一种PCR检测鱼粉中南美白对虾源性成分的方法

一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的方法。


背景技术：

2.鱼粉是饲料工业中不可或缺的、优质的动物性饲料原料。由于鱼粉价格昂贵，市场上掺假鱼粉泛滥，包括在鱼粉中掺入各种动、植物原料，从而降低了鱼粉的营养价值，也给鱼粉质量的判断造成了严重困扰。目前，鱼粉掺假的鉴定仍以镜检法为主，即通过在显微镜下寻找疑似掺假物的组织，依据组织特征对掺假物进行粗略识别，有时需通过物理和化学方法对识别结果进行补充判定，存在着漏检率高、灵敏度低、重复性差、无法定量，且依赖个人经验等问题。近年来，近红外光谱技术被开发用于识别与标准物有明显差异的物质，来鉴别掺假物，但需先建立鱼粉等原料的近红外定标模型。同时，近红外光谱的识别结果易受到如仪器类型、测量环境和装样方式等测样条件以及样品状态等因素的影响，从而影响所建模型的效果及其适用性，尚不具有普遍适用性。因此，亟需寻求一种简便、快捷、灵敏、准确的掺假鉴定方法。
3.应用实时荧光定量pcr检测技术，通过针对不同物种线粒体基因设计特异性引物，对目标物种进行鉴定，已广泛应用于加工食品及中药的真伪鉴定。利用pcr技术鉴定饲料物种组成或原料掺假也有相关研究报道，如意大利研究者利用pcr技术检测牛线粒体dna片段，以检测动物源性饲料中牛源性成分，检测灵敏度可达0.1125％；美国也建立了运用pcr技术，快速检测动物源性饲料中牛源性成分的方法，国内也有关于饲料中牛、羊、猪、鸡、马源性成分的检测报道。优质鱼粉通常由海捕的海水鱼制成，但鱼粉各种非鱼源性成分的荧光定量pcr检测技术研究尚未见报道。南美白对虾是世界上最重要的经济虾类之一，其加工业产生的下脚料如虾粉、虾壳粉等可直接作为饲料原料，也是鱼粉中常见的掺假物之一。目前，尚未见对鱼粉中南美白对虾源性成分进行荧光pcr鉴定的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的方法，该方法可以快速、灵敏地检测出待测鱼粉中南美白对虾源性成分的有无和含量范围，最低检出限可以达到0.01％。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的引物对，包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。
7.本发明还提供上述的引物对在制备pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的试剂盒中的应用。
8.进一步地，所述试剂盒为定性检测试剂盒或定量检测试剂盒。
9.本发明还提供一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的试剂盒，包括上述的引
物对。
10.进一步地，所述试剂盒为定性检测试剂盒或定量检测试剂盒。
11.本发明还提供上述的引物对或试剂盒在pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分中的应用。
12.本发明还提供一种从鱼粉原料中定性检测南美白对虾源性成分的方法，包括以下步骤：
13.(1)提取获取待检鱼粉原料样品的dna；
14.(2)以所述dna为模板，用上述的引物对进行荧光定量pcr扩增，得到荧光扩增曲线和ct值；
15.(3)进行定性结果判定：当出现荧光扩增曲线且ct值＜34时，所述待检鱼粉原料样品中含有南美白对虾源性成分；当未出现荧光扩增曲线或ct值≥34时，所述待检鱼粉原料样品中不含南美白对虾源性成分。
16.进一步地，在步骤(2)中，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2
×
chamq sybr qpcr master mix 10μl、10μmol/l的上游引物0.4μl、10μmol/l的下游引物0.4μl、模板2μl和超纯无菌水7.2μl；
17.反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
18.本发明还提供一种从鱼粉原料中定量检测南美白对虾源性成分的方法，包括以下步骤：
19.(1)制备不同南美白对虾源性成分质量含量的标准品样品，分别提取样品dna，并将其作为模板，分别用上述的引物对进行荧光定量pcr扩增，绘制关于南美白对虾质量含量和ct值的标准曲线；
20.(2)提取待检鱼粉原料样品的dna，并将其为模板，用上述的引物对进行荧光定量pcr扩增，得到对应的ct值，根据步骤(1)得到的标准曲线，计算得到所述待检鱼粉原料样品中的南美白对虾源性成分含量。
21.进一步地，在步骤(1)和(2)中，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2
×
