一种肝癌诊断标志物及其应用

1.本技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肝癌诊断标志物及其应用。


背景技术：

2.原发性肝癌即人们常说的肝癌，是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率较高。肿瘤代谢的表观调控机制是肿瘤学研究的前沿领域，在2011年，代谢重编程被归纳为肿瘤的十大标志物之一，肿瘤不仅是一种基因疾病，也是一种代谢性疾病。肿瘤包含可概括的、固有的代谢弱点，这些弱点可以作为肿瘤治疗的新方法，但到目前为止，还没有产生许多对人类癌症具有广泛和可预测疗效的代谢疗法。
3.由于肝癌组织学类型的高度异质性，现有的肝癌细胞蛋白标志物在诊断的特异度和敏感度上均存在某种程度的不足，常需要合理组合、客观评估，有时还需要与其他系统肿瘤的标志物联合使用。afp是目前最常用的诊断的血清生物标志物，但灵敏度低。此外，在最新的原发性肝癌诊疗指南(2022年版)中仅有4个免疫组化标志物有助于肝细胞良性、恶性肿瘤的鉴别。因此，为了提高肝癌诊断的准确度和灵敏度，还需要开发新的、可靠的诊断性生物标志物。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种肝癌诊断标志物及其应用。
5.本技术的技术方案如下：
6.本技术实施例提供了一种肝癌诊断标志物，上述标志物为agxt2，其geneid为64902。
7.本技术实施例提供了一种引物组，上述引物组用于扩增肝癌诊断标志物agxt2，上述引物组包括如seq id no.1所示的上游引物，和如seq id no.2所示的下游引物。
8.本技术实施例提供了一种sirna，其用于扩增上述肝癌诊断标志物agxt2，其序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
9.本技术实施例提供了一种上述肝癌诊断标志物agxt2在诱导制备其特异性识别抗体中的应用。
10.本技术实施例提供了一种上述肝癌诊断标志物agxt2在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用。
11.本技术实施例提供了上述引物组在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用。
12.本技术实施例提供了上述sirna在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用。
13.进一步的，在本技术的一些实施例中，上述特异性识别抗体用于制备诊断或辅助诊断肝癌的产品或制备治疗肝癌的药物。
14.进一步的，在本技术的一些实施例中，上述产品为试剂盒。
15.相对于现有技术，本技术的实施例至少具有如下优点或有益效果：
16.本技术实施例提供了一种肝癌诊断标志物agxt2和用于扩增agxt2的引物组、
sirna，同时还提供了上述肝癌诊断标志物agxt2和用于扩增agxt2的引物组、sirna在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用；还提供了上述肝癌诊断标志物agxt2在诱导制备其特异性识别抗体中的应用以及该特异性识别抗体在制备诊断或辅助诊断肝癌的产品或制备治疗肝癌的药物上的用途。
17.agxt2的geneid为64902，genbank accession number:nm_001306173。位于染色体位置：5p13.2，其核苷酸序列如seq id no.5所示。本技术方案通过免疫印迹实验(wb)、免疫组化、qrt-pcr、elisa实验发现agxt2在肝癌组织和血清中表达明显降低。生物信息学分析发现，患者术后总生存率和复发率结果显示agxt2低表达者预后差。在agxt2对肝癌细胞生物学行为的分析中发现agxt2蛋白与肝癌细胞的迁移和侵袭显著相关，过表达agxt2使肝癌细胞体内成瘤能力下降。代谢组学结果提示，过表达agxt2使肝癌细胞体内代谢物改变，胆固醇下降最明显，且明显调节肝癌细胞的脂质与动脉硬化通路。agxt2的表达基因主要与癌症和代谢性疾病有关，提示agxt2蛋白在肝癌的进展中发挥重要作用，可作为肝癌代谢治疗的潜在靶点，可利用axgt2蛋白的特异性单克隆抗体进行免疫组化诊断。
18.序列对照如表1所示。
19.表1
20.21.附图说明
22.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为agxt2蛋白及mrna在肝癌组织和血清中的表达情况；
24.图2为肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织病理切片免疫组化结果；
25.图3为肝细胞癌患者穿刺标本病理切片免疫组化结果和肉眼观察病理切片的照片；
26.图4为agxt2敲低后对肝癌迁移和侵袭的影响；
27.图5为agxt2相关的生信分析情况；
28.图6为l-精氨酸对agxt2表达的影响；
29.图7为油红o染色实验结果；
30.图8为lc-ms非靶向代谢组学结果；
31.图9为ntg小鼠皮下成瘤实验结果。
具体实施方式
32.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
33.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本技术。
