一套适于构建绿豆品种DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及其应用

一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合及其应用
技术领域
1.本发明属于绿豆品种分子生物领域，尤其涉及一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合及其应用。


背景技术：

2.绿豆是最主要的食用豆类栽培种之一，属于药食同源作物，是食品工业、饲料工业、医药轻工业的重要原料，在温带、亚热带和热带高海拔地区被广泛种植。绿豆具有生育期短、抗旱耐瘠等特点，且可以与根瘤菌共生固氮，在自然灾害严重的年份还可作为减灾救灾作物大面积种植，在农业种植结构优化调整和优质粮食工程深入推进过程中具有其他作物不可替代的作用。近年来，随着绿豆杂交育种技术的快速发展，国内外绿豆新品种数量也逐年增加。为了快速获得高产优质绿豆新品种，各科研单位往往选用少数优良品种作为骨干亲本进行杂交选种，但这也致使所育成品种的相似性越来越高。此外，传统的鉴定方法对于一些性状差异较小、亲缘关系较近品种的鉴定十分困难，给绿豆种质资源和品种鉴定带来了诸多不便。因此，亟需简便、准确的分子标记新方法来对绿豆种质资源和品种进行鉴定。
3.分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、供选择的标记数量多、且可以进行高通量测试分析等优势，已逐步应用于作物新品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测中。rflp、ssr以及snp标记等分子标记分析方法以dna多态性为基础，均可以产生个体高度特异的dna指纹图谱。在分子标记分析技术发展早期，rflp、rapd及aflp等分子标记技术曾被应用于绿豆的遗传多样性分析、遗传图谱构建及qtl定位等研究，但由于上述标记或者操作过程较为繁琐，不易掌握，或者由于重复性差、多态性低等缺陷，限制了它们在绿豆遗传研究中应用。由于snp标记具有覆盖全基因组、高通量、位点特异、共显性遗传、误检率低、开发和检测成本急剧降低、数据易整合等优点，将成为未来基因型鉴定的主要标记类型。
4.随着二代测序技术的发展，测序成本则急剧降低，绿豆参考基因组、转录组等相继公布，这为全基因组水平snp标记的检测提供了强有力的技术支持。每个物种基因组上均存在丰富的snp，如何依据不同鉴定目标，制定snp位点筛选原则、位点数目、位点组合、判定阈值等已成为筛选snp构建指纹图谱的关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合及其应用。以解决现有技术中使用rapd、issr等共显性dna标记，重复性差、多态性低的问题；提供绿豆核基因组snp分子标记的多态性引物在绿豆品种鉴定、遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用，为从分子水平鉴定绿豆种质资源和栽培品种提供依据。
6.为实现上述目的，具体技术方案如下：
7.本发明的第一个目的是提供一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合，所述用于snp分子标记的引物组如seq id no.51-150中所示。
8.进一步的，所述snp分子标记组合包括lg01_12136817、和/或lg01_16432823、和/或lg01_22412805、和/或lg01_33044217、和/或lg01_33343536、和/或lg02_12678057、和/或lg02_14230588、和/或lg02_21774006、和/或lg02_29670796、和/或lg02_38311102、和/或lg02_38493859、和/或lg03_12981805、和/或lg03_16678231、和/或lg04_3472843、和/或lg04_38399653、和/或lg04_41866894、和/或lg04_43614331、和/或lg04_4869630、和/或lg04_52114810、和/或lg04_9439716、和/或lg04_9492017、和/或lg05_347939、和/或lg05_4873112、和/或lg05_7208057、和/或lg05_8716051、和/或lg06_14067104、和/或lg06_16264862、和/或lg06_24079893、和/或lg07_14532544、和/或lg07_1895868、和/或lg07_1902574、和/或lg07_31160347、和/或lg07_58388344、和/或lg07_60802126、和/或lg07_66723644、和/或lg07_70319566、和/或lg08_2016093、和/或lg08_32495697、和/或lg08_33987953、和/或lg08_34216468、和/或lg08_3805787、和/或lg08_9277873、和/或lg09_2691586、和/或lg09_3295602、和/或lg10_841651、和/或lg010_2008455、和/或lg11_12648275、和/或lg11_21924898、和/或lg11_27584066、和/或lg11_2781499。