chamq sybr qpcrmaster mix 10μl、10μmol/l的上游引物0.4μl、10μmol/l的下游引物0.4μl、模板2μl和超纯无菌水7.2μl；
22.反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
23.本发明公开了以下技术效果：
24.本发明首先设计了南美白对虾荧光定量引物对，并验证了其特异性。随后用该引物对对样品中不同浓度梯度的南美白对虾dna进行荧光定量pcr扩增，获得标准曲线，建立南美白对虾dna浓度和ct值之间的回归方程。在此基础上，通过检测待测鱼粉样品的ct值，判断待测鱼粉中是否含有南美白对虾源性成分，并明确其含量(质量浓度)范围。本发明的鉴定方法简便快捷，灵敏度高，重复性好，能够实现对掺假成分的定性和定量检测，最低检出限可以达到0.01％。检测过程不依赖个人经验，不受样品形态、检测环境等因素的影响。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为南美白对虾引物特异性验证的荧光定量pcr扩增曲线；
27.图2为南美白对虾不同dna浓度梯度的荧光定量pcr扩增曲线；
28.图3为含有不同质量浓度南美白对虾粉的自制鱼粉荧光定量pcr扩增曲线；其中a为自制鱼粉中南美白对虾粉的质量浓度0.01％～10％，b为自制鱼粉中南美白对虾粉的质量浓度0.0001％～0.001％；
29.图4为七种鱼粉样品dna的荧光定量pcr扩增曲线。
具体实施方式
30.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
31.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
32.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
33.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
34.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
35.实施例1
36.1.引物的设计
37.本实施例中南美白对虾荧光定量pcr引物对根据对虾类的血蓝蛋白(hemocyanin,hc，genbank登录号：ah013711)基因设计。具体引物序列为：上游引物(seq id no.1)：5
’‑
accaacttaccgtccgattt-3’，下游引物(seq id no.2)：5
’‑
cagggaactgacctccatac-3’，由上海生工生物有限公司合成。
38.2.引物的特异性验证
39.选择常用来制作鱼粉的鲈形目、鲤形目、鮋形目、鲽形目等48种鱼类(草鱼、鲫鱼、罗非鱼、鲮鱼、蓝圆鰺、斑鳍银姑鱼、丽叶鲹、小沙丁鱼、金眼鲷、沙带鱼、日本尖牙鲈、中国台湾腔吻鳕、尖吻蛇鳗、红娘鱼、紫红笛鲷、无斑拟羊鱼、日本绯鲤、大口鲆、印度刺鲳、秋刀鱼、蛇鲻、日本瞳鲬、深水金线鱼、格氏舌鳎、花点鲥、黄鳍棘鲷、列牙鯻、黄斑光胸鲾、星沙鮻、日本海鰶、深水大眼鲷、长鳍莫鲻、红尾银鲈、黄斑光胸鲾、南短蛇鲭、长头光鲉、褐菖鮋、方头
鲳、斑鰶、真鲷、伏氏眶棘鲈、大黄鱼、横纹九棘鲈、马面鲀、黄斑篮子鱼、勒氏笛鲷、斜带石斑鱼、星斑裸颊鲷)，以及7种主要经济虾蟹类(南美白对虾、斑节对虾、克氏原螯虾、口虾蛄、三疣梭子蟹、远东梭子蟹和巨缘青蟹，其加工副产品作为鱼粉掺假物)等物种，对设计南美白对虾引物的特异性进行验证，具体方法为：
40.2.1样本dna的提取
41.将以上鱼、虾、蟹的新鲜样本，利用动物组织dna提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取样本dna，步骤包括：先将样品粉碎处理，加200μl缓冲液ga以及proteinase k振荡混匀，于56℃裂解完全；加入200μl缓冲液gb，70℃放置10min；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec；所得溶液加入吸附柱cb3中，12000rpm离心30sec，弃废液；加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30sec，弃废液，加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30sec，倒掉废液，重复2次，晾干吸附材料残留漂洗液；将吸附柱cb3转入干净的离心管中，滴加100μl灭菌水，室温放置5min，12000rpm离心2min，离心管中溶液即为提取的dna。
42.采用微量紫外分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度a260和a280，以a260/a280的比值，确定dna的纯度，并计算dna浓度。选择质量浓度为100ng/μl的dna进行后续操作。
43.2.2引物的特异性验证
