功能调节作用。
[0005]
以往基于fad的理论认为，fad是维生素b2的体内生物活性形式，其溶解度和利用率均远优于维生素b2，同时作为线粒体复合体ⅱ的关键功能辅基，还充当电子载体直接参与线粒体呼吸链功能的调节。目前临床上fad通常以口服或静脉注射等方式给药，用于角膜炎以及口腔黏膜疾病的治疗；而fad对于肝脏功能的评估见于80年代，研究发现采用静脉点滴给药8周能够显著改善肝硬化患者血清胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、胆碱脂酶及白蛋白等指标。然而，对于fad在肝癌免疫治疗中的作用未见报道，本发明能够开发fad在肝癌治疗中的新用途，促进现有临床治疗方案的进一步优化。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于：为了解决开发fad在肝癌治疗中的新用途的问题，而提出的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0008]
一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，具体包括以下步骤：
[0009]
mtt法检测细胞生存率
[0010]
s101：取状态良好的细胞接种于96孔板中孵育24h后，用不同剂量的fad处理细胞；
[0011]
s102：作用24h后，加入mtt试剂,避光置于细胞培养箱中孵育4-6h；
[0012]
s103：然后取出96孔板，弃掉培养液，每孔加入dmso，放于平板震荡仪上震荡；
[0013]
s104：最后利用酶标仪检测490m波长处吸光度值，统计学分析各组差异；酶联免疫实验检测亚精胺含量
[0014]
s201：按照酶联免疫试剂说明书进行实验；
[0015]
s202：取包被亚精胺抗体的96孔板，室温平衡20min，分别设置空白对照孔，标准品孔及样品孔；
[0016]
s203：加入标准品及待检测样品，除对照孔外加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl；
[0017]
s204：用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h，洗涤后加入底物37℃孵育30min；
[0018]
s205：加入终止液后在15min内检测450nm处吸光度值；
[0019]
免疫印迹法检测蛋白表达
[0020]
s301：收集细胞，利用添加蛋白酶抑制剂的ripa裂解细胞；
[0021]
s302：经bca蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，添加蛋白上样缓冲液后，取样本加入聚丙烯凝胶，通过电泳分离蛋白并将其转移至pvdf膜上；
[0022]
s303：转膜结束后，将pvdf膜放入新配置的5％的脱脂奶粉中，随后室温封闭；
[0023]
s304：利用pbst洗涤pvdf膜后加入抗体4℃孵育过夜；
[0024]
s305：再次洗涤后加入二抗，放置于摇床上室温孵育1h，通过化学发光显影系统进行显色。
[0025]
作为上述技术方案的进一步描述：
[0026]
所述s102中，mtt试剂的容量为10μl，细胞培养箱内部的温度为37℃。
[0027]
作为上述技术方案的进一步描述：
[0028]
所述s103中，dmso的容量为150μl，震荡时间为10min。
[0029]
作为上述技术方案的进一步描述：
[0030]
所述s203中，标准品及待检测样品的容量为50μl。
[0031]
作为上述技术方案的进一步描述：
[0032]
所述s204中，底物的容量为50μl。
[0033]
作为上述技术方案的进一步描述：
[0034]
所述s302中，样本的容量为30μg。
[0035]
作为上述技术方案的进一步描述：
[0036]
所述s303中，脱脂奶粉的容量百分比为5％，室温封闭的时间为1h。
[0037]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0038]
本发明中通过开发fad作为免疫调节剂抗肝细胞癌的作用，增强肝细胞癌免疫治疗的效果，为其临床治疗提供新方案，药物申请还应有治疗效果病例统计数，如治愈率、显效率、有效率及无效率；还要有典型病例分析和药理分析。尽量列举有代表性的、典型的病例，包括完全治愈的、有明显疗效的及无效的病例分别占多大的比例，以便于说明该药的疗效。
附图说明
[0039]
图1为本发明提出的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法的候选化合物与srm分子对接结果评价表示意图；
[0040]
图2为本发明提出的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法的fad与srm的相互作用的示意图；