9.进一步的，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1-50中所示。
10.进一步的，所述绿豆品种包括绿豆(春33)(g009)、鹦哥绿豆(g017)、绿豆(g020)、绿豆(g025)、绿豆(g033)、绿豆(g041)、串地龙绿豆(g052)、小绿豆(g056)、洋绿豆(g060)、黄绿豆(g066)、黄绿豆(g071)、小绿豆(g072)、元绿豆(g075)、绿豆(g086)、小绿豆(g091)、小绿豆(g095)、大八角(g097)、金绿豆(g105)、绿豆(g118)、小绿豆(g120)、一撮荚(g126)、明绿豆(g132)、摘角绿豆(g139)、黄绿豆(g141)、v3476(g159)、vc2917(g161)、berkenx109897f7#089(g214)、河南黑绿豆(g215)、冀绿9号(g219)、中绿13号(g237)、中绿3号(g238)、绿豆(g249)、黄花生绿豆(g253)、绿豆(g254)、小明粒(g260)、吉绿6号(g276)、苏绿16-10(g286)、绿豆(ril101)、绿豆(ril25)、野生绿豆(wt)。
11.本发明的第二个目的是提供一套利用snp分子标记组合构建绿豆品种dna指纹图谱的方法，包括以下步骤：(1)提取各个绿豆品种的叶片总dna；利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光度计检测总dna的质量，使提取的总dna完整性好，且a260/a280比值在1.6-2.0之间，然后将总dna稀释成100ng/μl，储存于-20℃备用；(2)以上述所述的40个绿豆品种为样本，进行基因组重测序；(3)基于绿豆基因组重测序数据，与绿豆
‘
vc1973a’和
‘
冀绿7号’参考基因组比对，挖掘snp位点，根据以下原则进行snp标记候选位点的筛选分析：(a)最小等位基因频率maf》0.4；(b)缺失率《0.2；(c)杂合度《0.2；(d)上下游200bp无序列变异；(e)双等位基因位点；(f)染色体分布情况清晰；(g)在基因组上均匀分布；(4)对snp标记进行引物设计，转化为kasp标记，进行pcr扩增，读取终点荧光信号，使用perl语言程序，最终筛选出50个高质量、单拷贝、高多态性的snp标记，用于对不同来源的40个绿豆品种进行基因分型，从而构建成绿豆品种dna指纹图谱。
12.本发明的第二个目的是提供一种绿豆品种的鉴定方法，采用上述所述的引物组对待测样品的总dna进行pcr扩增，然后进行snp位点的荧光信号读取，根据荧光信号的检测结果确定该样本的基因型，再与上述的绿豆品种dna指纹库中的基因分型进行比对，最终对样
本进行精准鉴定。
13.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
14.(1)本发明筛选的50个snp分子标记特异性、灵敏度和分辨力高，该snp分子标记不受环境条件影响，且检测结果准确、重复性和稳定性好，能够全面揭示绿豆遗传多样性真实水平利用。
15.(2)利用该套snp标记组合建立dna指纹图谱库，可以对绿豆品种进行聚类分析和品种鉴定，使得检测结果更精准、高效，为绿豆种质资源创新利用提供理论依据，首次有效区分出绿豆40个品种，本发明对育成品种的区分率可达100％。
16.(3)利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。
附图说明
17.图1为本发明实施例2中基于kasp基因分型构建的绿豆dna指纹图谱(注：一行为一个标记，一列为一个样品；纯合基因型c/c、杂合基因型用黑色表示；纯合基因型a/a、g/g用深灰表示，纯合基因型t/t用浅灰表示)；
18.图2为本发明实施例2基于snp的绿豆品种ml聚类分析图(图2是树的一种展示方式，树形拓扑结构直观展示了不同物种之间的进化关系，亲缘关系较近物种的进化分枝往往聚成一簇)；
19.图3为本发明实施例2核心snp对绿豆品种的识别率。
具体实施方式