44.将提取的50种鱼类dna随机分成5组，每组10种鱼类，取每组10种鱼类的dna样品各取1μl进行混合，获得5份混合鱼类dna样品；同时将南美白对虾、斑节对虾、克氏原螯虾、口虾蛄、三疣梭子蟹、远东梭子蟹和巨缘青蟹的dna样品各1μl进行混合，获得1份虾蟹类dna样品，南美白对虾的dna单独作为一份样品。
45.以上述样品dna为模板，利用hc基因的上游引物(seq id no.1)以及下游引物(seq id no.2)进行实时荧光pcr扩增。扩增体系为：chamq sybr qpcr master mix(2
×
)10μl，10μmol/l的上游引物0.4μl，10μmol/l的下游引物0.4μl，dna模板2μl，超纯无菌水7.2μl，反应总体积为20μl。扩增体系的反应液配置在冰上完成。扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
46.基于荧光定量pcr扩增曲线的检测结果表明，设计的引物具有良好的南美白对虾源特异性(图1)。
47.3.绘制南美白对虾源性dna荧光定量标准曲线
48.以市售的南美白对虾全虾为dna样本来源，按照2.1的方法提取其中的dna，并计算dna浓度。选择质量浓度为100ng/μl的dna进行后续操作。
49.对提取的南美白对虾dna(质量浓度为100ng/μl)用灭菌水连续10倍稀释，使dna含量分别达到实际样品含量的100％、10％、1％、0.1％、0.01％，分别以不同稀释浓度的样品dna为模板，利用seq id no.1-2所示引物，按照2.2的方法进行实时荧光pcr扩增。扩增结果如图2所示。
50.根据扩增曲线，建立dna浓度和ct值之间的回归方程，以lg dna浓度为横坐标，ct值为纵坐标作图，绘制南美白对虾dna的扩增标准曲线，重复3次，计算平均ct值。得到南美白对虾源性成分荧光定量标准曲线为：y＝-3.261x+29.172，其中y为ct值，x为log dna值。其中，南美白对虾不同dna浓度梯度的荧光定量pcr扩增ct值如表1所示。
51.表1南美白对虾不同dna浓度梯度的荧光定量pcr扩增ct值
[0052][0053]
实施例2鱼粉中不同质量浓度南美白对虾源性成分的鉴定
[0054]
自制不含南美白对虾的鱼粉(市场采购蓝圆鰺、秋刀鱼、金线鱼、黄鳍鲷和鲻鱼，取肌肉，按照质量比1:1:1:1:1制作鱼粉)样品，按质量百分比分别在其中掺入10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％(质量分数)的南美白对虾全虾粉(市场采购活虾制成虾粉)，充分混匀，制成6种混合鱼粉样品。按照实施例1中2.1的方法提取这些鱼粉样品的dna，并进行浓度检测。以提取的鱼粉dna为模板，利用实施例1设计的seq id no.1-2所示引物与方法进行实时荧光pcr扩增，扩增条件与扩增体系同实施例1的2.2。每个样品做三个技术重复，得到荧光定量pcr扩增曲线(图3)及对应的ct值(表2)：
[0055]
表2含有不同质量浓度南美白对虾粉的自制鱼粉荧光定量pcr扩增的ct值
[0056]
南美白对虾含量％鱼粉含量％ct值10％90％23.72
±
0.071％99％26.73
±
0.600.1％99.9％28.62
±
0.420.01％99.99％31.75
±
0.450.001％99.999％35.96
±
2.310.0001％99.9999％39.89
±
0.89
[0057]
由图3和表2可知：当鱼粉中掺入0.01～10％的南美白对虾粉时，荧光定量pcr的ct值范围为23.72
±
0.07～31.75
±
0.45，均低于34.0，可判定掺有一定量的南美白对虾粉。当鱼粉中掺入0.001％和0.0001％的南美白对虾粉时，荧光定量pcr的ct值为35.96
±
2.31和39.89
±
0.89，均大于34.0，判定南美白对虾含量低至无法检出。因此，南美白对虾的最低检测限认为可达到0.01％。而目前饲料行业内常用的镜检法只能做定性检测，一旦显微镜视野中未发现掺假对象的特征组织，就判定为未检出，漏检几率极大，更没有检测限标准。因此，本发明的0.01％的最低检出限，为首次在国内外提出的鱼粉中南美白对虾源性成分检测灵敏度的技术指标，使鱼粉中淡水鱼成分的定量分析成为可能，为饲料行业的鱼粉品质判断和评价提供了创新性的方法。
[0058]
实施例3鱼粉中南美白对虾源性成分鉴定的荧光定量pcr方法的实际应用
[0059]
收集7种市售鱼粉样品，其中两种鱼粉疑似掺杂了虾壳粉(掺杂鱼粉1、2)，另外五种是初步判断未掺杂的纯鱼粉样品(包括三种国产纯鱼粉1、2、3及两种进口纯鱼粉1、2)。按照实施例1中2.1的方法提取上述7种鱼粉样品的dna，并进行浓度检测。以提取得到的dna为模板，利用实施例1设计的引物seq id no.1-2与方法进行实时荧光pcr扩增，扩增条件与扩增体系同实施例1的2.2部分。每个样品做三个平行实验技术重复，得到荧光定量pcr扩增曲线(图4)及对应的ct值(表3)。
