一种用于类器官冻存的细胞冻存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于细胞冻存液技术领域，具体涉及一种用于类器官冻存的细胞冻存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.类器官是一种三维(3d)细胞培养物，在体外培育而成，包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。因此，作为重要的新兴前沿技术，能够为疾病研究与治疗助力，目前在生物学医学领域发挥越来越大的作用。
3.目前最常见的用于类器官的冷冻保存的冷冻保护剂是二甲基亚砜(dmso)或者高浓度甘油。dmso被认为是最好的保护剂，但在某些浓度下它对细胞是有毒的，可能对细胞的生理功能和活性产生有害的影响。与dmso相比，甘油对细胞更友好，但作为冷冻保护剂的效果较差。在冻存过程中容易发生凋亡，导致后续复苏培养失败。近年来，新的冻存保护剂如d-山梨醇等被用于细胞的低温冻存中，d-山梨醇是一种含糖多元醇，在低温时能通过对细胞膜的稳定，发挥其对细胞的保护作用。但是，其单一使用时仍具有很多问题，例如d-山梨醇无法保护细胞免受氧化应激引起的细胞凋亡。
4.专利cn115251045a公开了一种包含无机盐水溶液、dmso、聚乙烯醇、聚乙二醇、维生素以及羟乙基淀粉的细胞冻存液，该细胞冻存液可以实现在2～8℃保存，在使用时不需要将细胞冻存液提前解冻，能够实现即取即用，大大提高了操作的便利性并且在冻存细胞时具有优异的细胞复苏后的细胞活率。但是该专利不能确保在解冻后洗涤程序中充分去除dmso，对细胞可能具有一定的毒害作用。
5.在不可逆的细胞损伤或细胞死亡过程中，钙是细胞坏死的一个重要媒介。而在细胞冻存过程中，由于温度的剧烈下降，会形成不平衡的自由基导致细胞内钙离子浓度增加，促进细胞凋亡。来米地平为二氢吡啶类钙拮抗剂，可与细胞膜膜电位依赖性钙通道的dhp结合部位相结合，抑制钙离子内流。过往有研究表明来米地平可在精子的冻存过程中对精子起到保护作用，因此，来米地平作为一种添加剂，通过抑制钙离子通道可提高细胞低温保存的效果，具有巨大的潜力。
6.因此，现有的冻存液技术存在以下问题：
7.1)现有技术中类器官在冻存过程中的通常容易发生凋亡，复苏培养后成功率低。
8.2)现有技术需经过常规的“慢冻”过程，比较费时。
9.3)现有冻存液含有甘油，dmso，胎牛血清及人血白蛋白溶液等组分，存在细胞毒性、成分不确定、可能引入细菌和病毒等污染源的问题。


技术实现要素：

10.为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于类器官冻存的细胞冻存液及其制备方法和应用。
11.本发明所提供的技术方案如下：
12.一种用于类器官冻存的细胞冻存液，至少包括来米地平和d-山梨醇，两者的摩尔比为(0.9～1.1)
×
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:(0.5～1.0)。
13.基于上述技术方案：
14.d-山梨醇的作用为低温时能稳定细胞膜；来米地平的作用为保护细胞免受氧化应激损伤；来米地平弥补了d-山梨醇无法保护细胞免受氧化应激的功能，从而提高细胞低温保存的效果并显著提高细胞的存活率。
15.来米地平，分子式为c
20h22
cl2n2o6。其是一种钙拮抗剂，也叫钙通道阻滞剂，主要通过阻断心肌和血管平滑肌细胞膜上的钙离子通道，抑制细胞外钙离子内流，使细胞内钙离子水平降低而引起心血管等组织器官功能改变的药物。一般应用于高血压病、冠心病和心律失常。
16.本发明中，利用其与细胞膜膜电位依赖性钙通道的dhp结合部位相结合，抑制钙离子内流，从而避免不可逆的细胞损伤或细胞死亡。
17.具体的，还包括磷酸盐缓冲液，其中：
18.来米地平的摩尔浓度为0.5～1.1μm，优选的为0.9～1.1μm，更优选的为1μm；
19.d-山梨醇的摩尔浓度为0.5～1.0mol/l；
20.磷酸盐缓冲液的ph为7.3～7.5。
21.具体的，还包括维生素c，其浓度为0.09～0.11g/ml。