34.实施例1
35.agxt2蛋白及mrna在肝癌组织和血清中的表达情况研究：
36.比较4例肝细胞癌患者的癌组织(t)和癌旁组织(p)中，如图1中a所示，其为wb实验检测agxt2蛋白在肝癌组织t和癌旁组织p中的表达结果；免疫印迹(wb)实验提示agxt2蛋白在癌组织中表达明显下调或缺失。
37.比较8例肝细胞癌患者的癌组织(tumor)和癌旁组织(nc)中，如图1中b所示，其为qrt-pcr实验检测agxt2 mrna在肝癌tumor和癌旁组织nc中的表达结果；qrt-pcr实验提示agxt2基因mrna在癌组织中表达明显下调。
38.比较40例正常人血清和40例肝癌患者血清中，如图1中c所示，其为elisa实验检测agxt2蛋白在肝癌患者血清和正常人血清中的表达结果；elisa检测agxt2蛋白在肝癌患者血清中表达也明显下调(如图1中c所示)。
39.实施例2
40.肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织病理切片免疫组化试验：
41.如图2所示，在7例肝癌组织和癌旁组织中，agxt2在肝癌组织t和癌旁组织p中的差异表达，癌旁组织中agxt2表达明显高于癌组织；免疫组化结果均提示agxt2在肝癌组织中表达下调或缺失，且表达差异在病理免疫组化切片中可以肉眼分辨。
42.实施例3
43.肝细胞癌患者穿刺标本病理切片免疫组化试验：
44.收集1例肝细胞癌患者穿刺标本的病理切片进行免疫组化实验，放大不同倍数观察，结果如图3中a所示，agxt2的表达存在明显差异，肝癌组织agxt2水平明显降低。
45.对比2例正常肝组织切片的免疫组化结果和3例癌症组织的病理切片免疫组化结
果，以及8例肝癌组织和癌旁组织的切片免疫组化结果，结果如图3中b所示，发现肝癌组织的agxt2表达明显降低，肉眼可见表达差异。
46.实施例4
47.运用agxt2基因过表达质粒和敲低sirna干预huh7细胞后，研究agxt2基因在肝癌中的作用表型：
48.流式细胞技术检测周期，结果如图4中a所示，发现过表达agxt2后阻滞细胞在g2期。
49.transwell实验检测侵袭能力，结果如图4中b所示，结果发现敲低agxt2后，huh7细胞侵袭能力增加，过表达后则侵袭能力减弱。
50.运用划痕实验检测细胞迁移能力，结果如图4中c所示，发现敲低agxt2基因后，迁移能力增加，过表达agxt2基因后，迁移能力减弱。
51.实施例5
52.agxt2相关的生信分析：
53.如图5中a所示，在tcga数据库中，agxt2的泛癌分析发现，agxt2特异性较高，仅在少数肝胆肿瘤和肾脏肿瘤中有表达，且表达下调。
54.如图5中b-d所示，在肝癌数据库中分析，agxt2的表达在病理分期中有差异，各病理分期均小于正常组织。agxt2表达也与afp相关，afp大于400ng/ml的患者agxt2表达明显降低。在肝癌患者中，女性agxt2表达低于男性。agxt2与t细胞免疫侵润正相关(r＝0.102，p＝0.049)；
55.如图5中e所示，结合tcga数据库和illumina human methylation 450甲基化数据库分析发现，agxt2与甲基化负相关(r＝-0.539，p＜0.001)。
56.如图5中f所示，在gepia2数据库中，agxt2的表达与预后相关(p＝0.02)。
57.实施例6
58.l-精氨酸对agxt2的表达影响：
59.高浓度l-精氨酸(16mmol/l浓度)溶解在无血清dmem培养液中，干预huh7细胞48小时，对照组是无血清dmem培养液干预48小时和正常空白细胞，比较agxt2的表达水平，结果如图6所示，发现l-精氨酸上调agxt2的表达。
60.实施例7
61.油红o染色实验，检测肝癌huh7细胞中agxt2质粒过表达及sirna敲低后脂滴的变化，结果如图7所示，发现agxt2敲低后脂滴增多，agxt2过表达后脂滴减少。agxt2基因的不同干预分5组，分组是：过表达质粒pcdna3.1-adagxt2组、空载pcdna3.1组、sirna-agxt2组、sirna-shcontrol组、空白细胞ck组。
62.图中，ck代表空白细胞组，nc代表sirna对照组sirna-shcontrol，sirna代表敲低组sirna-agxt2，空载代表质粒空载组pcdna3.1，质粒代表agxt2基因质粒过表达组pcdna3.1-adagxt2。脂滴被染成红色。
63.实施例8
64.lc-ms非靶向代谢组学测序：
65.将慢病毒过表达agxt2基因的huh7细胞4个重复组，空白huh7细胞4个重复组，进行lc-ms非靶向代谢组学测序。结果如图8所示，结果提示，huh7细胞agxt2基因过表达后，代谢
物中胆固醇下调最显著(logfc＝-7.01，p＝0.0129)。
66.实施例9
67.ntg小鼠皮下成瘤实验：
68.4周龄ntg小鼠14只，分2组，每组7只。过表达组：单侧腋下皮下注射过表达慢病毒(phblv-adagxt2)转染后的huh7细胞。对照组：单侧腋下皮下注射空白huh7细胞。观察28天，结果如图9所示。ntg小鼠皮下成瘤实验发现，比较agxt2过表达组、空白huh7细胞对照组，过表达agxt2后，ntg小鼠皮下成瘤能力受到抑制。
69.以上所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。