20.以下参考附图1-3对本发明的具体实施方式进行详细说明，仅用于对本发明提供进一步说明解释，以更好地理解本发明。但并不构成对本发明的限制。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
21.实施例1：绿豆snp位点的筛选与确定
22.(1)提取各个绿豆品种的叶片总dna；利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光度计检测总dna的质量，使提取的总dna完整性好，且a260/a280比值在1.6-2.0之间，然后将总dna稀释成100ng/μl，储存于-20℃备用；
23.(2)以40个绿豆品种(如表2所示)为样本，进行基因组重测序(具体参照“示)为样本，进行基因组重测序(具体参照liu cy,wang y,peng jx,et al.high-quality genome assembly and pan-genome studies facilitate genetic discovery in mung bean and its improvement.plant communications,2022,3(6):100352.)；
24.(3)基于绿豆基因组重测序数据，与绿豆
‘
基于绿豆基因组重(http://plantgenomics.snu.ac.kr/)和
‘
冀绿7号’(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.1958344)参考基因组比对，挖掘snp位点，根据以下原则进行snp标记候选位点的筛选分析：(a)最小等位基因频率maf》0.4； (b)缺失率《0.2； (c)杂合度《0.2； (d)上下游200bp无序列变异； (e)双等位基因位点；(f)染色体分布情况清晰；(g)在基因组上均匀分布；
25.(4)对snp标记进行引物设计，转化为kasp标记，进行pcr扩增，读取终点荧光信号，
使用perl语言程序，最终筛选出50个高质量、单拷贝、高多态性的snp标记，用于不同来源的40个绿豆品种鉴定、群体遗传结构和绿豆资源遗传多样性分析。50个snp分子标记的序列信息如表1所示。
26.表1.50个绿豆snp分子标记信息
27.28.29.30.31.[0032][0033]
实施例2：绿豆snp标记的测序验证与应用
[0034]
1、供试材料
[0035]
供试材料来源于南阳师范学院豫西南食用豆种质资源中心，选取40个绿豆品种(如表2)，每个品种分别采集3株不同植株的叶片，经液氮速冻，于-80℃冰箱保存，用于提取绿豆叶片dna。
[0036]
表2.本发明中用于绿豆品种鉴定的材料信息
[0037][0038]
2、绿豆总dna提取与检测
[0039]
根据ctab法提取所述各个绿豆品种的叶片总dna，然后用琼脂糖凝胶电泳、nanodrop one微量核酸浓度测定仪检测各品种的总dna质量，以确保所提取的各个绿豆品种总dna完整性好，且a260/a280比值在1.6-2.0之间。
[0040]
3、snp引物设计与筛选
[0041]
根据上述筛选的50个snp分子标记位点序列信息，使用引物设计软件primer3plus设计pcr反应引物，设计了100对snp引物，经筛选后共得到50对特异性较好且多态性较高的snp扩增引物，具体见表3。
[0042]
表3.40对绿豆snp标记扩增引物信息
[0043]
[0044]
[0045][0046]
4、分型实验
[0047]
4.1pcr扩增反应
[0048]
以前述提取获得的40个绿豆品种的基因组dna为模版，利用表3的引物组，扩增出含snp位点的核苷酸片段：在1.5ml ep管中配置kasp基因分型混合液，并振荡低速离心。选用8道移液器，在96孔板的每个加样孔中加入5μl 2x kasp master mix，0.14μl kbdassay mix，上下游引物的混合物(浓度10pmol/μl，上下游引物的比例为1:1)1.0μl，最后加入3.86μl模板dna(20ng/μl)混匀，用荧光透视的膜将96孔板密封，防止pcr程序时出现蒸发。1000rpm离心1min。
[0049]
pcr扩增体系为：2x kasp mastermix 5μl、kbdassaymix 0.14μl、上下游引物的混合物(浓度10pmol/μl，上下游引物的比例为1:1)1.0μl、基因组dna(20ng)3.86μl，体系的总体积为10μl。
[0050]
pcr扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20sec，61-55℃复性/延伸60sec(-0.6℃/循环)，共10个循环；94℃变性20sec；55℃复性/延伸60sec，共26个循环。
[0051]
4.2、荧光数据读取与结果分析
[0052]