22.本发明还提供了上述用于类器官冻存的细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：按照配方的量，将各成分混合，即得。
23.例如，通过将来米地平和d-山梨醇混匀，然后再加入磷酸盐缓冲液和维生素搅拌混匀得到。
24.本发明还提供了上述用于类器官冻存的细胞冻存液的应用，作为类器官冻存的细胞冻存液。
25.一个具体的使用方法包括如下步骤：
26.1)类器官的冻存：将待冻存类器官悬液800g离心5分钟离心，去除上清，将离心后的细胞沉淀直接用冻存液重悬均匀，冻存密度为1-10
×
106个细胞/ml，将上述盛有待冻存的类器官和细胞冻存液的容器浸入-196℃液氮罐子中，即可实现对类器官的保存。
27.2)类器官的复苏：将盛有待冻存类器官和细胞冻存液的容器从液氮中取出，37℃水浴至细胞解冻，得到解冻复苏后的类器官，然后加入pbs，800g离心5分钟去上清，再用pbs洗涤一次，将洗涤后的类器官用类器官培养基重悬，即得到解冻去冻存液且复苏的类器官。
28.上述技术方案中：
29.d-山梨醇可在冻存细胞时减少形成冰晶的数量和大小。因此，采用本发明的细胞冻存液，方便快速，将细胞和细胞冻存液混匀后可以不用常规的先程序降温，再转移至液氮中的复杂的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存即可保持较高的细胞存活率。
30.具体的，所述的类器官为小鼠的肺癌类器官、乳腺癌类器官、食管癌类器官、胰腺癌类器官或胃癌类器官。小鼠从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，通过化学诱导或者基因工程法构建小鼠相应肿瘤，取小鼠相应肿瘤组织进行类器官培养。
31.具体的，所述的类器官为正常小鼠肝类器官、肺类器官或小肠类器官。小鼠从北京
维通利华实验动物技术有限公司购买，取小鼠相应组织器官进行类器官培养。
32.本发明中的来米地平和d-山梨醇与细胞具有良好的相容性，无毒性作用。其相较于采用传统的甘油和dmso作为细胞冻存液，本发明在解冻时不需要使用不同浓度的甘油进行梯度洗脱。
附图说明
33.图1是不同含量来米地平浓度对乳腺癌类器官冻存后细胞复苏活率的影响。
34.图2是d-山梨醇替换后的解冻复苏后的乳腺癌类器官的复苏活率。
35.图3是复苏的乳腺癌类器官培养5天后形态对比图(左：实施例1方法；右：对比例1方法)。
具体实施方式
36.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
37.实施例1：
38.一种细胞冻存液，由来米地平、d-山梨醇、磷酸盐缓冲液和维生素c组成；其中来米地平浓度为1μm，d-山梨醇的摩尔浓度为0.5mol/l，磷酸盐缓冲液的ph为7.4、摩尔浓度为0.01mol/l，维生素c 0.1g/ml。
39.上述细胞冻存液的使用方法，具体操作如下：
40.1)细胞冻存：将1
×
106个乳腺癌类器官加入到装有1ml的细胞冻存液的冻存管中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的冻存管浸入-196℃液氮中，对类器官的保存；
41.2)细胞解冻：冻存2周后，将装有待冻存类器官和细胞冻存液的冻存管从液氮中取出，37℃水浴加热约1min，直至类器官解冻复苏，得到解冻复苏后的类器官，然后类器官用10ml pbs于800g离心5分钟去上清后，将类器官用10ml生理盐水反复洗涤2次，去上清，得到洗涤后的细胞；将洗涤后的细胞用1ml类器官培养基重悬，即得到解冻去冻存液且复苏的类器官，整个复苏过程耗时15min。
42.实施例2：
43.本实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：细胞冻存液中来米地平浓度和d-山梨醇的浓度不同；具体如下表1所示：
44.表1：不同含量来米地平浓度和d-山梨醇对乳腺癌类器官冻存后细胞复苏活率的影响
[0045][0046]
图1为乳腺癌类器官复苏后ao/pi的染色结果，从左到右分别是d-山梨醇的摩尔浓度为0.5mol/l的条件下，来米地平浓度为0，0.5和1μm。红色代表死细胞，绿色代表活细胞。