[0041]
图3为本发明提出的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法的采用不同浓度的fad进行药物处理的示意图；
[0042]
图4为本发明提出的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法的检测fad对亚精胺代谢通路影响的示意图。
具体实施方式
[0043]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0044]
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，具体包括以下步骤：
[0045]
mtt法检测细胞生存率
[0046]
s101：取状态良好的细胞接种于96孔板中孵育24h后，用不同剂量的fad处理细胞；
[0047]
s102：作用24h后，加入mtt试剂,避光置于细胞培养箱中孵育4-6h，mtt试剂的容量为10μl，细胞培养箱内部的温度为37℃；
[0048]
s103：然后取出96孔板，弃掉培养液，每孔加入dmso，放于平板震荡仪上震荡，dmso的容量为150μl，震荡时间为10min；
[0049]
s104：最后利用酶标仪检测490m波长处吸光度值，统计学分析各组差异；酶联免疫实验检测亚精胺含量
[0050]
s201：按照酶联免疫试剂说明书进行实验；
[0051]
s202：取包被亚精胺抗体的96孔板，室温平衡20min，分别设置空白对照孔，标准品孔及样品孔；
[0052]
s203：加入标准品及待检测样品，除对照孔外加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，标准品及待检测样品的容量为50μl；
[0053]
s204：用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h，洗涤后加入底物37℃孵育30min，底物的容量为50μl；
[0054]
s205：加入终止液后在15min内检测450nm处吸光度值；
[0055]
免疫印迹法检测蛋白表达
[0056]
s301：收集细胞，利用添加蛋白酶抑制剂的ripa裂解细胞；
[0057]
s302：经bca蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，添加蛋白上样缓冲液后，取样本加入聚丙烯凝胶，通过电泳分离蛋白并将其转移至pvdf膜上，样本的容量为30μg；
[0058]
s303：转膜结束后，将pvdf膜放入新配置的5％的脱脂奶粉中，随后室温封闭，脱脂奶粉的容量百分比为5％，室温封闭的时间为1h；
[0059]
s304：利用pbst洗涤pvdf膜后加入抗体4℃孵育过夜；
[0060]
s305：再次洗涤后加入二抗，放置于摇床上室温孵育1h，通过化学发光显影系统进行显色。
[0061]
本方案中，“药物再定位”开发策略是促进srm靶向抑制剂转化应用的重要思路，通过解析目前已知的两种科研用srm抑制剂dcsah和adodato的结构发现，其特征药效团为带正电的氨基丙基、核糖环与周围氨基酸形成的氢键、以s形式与氨基酸骨架结合的腺苷部分。筛选了zinc15(https://zinc.docking.org/)数据库中29533个已上市的药物，并将筛选得到的6个候选化合物通过libdock方法与srm蛋白结构进行半柔性对接，按照绝对自由能(absolute energy)、相对自由能(relative energy)以及libdock综合打分等参考数值评价发现，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)优于均已知的srm抑制剂(如图1)；
[0062]
进一步比对潜在的结合位点发现，fad可能与srm的glu208、gln206、phe185、met178以及cys25存在氢键相互作用；还与srm的met220、leu216以及leu27存在π-alkyl相互作用(图2中a-b)，fad与srm的相互作用模式及fad对亚精胺-eif5a通路的影响。(a-b)通过libdock方法对fad及srm进行半柔性对接；
[0063]
见图3，利用人源单核细胞thp-1诱导分化的巨噬细胞，采用不同浓度的fad进行药物处理24h，mtt法检测fad对肿瘤细胞及巨噬细胞生存率的影响。结果表明没有生存率变化，表明fad对巨噬细胞没有产生细胞毒性作用，fad对细胞生存率的影响。mtt法测定不同浓度fad对thp1细胞的细胞生存率的影响。graphpad进行统计学分析，组间无统计学差异；
[0064]