[0060]
表3七种鱼粉样品荧光定量pcr扩增的ct值
[0061][0062][0063]
注：n/a表示无ct值。
[0064]
由图4和表3可知，五种纯鱼粉，荧光定量pcr的ct值均在37以上，大于临界值34，判定为未检出南美白对虾成分。而两种疑似掺杂了的鱼粉样品，荧光定量pcr的ct值分别为27.86
±
0.67和31.38
±
0.22，均小于临界值34，判断为掺有一定比例的南美白对虾成分。依据表2建立的质量浓度和ct值之间的对应关系，判断掺杂鱼粉1、2中南美白对虾的掺杂比例均在0.1～1％之间。由此可见，本发明的荧光定量pcr方法，可对鱼粉中掺入的南美白对虾成分进行定性和初步定量鉴定。
[0065]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的引物对，其特征在于，包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。2.一种如权利要求1所述的引物对在制备pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定性检测试剂盒或定量检测试剂盒。4.一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为定性检测试剂盒或定量检测试剂盒。6.一种如权利要求1所述的引物对或权利要求4或5所述的试剂盒在pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分中的应用。7.一种从鱼粉原料中定性检测南美白对虾源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检鱼粉原料样品的dna；(2)以所述dna为模板，用权利要求1所述的引物对进行荧光定量pcr扩增，得到荧光扩增曲线和ct值；(3)进行定性结果判定：当出现荧光扩增曲线且ct值＜34时，所述待检鱼粉原料样品中含有南美白对虾源性成分；当未出现荧光扩增曲线或ct值≥34时，所述待检鱼粉原料样品中不含南美白对虾源性成分。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2
×
chamqsybrqpcrmastermix10μl、10μmol/l的上游引物0.4μl、10μmol/l的下游引物0.4μl、模板2μl和超纯无菌水7.2μl；反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。9.一种从鱼粉原料中定量检测南美白对虾源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备南美白对虾源性成分不同质量含量的标准品样品，分别提取样本dna，并将其作为模板，分别用权利要求1所述的引物对进行荧光定量pcr扩增，绘制得到关于南美白对虾质量含量和ct值的标准曲线；(2)提取待检鱼粉原料样品的dna，并将其为模板，用权利要求1所述的引物对进行荧光定量pcr扩增，得到对应的ct值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算得到所述待检鱼粉原料样品中的南美白对虾源性成分含量。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)中，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2
×
chamqsybrqpcrmastermix10μl、10μmol/l的上游引物0.4μl、10μmol/l的下游引物0.4μl、模板2μl和超纯无菌水7.2μl；反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

技术总结
本发明公开了一种PCR检测鱼粉中南美白对虾源性成分的方法，涉及生物技术领域。该方法包括利用如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，进行PCR检测的步骤。本发明首先设计了南美白对虾荧光定量PCR引物对，并验证了其特异性。随后用该引物对对样品中不同浓度梯度的南美白对虾DNA进行荧光定量PCR扩增，获得标准曲线，建立南美白对虾DNA浓度和Ct值之间的回归方程。在此基础上，通过检测待测鱼粉样品的Ct值，判断待测鱼粉中是否含有南美白对虾源性成分，并明确其含量(质量浓度)范围，最低检出限可以达到0.01％。最低检出限可以达到0.01％。最低检出限可以达到0.01％。


技术研发人员：周萌 梁日深 何浩斌 陈玉佩 叶嘉文 黄燕华
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/25