[0047]
从上表1和图1的结果中可以看出，来米地平浓度为0～1μm与d-山梨醇浓度为0.5～1.0m加入时，能够显著提高类器官的复苏活率，单独添加来米地平或d-山梨醇并不能够有效保护冻存过程中的细胞，且在该范围内，来米地平浓度越高，效果越明显。说明上述添加比例下的来米地平能够抑制细胞的凋亡。当来米地平和d-山梨醇含量不在上述范围内时，类器官的复苏活率大大降低。
[0048]
实施例3：
[0049]
一种细胞冻存液，由来米地平、d-山梨醇、磷酸盐缓冲液和维生素c组成；其中来米地平浓度为1μm，d-山梨醇的摩尔浓度为0.5mol/l，磷酸盐缓冲液的终ph为7.4、摩尔浓度为0.01mol/l，维生素c 0.1g/ml。
[0050]
上述细胞冻存液的使用方法，具体操作如下：
[0051]
(1)细胞冻存：将1
×
106个肺癌类器官、乳腺癌类器官、食管癌类器官、胰腺癌类器官、胃癌类器官，以及正常小鼠肝类器官、肺类器官、小肠类器官分别加入到装有1ml的细胞冻存液的冻存管中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的冻存管浸入-196℃液氮中，即可实现对类器官的保存；
[0052]
(2)细胞解冻：冻存2周后，将装有待冻存类器官和细胞冻存液的冻存管从液氮中取出，37℃水浴加热约1min，直至类器官解冻复苏，得到解冻复苏后的类器官，然后类器官用10ml pbs于800g离心5分钟去上清后，将类器官用10ml生理盐水反复洗涤2次，去上清，得到洗涤后的细胞；将洗涤后的细胞用1ml类器官培养基重悬，即得到解冻去冻存液且复苏的类器官，整个复苏过程耗时15min。利用细胞计数仪检测细胞存活率(ao/pi染色)，结果如表2所示，细胞活率均达到80％以上。
[0053]
表2：
[0054]
类器官种类类器官复苏活率小鼠肺癌类器官88.7％小鼠乳腺癌类器官91.2％
小鼠食管癌类器官83.5％小鼠胰腺癌类器官85.2％小鼠胃癌类器官89.2％小鼠正常肝类器官85.7％小鼠正常肺类器官88.9％小鼠正常小肠类器官91.5％
[0055]
对比例1：
[0056]
本对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：细胞冻存液中将d-山梨醇分别替换为甘油、二甲基亚砜(dmso)、鞘氨糖脂、甘油糖脂、甘油磷脂、鞘氨磷脂、藻蛋白糖脂、槐糖脂、磷脂、卵磷脂、脂多糖(均购买自sigma公司)；解冻复苏后的乳腺癌类器官的复苏活率分别如图2所示。
[0057]
对比例2：
[0058]
本对比例2与实施例1基本相同，不同之处在于：所述的细胞冻存液中还含有0.15mol/l的聚乙烯基吡咯烷酮(国药集团上海化学试剂公司)、0.2mol/l的羟乙基淀粉(国药集团上海化学试剂公司)、0.12mol/l人血白蛋白溶液(国药集团上海血液制品有限公司)、0.1mol/l胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司)、0.1mol/l乙酰胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)和0.25mol/l dmso(国药集团上海化学试剂公司)。解冻复苏后的类器官的复苏活率如下表3所示：
[0059]
表3：
[0060]
方法细胞复苏活率(％)实施例191.2％对比例279.5％
[0061]
以上结果可看出，与实施例1的细胞冻存液相比，对比例2的细胞冻存液在加入一些其他细胞冻存常用的组分后，类器官复苏活率反而下降，这可能是由于添加其他组分后会影响d-山梨醇进入细胞内的效率，导致进入细胞内的d-山梨醇量减少，进而冻存效果下降。并且相比实施例1的细胞冻存液，对比例2的细胞冻存液加入胎牛血清及人血白蛋白溶液等组分，这样的方案存在细胞毒性、成分不确定、可能引入细菌和病毒等污染源的问题。
[0062]
对比例3：
[0063]
本对比例3采用经典的甘油冻存法对类器官进行冻存和解冻。
[0064]
经典方法：取1