技术特征：
1.一种肝癌诊断标志物，其特征在于，所述标志物为agxt2，其geneid为64902。2.一种引物组，其特征在于，所述引物组用于扩增如权利要求1所述的肝癌诊断标志物，所述引物组包括如seq id no.1所示的上游引物，和如seq id no.2所示的下游引物。3.一种sirna，其特征在于，其用于扩增如权利要求1所述的肝癌诊断标志物，其序列如seq id no.3和seq id no.4所示。4.根据权利要求1所述的肝癌诊断标志物在诱导制备其特异性识别抗体中的应用。5.根据权利要求1所述的肝癌诊断标志物在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用。6.根据权利要求2所述的引物组在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用。7.根据权利要求3所述的sirna在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用。8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性识别抗体用于制备诊断或辅助诊断肝癌的产品或制备治疗肝癌的药物。9.根据权利要求5-8任意一项所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

技术总结
本申请提供了一种肝癌诊断标志物及其应用，涉及生物医药技术领域。本申请提供了一种肝癌诊断标志物AGXT2，本申请通过检测试验实验发现AGXT2在肝癌组织和血清中表达明显降低；患者术后AGXT2低表达者预后差；AGXT2蛋白与肝癌细胞的迁移和侵袭显著相关，过表达AGXT2使肝癌细胞体内成瘤能力下降；过表达AGXT2使肝癌细胞体内代谢物改变，胆固醇下降最明显，且明显调节肝癌细胞的脂质与动脉硬化通路；AGXT2的表达基因主要与癌症和代谢性疾病有关，提示AGXT2蛋白在肝癌的进展中发挥重要作用，可作为肝癌代谢治疗的潜在靶点，可利用AXGT2蛋白的特异性单克隆抗体进行免疫组化诊断。诊断。诊断。


技术研发人员：陈田
受保护的技术使用者：重庆大学附属三峡医院
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/25