为了验证fad对亚精胺代谢通路的作用，本方案利用fad作用于thp1源性巨噬细胞以及snu-387肝细胞癌细胞，酶联免疫实验分析细胞亚精胺的含量，结果表明fad能够显著下调thp1以及snu-387细胞的亚精胺水平(图4中a-b)；裂解细胞，提取总蛋白通过免疫印迹法检测亚精胺代谢通路相关蛋白以及下游氧化磷酸化复合体的表达变化，结果如图4中c所示，随着fad浓度增加，thp1细胞和sun-387细胞亚精胺合酶(srm)的表达降低；同时，亚精胺代谢通路效应蛋白eif5a的hypusine修饰减少(eif5ahyp)；检测受亚精胺-eif5a调控的氧化磷酸化复合体表达，发现复合体
ⅴ
亚基atp5a，复合体ⅲ亚基uqcrc2、复合体ⅳ亚基coxⅱ以及复合体ⅰ亚基ndufb8的表达均降低，且对thp1细胞的抑制效果强于肝细胞癌细胞，检测fad对亚精胺代谢通路的影响，图4中a-b不同浓度的fad作用thp1细胞及snu-387细胞24h，酶联免疫实验检测细胞亚精胺含量的变化；图4中c免疫印迹法检测srm、eif5ahyp及氧化磷酸化复合体的表达变化。
[0065]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，具体包括以下步骤：mtt法检测细胞生存率s101：取状态良好的细胞接种于96孔板中孵育24h后，用不同剂量的fad处理细胞；s102：作用24h后，加入mtt试剂,避光置于细胞培养箱中孵育4-6h；s103：然后取出96孔板，弃掉培养液，每孔加入dmso，放于平板震荡仪上震荡；s104：最后利用酶标仪检测490m波长处吸光度值，统计学分析各组差异；酶联免疫实验检测亚精胺含量s201：按照酶联免疫试剂说明书进行实验；s202：取包被亚精胺抗体的96孔板，室温平衡20min，分别设置空白对照孔，标准品孔及样品孔；s203：加入标准品及待检测样品，除对照孔外加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl；s204：用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h，洗涤后加入底物37℃孵育30min；s205：加入终止液后在15min内检测450nm处吸光度值；免疫印迹法检测蛋白表达s301：收集细胞，利用添加蛋白酶抑制剂的ripa裂解细胞；s302：经bca蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，添加蛋白上样缓冲液后，取样本加入聚丙烯凝胶，通过电泳分离蛋白并将其转移至pvdf膜上；s303：转膜结束后，将pvdf膜放入新配置的5％的脱脂奶粉中，随后室温封闭；s304：利用pbst洗涤pvdf膜后加入抗体4℃孵育过夜；s305：再次洗涤后加入二抗，放置于摇床上室温孵育1h，通过化学发光显影系统进行显色。2.根据权利要求1所述的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，所述s102中，mtt试剂的容量为10μl，细胞培养箱内部的温度为37℃。3.根据权利要求1所述的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，所述s103中，dmso的容量为150μl，震荡时间为10min。4.根据权利要求1所述的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，所述s203中，标准品及待检测样品的容量为50μl。5.根据权利要求1所述的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，所述s204中，底物的容量为50μl。6.根据权利要求1所述的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，所述s302中，样本的容量为30μg。7.根据权利要求1所述的一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，其特征在于，所述s303中，脱脂奶粉的容量百分比为5％，室温封闭的时间为1h。

技术总结
本发明公开了一种黄素腺嘌呤二核苷酸抑制剂的应用方法，属于药物新功能开发技术领域，MTT法检测细胞生存率，取状态良好的细胞接种于96孔板中孵育24h后，用不同剂量的FAD处理细胞；作用24h后，加入MTT试剂,避光置于细胞培养箱中孵育4-6h；然后取出96孔板，弃掉培养液，每孔加入DMSO，放于平板震荡仪上震荡。本发明中通过开发FAD作为免疫调节剂抗肝细胞癌的作用，增强肝细胞癌免疫治疗的效果，为其临床治疗提供新方案，药物申请还应有治疗效果病例统计数，如治愈率、显效率、有效率及无效率；还要有典型病例分析和药理分析。尽量列举有代表性的、典型的病例，包括完全治愈的、有明显疗效的及无效的病例分别占多大的比例，以便于说明该药的疗效。药的疗效。药的疗效。


技术研发人员：苏静 孙娇 韩葳葳 颜晓羽 赵元馨
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/25