pcr反应结束后，使用酶标仪读取终点荧光信号读取，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，不同的snp模板对应不同的荧光产物。若所获数据对应的荧光信号较低，分群较散，可增加循环后进行荧光读取，建议根据试验结果来决定增加的循环数，同时保证ntc没有被扩增。将荧光数据导出，根据每孔对应的荧光信号判定该样本的基因型，进而确定不同样本在此snp位点的详细分型结果，40个绿豆品种的50个snp位点的基因型如表4-8和图1所示。
[0053]
表4.40个绿豆品种在50个snp位点的基因型(1)
[0054][0055]
[0056]
表5.40个绿豆品种在50个snp位点的基因型(2)
[0057]
[0058][0059]
表6.40个绿豆品种在50个snp位点的基因型(3)
[0060]
[0061][0062][0063]
表7.40个绿豆品种在50个snp位点的基因型(4)
[0064][0065]
[0066]
表8.40个绿豆品种在50个snp位点的基因型(5)
[0067]
[0068][0069]
根据样本间nei氏遗传距离，使用phangorn r包进行非加权组平均法构建系统发育树。对40个绿豆品种进行极大似然法(maximum likelihood，ml)聚类分析，结果显示一些亲缘关系较近的品系聚为一簇(如图2所示)，如鹦哥绿豆(g017)、小绿豆(g091)、绿豆(春33)(g009)聚为一簇；小绿豆(g056)、黄绿豆(g071)、绿豆(ril101)聚为一簇，表明50个snp标记能实现对40份绿豆品种的区分。
[0070]
本发明首次区分了40个绿豆品种，对育成品种的区分率可达100％。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。
[0071]
为了进一步筛选核心snp分子标记位点，从上述50个snp分子标记的位点中选择不同数量、不同组合的位点对40个品种进行区分，统计不同数量、不同组合的位点对于40个绿豆品种的区分率，以位点数量为横轴，以该位点数量下，不同位点组合的最大的区分率为纵轴作图，如图3所示。从图3可以看出，位点数量为8的时候，对40个品种的区分率可以达到100％。达到100％区分率的snp分子标记组合为：lg01_16432823、lg01_33044217、lg02_12678057、lg02_38493859、lg04_3472843、lg04_9492017、lg07_70319566和lg09_3295602。
[0072]
本发明基于绿豆重测序获得的snp，通过重测序质量控制、snp位点质量控制、snp筛选判定阈值设定等判定标准，以获得标准化的绿豆snp构建指纹图谱的流程，用来建立不同绿豆品种鉴定的技术体系。该技术体系能够快速、准确的对不同绿豆品种进行鉴定，能准确区分绿豆品种间差异并最大限度准确反映绿豆品种间的亲缘关系。
[0073]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合，其特征在于，所述用于snp分子标记的引物组如seq id no.51-150中所示。2.根据权利要求1所述的一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合，其特征在于，所述snp分子标记组合包括lg01_12136817、和/或lg01_16432823、和/或lg01_22412805、和/或lg01_33044217、和/或lg01_33343536、和/或lg02_12678057、和/或lg02_14230588、和/或lg02_21774006、和/或lg02_29670796、和/或lg02_38311102、和/或lg02_38493859、和/或lg03_12981805、和/或lg03_16678231、和/或lg04_3472843、和/或lg04_38399653、和/或lg04_41866894、和/或lg04_43614331、和/或lg04_4869630、和/或lg04_52114810、和/或lg04_9439716、和/或lg04_9492017、和/或lg05_347939、和/或lg05_4873112、和/或lg05_7208057、和/或lg05_8716051、和/或lg06_14067104、和/或lg06_16264862、和/或lg06_24079893、和/或lg07_14532544、和/或lg07_1895868、和/或lg07_1902574、和/或lg07_31160347、和/或lg07_58388344、和/或lg07_60802126、和/或lg07_66723644、和/或lg07_70319566、和/或lg08_2016093、和/或lg08_32495697、和/或lg08_33987953、和/或lg08_34216468、和/或lg08_3805787、和/或lg08_9277873、和/或lg09_2691586、和/或lg09_3295602、和/或lg10_841651、和/或lg010_2008455、和/或lg11_12648275、和/或lg11_21924898、和/或lg11_27584066、和/或lg11_2781499。