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106个乳腺癌类器官悬液，将类器官与待添加的57％(v/v)复方甘油溶液按类器官与复方甘油溶液的体积比5:4的比例混合后放入37℃水浴中平衡10min，然后将其置于程序降温仪降温到-80℃后转移至液氮中保存。复苏时从液氮中取出，迅速放入37℃水浴箱中，轻微振荡至全部融化，然后加入9％(m/v)氯化钠溶液800g离心10min洗涤一次，平衡后再用9％氯化钠溶液800g离心10min洗涤2-3次，洗涤结束后用1ml类器官培养基重悬，即得到解冻去冻存液且复苏的类器官。
[0065]
实施例1的方法冻存后解冻去冻存液且复苏的类器官与对比例3的方法冻存后解冻去甘油且复苏的类器官培养5天后形态如图3所示，复苏活率如表4所示。
[0066]
从图3可以看出，按照实施例1的方法冻存解冻类器官，冻存解冻去冻存液且复苏培养后的长出的类器官数量更多，说明本发明的细胞冻存液具有良好的冻存解冻效果。
[0067]
表4：
[0068]
方法细胞复苏活率(％)复苏耗时实施例1方法91.2％15min对比例3方法42.7％1h
[0069]
从以上结果可看出，与对比例3方法的经典的甘油冻存法相比，本发明使用的细胞冻存液不使用高浓度的甘油，因此不会在类器官内部造成高渗透压，避免复苏时细胞破裂，相对于冻存前的类器官活率，冻存复苏后类器官活率明显高于经典方法(对比例3方法)，且无需多次洗涤除去甘油，复苏耗时明显缩短，发明人分析可能是来米地平促进细胞对d-山梨醇的吸收，同时避免了细胞在复苏时破裂。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于类器官冻存的细胞冻存液，其特征在于：至少包括来米地平和d-山梨醇，两者的摩尔比为(0.9～1.1)
×
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:(0.5～1.0)。2.根据权利要求1所述的用于类器官冻存的细胞冻存液，其特征在于：还包括磷酸盐缓冲液，其中：来米地平的摩尔浓度为0.9～1.1μm；d-山梨醇的摩尔浓度为0.5～1.0mol/l；加磷酸盐缓冲液的最终ph为7.3～7.5。3.根据权利2所述的用于类器官冻存的细胞冻存液，其特征在于：还包括维生素c，其浓度为0.09～0.11g/ml。4.一种根据权利要求1至3任一所述的用于类器官冻存的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照配方的量，将各成分混合，即得。5.一种根据权利要求1至3任一所述的用于类器官冻存的细胞冻存液的应用，其特征在于：作为类器官冻存的细胞冻存液。6.根据权利要求5所述的用于类器官冻存的细胞冻存液的应用，其特征在于：所述的类器官为小鼠的肺癌类器官、乳腺癌类器官、食管癌类器官、胰腺癌类器官或胃癌类器官。7.根据权利要求5所述的用于类器官冻存的细胞冻存液的应用，其特征在于：所述的类器官为正常小鼠肝类器官、肺类器官或小肠类器官。8.根据权利要求5所述的用于类器官冻存的细胞冻存液的应用，其特征在于：类器官的冻存包括以下步骤：将待冻存类器官悬液离心，去除上清，将离心后得到的细胞沉淀直接用冻存液重悬均匀，冻存密度为(1～10)
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106个细胞/ml，将盛有待冻存的类器官和细胞冻存液的容器浸入-196℃液氮罐中，即可实现对类器官的保存；类器官的复苏包括以下步骤：将盛有待冻存类器官和细胞冻存液的容器从液氮中取出，37℃水浴至细胞解冻，得到解冻复苏后的类器官，然后进行洗涤，将洗涤后的类器官用类器官培养基重悬，即得到解冻去冻存液且复苏的类器官。

技术总结
本发明属于细胞冻存液技术领域，具体涉及一种用于类器官冻存的细胞冻存液及其制备方法和应用。本发明所提供的用于类器官冻存的细胞冻存液，至少包括来米地平和D-山梨醇。本发明所提供的细胞冻存液对类器官冻存后的细胞复苏率高。复苏率高。复苏率高。


技术研发人员：游明亮 邢华杨 殷齐彦 谢素瑶
受保护的技术使用者：杭州艾名医学科技有限公司
技术研发日：2023.04.23
技术公布日：2023/7/25