一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球及其合成与固定化脂肪酶

一种fe3o4@pmma/pamam微球及其合成与固定化脂肪酶
技术领域
1.本发明属于酶的固定化与酶工程技术领域，具体涉及一种聚酰胺-胺树枝状大分子(pamam)接枝的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)磁性微球fe3o4@pmma/pamam的合成及其在固定化脂肪酶中的应用。


背景技术：

2.随着人类社会的发展，酶的重要性愈发凸显。因为与传统的化学催化剂相比，酶具有高效性、特异性、选择性以及反应条件温和等优势。最重要的是使用酶作为催化剂对环境友好，符合绿色可持续发展的理念。脂肪酶是一类功能多样，能催化酯分解、酯合成、酯交换等多种化学反应的酶，广泛应用于食品加工、药物合成、生物燃料生产、污染物去除等领域。但是由于游离酶的稳定性差，活性易受外界环境和反应条件影响而损失，难以分离回收再利用，通常不适合实际应用。酶固定化是提高游离酶的稳定性和重复使用性的一个简单且有效的方法。迄今为止，物理吸附、包埋和共价交联是将酶固定化到载体上的常用方法。由于酶和载体间通过弱相互作用相连，物理吸附和包埋两种方式可以使酶保持较高的酶活，但是容易使酶从载体上脱落。共价交联是一种有效的酶固定化方法，由于酶和载体间引入了化学键，使酶和载体间的连接很稳定。目前，戊二醛活化是共价连接酶和载体的最普遍的方法之一。
3.酶固定化中的载体自身的结构和特性对固定化酶的性能有很大影响，但是目前大部分普遍应用的酶固定化的载体都有着一些缺点。因此，开发一种性能优秀的酶固定化的载体是在酶的实际应用中亟待解决的重要问题。将几种载体结合起来应用，从而取得性能更好的酶固定化的载体是一种有效的解决办法。磁性材料除了具有粒径小、体积小、比表面积大、生物相容性好、低毒性等优点外，还拥有独特的超顺磁性且磁响应性强，这使其可以在外加磁场下实现快速分离回收。因此，磁性材料受到了大量的关注。fe3o4纳米颗粒已经在酶的固定化中得到了广泛应用，但由于fe3o4化学活性高，在空气中容易被氧化，而且由于缺乏有效的修饰方法，fe3o4表面功能基团的数量受限，这直接影响了固定化酶的性能。聚酰胺-胺树枝状大分子是一组具有规则且结构明确的有机聚合物，有着高度分支的分子结构和丰富且多功能的表面基团。聚酰胺-胺树枝状大分子的理化性质可调，可以通过调整其结构来精确控制其性质，如形状、大小、极性和不同单元的官能团排列，从而获得优异的物理和化学特性。聚酰胺-胺树枝状大分子的大小、外部功能基团的密度和刚性取决于它的接枝代数，树枝状大分子的接枝代数越高，灵活性越低，外部官能团的数量则呈指数增长，可以为附着酶提供更多的反应位点。聚酰胺-胺树枝状大分子这类超支化聚合物还拥有优秀的生物相容性、稳定性和灵活性等优秀特性。在酶固定化领域中，聚酰胺-胺树枝状大分子有着巨大的潜力，因为聚酰胺-胺树枝状大分子可以促进酶与载体之间的多点相互作用，还可以保护酶的构象，其分支结构也可以为酶提供缓冲作用，以保护酶不直接附着在载体的表面。但与其他的大部分载体类似，难以分离回收是聚酰胺-胺树枝状大分子在酶固定化中作为载体的主要缺点。本发明将聚酰胺-胺树枝状大分子接枝到聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球
上，合成的材料兼具磁性材料以及聚酰胺-胺树枝状大分子的优点且弥补了两者的缺陷。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种fe3o4@pmma/pamam微球的制备方法，并将其应用于固定化脂肪酶。采用共沉淀法制备了油酸修饰的fe3o4，再通过悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，使用发散合成法合成了fe3o4@pmma/pamam微球。然后使用戊二醛作为交联剂，将fe3o4@pmma/pamam微球应用于脂肪酶的固定化。fe3o4@pmma/pamam微球兼具磁性材料以及聚酰胺-胺树枝状大分子的优点且弥补了两者的缺陷。为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体包括如下步骤：
5.(1)将3.33g fecl2·
4h2o和5.47g fecl3加入500ml的三颈烧瓶中，再向其中加入200ml去离子水并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至85℃，然后向反应体系中迅速倒入20ml nh3·
h2o，恒温反应5分钟后，向其中滴加7.5ml油酸，再恒温反应30分钟后，将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物并用去离子水洗涤产物，即可获得油酸修饰的fe3o4。经真空干燥后，将产物在室温下保存。