3.根据权利要求2所述的一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合，其特征在于，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1-50中所示。4.根据权利要求1所述的一套适于构建绿豆品种dna指纹图谱的snp分子标记组合，其特征在于，所述绿豆品种包括绿豆(春33)(g009)、鹦哥绿豆(g017)、绿豆(g020)、绿豆(g025)、绿豆(g033)、绿豆(g041)、串地龙绿豆(g052)、小绿豆(g056)、洋绿豆(g060)、黄绿豆(g066)、黄绿豆(g071)、小绿豆(g072)、元绿豆(g075)、绿豆(g086)、小绿豆(g091)、小绿豆(g095)、大八角(g097)、金绿豆(g105)、绿豆(g118)、小绿豆(g120)、一撮荚(g126)、明绿豆(g132)、摘角绿豆(g139)、黄绿豆(g141)、v3476(g159)、vc2917(g161)、berkenx109897f7#089(g214)、河南黑绿豆(g215)、冀绿9号(g219)、中绿13号(g237)、中绿3号(g238)、绿豆(g249)、黄花生绿豆(g253)、绿豆(g254)、小明粒(g260)、吉绿6号(g276)、苏绿16-10(g286)、绿豆(ril101)、绿豆(ril25)、野生绿豆(wt)。5.一套利用如权利要求1-4任一所述的snp分子标记组合构建绿豆品种dna指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取各个绿豆品种的叶片总dna；利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光度计检测总dna的质量，使提取的总dna完整性好，且a260/a280比值在1.6-2.0之间，然后将总dna稀释成100ng/μl，储存于-20℃备用；(2)以权利要求4所述的40个绿豆品种为样本，进行基因组重测序；(3)基于绿豆基因组重测序数据，与绿豆
‘
vc1973a’和
‘
冀绿7号’参考基因组比对，挖掘snp位点，根据以下原则进行snp标记候选位点的筛选分析：(a)最小等位基因频率maf>0.4；(b)缺失率<0.2；(c)杂合度<0.2；(d)上下游200bp无序列变异；(e)双等位基因位点；(f)染色体分布情况清晰；(g)在基因组上均匀分布；(4)对snp标记进行引物设计，转化为kasp标记，进行pcr扩增，读取终点荧光信号，使用perl语言程序，最终筛选出50个高质量、单拷贝、高多态性的snp标记，用于对不同来源的40个绿豆品种进行基因分型，从而构建成绿豆品种dna指纹图谱。6.一种绿豆品种的鉴定方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物组对待测样品的
总dna进行pcr扩增，然后进行snp位点的荧光信号读取，根据荧光信号的检测结果确定该样本的基因型，再与权利要求5所述的绿豆品种dna指纹库中的基因分型进行比对，最终对样本进行精准鉴定。

技术总结
本发明公开了一套适于构建绿豆品种DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及其应用。本发明筛选的50个SNP分子标记特异性、灵敏度和分辨力高，该SNP分子标记不受环境条件影响，且检测结果准确、重复性和稳定性好，能够全面揭示绿豆遗传多样性真实水平利用；利用该套SNP分子标记组合建立DNA指纹图谱库，可以对绿豆品种进行聚类分析和品种鉴定，使得检测结果更精准、高效，为绿豆资源保护利用提供理论依据，首次有效区分40个绿豆品种，本发明对自然群体品种的区分率可达100％。利用本发明的SNP分子标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。够实现生产中大规模的应用。够实现生产中大规模的应用。


技术研发人员：杨树琼 刘嘉斐 陈吉宝 常玮 张雨朋 姚伦广
受保护的技术使用者：南阳师范学院
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/25