6.(2)将6.88g聚乙烯醇-1788和250ml去离子水加入500ml的三颈烧瓶中，将混合物在磁力搅拌的条件下加热至90℃，然后加入6.25g nacl，完全溶解后，水相即制备完成；将3g油酸修饰的fe3o4、23.75ml甲基丙烯酸甲酯、2.5ml二乙烯苯和1g过氧化苯甲酰加入100ml烧杯中，将混合物在室温下搅拌，直至混合均匀后，油相即制备完成；将油相和水相在1000ml的三颈烧瓶中混合并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应10小时，反应完成后，将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物并用去离子水和乙醇依次洗涤产物，即可获得聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。经真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存。
7.(3)将7.5g聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、150ml n,n-二甲基甲酰胺和75ml乙二胺加入500ml的三颈烧瓶中并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应8小时，然后将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤产物，将获得的氨化的磁性聚合物微球命名为g-0。经真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存；将7.5g经酰胺化反应后获得的磁性聚合物微球、150ml n,n-二甲基甲酰胺和50ml丙烯酸甲酯加入500ml的三颈烧瓶中并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应8小时，反应完成后，将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤产物，经真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存；然后再进行一次酰胺化反应，所得的材料为第一代fe3o4@pmma/pamam微球，称之为g-1；重复上述反应即可制备第二代和第三代fe3o4@pmma/pamam微球，即g-2和g-3。
8.将20mg fe3o4@pmma/pamam微球、5ml ph为8.0的磷酸盐缓冲液和0.2ml戊二醛加入50ml的锥形瓶中。然后，将锥形瓶放入摇床中，在30℃，180rpm的条件下培养10小时，然后将活化的载体用磁铁磁分离并用去离子水洗涤；将20mg脂肪酶、5ml ph为8.0的磷酸盐缓冲液和活化后的载体加入50ml的锥形瓶中，随后，将锥形瓶放入摇床中，在35℃下，以180rpm的转速培养4小时后，将获得的固定化脂肪酶用磁铁磁分离并用去离子水洗涤。经真空冷冻干燥后，将产物在4℃下保存。
9.上述技术方案中所使用的脂肪酶是米曲霉脂肪酶。
10.本发明具有众多显著的优势，具体表现为：
11.fe3o4@pmma/pamam微球是一种微米级微球，这为脂肪酶的固定化提供了较大的比表面积。
12.fe3o4@pmma/pamam微球含有大量的氨基官能团，这使其可以连接大量的脂肪酶。
13.fe3o4@pmma/pamam微球具有超顺磁性以及优秀的磁响应性，这使其可以在外加磁场的作用下实现快速分离回收。
14.fe3o4@pmma/pamam微球可以促进脂肪酶与载体之间的多点相互作用，还可以保护脂肪酶的构象，其分支结构也可以为脂肪酶提供缓冲作用，以保护脂肪酶不直接附着在载体的表面。
15.fe3o4@pmma/pamam微球具有生物相容性好、毒性低、稳定性和灵活性高等优秀特性。
16.与游离脂肪酶相比，fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶能在更大的反应温度和反应ph值范围内保留较高的酶活。
17.在50℃下热处理5小时后，游离脂肪酶的剩余酶活仅为21.36％，固定化脂肪酶的剩余酶活则为55.52％。在ph为9.0的磷酸盐缓冲液中处理5小时后，游离脂肪酶的剩余酶活仅为30.49％，固定化脂肪酶的剩余酶活则为85.41％。fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶具有优秀的热稳定性和ph稳定性。
18.相较于游离脂肪酶，fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶对底物的亲和力更强。
19.重复使用10次后，固定化脂肪酶维持了82.12％的酶活。fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶有着优异的重复使用性。
20.在4℃下储存30天后，固定化脂肪酶保持了80.24％的酶活。fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶有着优异的储存稳定性。
21.固定化脂肪酶的酶活为2482u/g
载体
，载酶量为150mg
蛋白质
/g
载体
。fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶具有优秀的酶活和载酶量。
22.本发明制备的fe3o4@pmma/pamam微球弥补了磁性材料易被氧化且表面官能团数量受限和树枝状大分子难以分离回收的缺点，兼具了两者的优点，如超顺磁性且磁响应性强，比表面积大，稳定性、灵活性和生物相容性好，具有大量的功能基团等。fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶是一种稳定高效且有着广大前景的生物催化剂，fe3o4@pmma/pamam微球也是一种极具潜力和研究意义的优秀酶固定化载体并在生物催化领域有着广阔应用前景。
附图说明
23.图1为fe3o4@pmma/pamam微球和fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的制备方案。
24.图2为以不同接枝代数的fe3o4@pmma/pamam微球为载体的固定化脂肪酶的相对酶活。
25.图3为g-3的扫描电子显微镜(sem)图像。
26.图4为g-3的动态光散射激光粒度分析(dls)粒径分布。
27.图5为fe3o4@pmma/pamam微球的能量色散光谱(eds)结果。
28.图6为fe3o4@pmma/pamam微球的傅立叶变换红外光谱(ft-ir)谱图。
29.图7为fe3o4@pmma/pamam微球的振动样品磁强计(vsm)磁化曲线。
30.图8为fe3o4@pmma/pamam微球的x射线衍射(xrd)谱图。
31.图9为g-3和g-3固定化脂肪酶的热重量分析(tga)曲线。
32.图10为不同固定化条件对fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶相对酶活的影响：戊二醛用量(a)，脂肪酶浓度(b)，固定化时间(c)，固定化ph值(d)，固定化温度(e)。
33.图11为不同反应ph值(a)和反应温度(b)下的游离脂肪酶和fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的相对酶活。
34.图12为在50℃下的游离脂肪酶和fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的热稳定性(a)，在ph为9.0下的游离脂肪酶和fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的ph稳定性(b)。
35.图13为游离脂肪酶和fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的棕榈酸对硝基苯酯水解反应动力学。
36.图14为fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的重复使用性(a)和储存稳定性(b)。
具体实施方式
37.本发明的实验路线如图1所示。为了更加明确且详细地描述本发明的技术方案，下面结合具体实施方式和附图说明对本发明提供的一种fe3o4@pmma/pamam微球的合成及其固定化脂肪酶进行完整的说明。以下所述的实施例仅用于帮助理解本发明而非用于对本发明进行具体的限制。
38.实施例1：fe3o4@pmma/pamam微球的合成
39.1)通过共沉淀法制备了油酸修饰的fe3o4。将3.33g fecl2·
4h2o和5.47g fecl3加入500ml的三颈烧瓶中，再向其中加入200ml去离子水并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至85℃，然后向反应体系中迅速倒入20ml质量浓度25％的nh3·
h2o，恒温反应5分钟后，向其中滴加7.5ml油酸，再恒温反应30分钟后，将产物冷却至室温，在外加磁场下磁固液分离并用去离子水洗涤固体产物，即可获得油酸修饰的fe3o4。经过真空干燥后，将产物在室温下保存。
40.2)通过悬浮聚合反应合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。将6.88g聚乙烯醇-1788和250ml去离子水加入500ml的三颈烧瓶中，将混合物在磁力搅拌的条件下加热至90℃，然后加入6.25g nacl，完全溶解后，水相即制备完成；将3g油酸修饰的fe3o4、23.75ml甲基丙烯酸甲酯、2.5ml二乙烯苯和1g过氧化苯甲酰加入100ml烧杯中，将混合物在室温下搅拌，直至混合均匀后，油相即制备完成；将油相和水相在1000ml的三颈烧瓶中混合并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应10小时，反应完成后，将产物冷却至室温，在外加磁场下磁固液分离并用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，即可获得聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。经过真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存。
41.3)通过酰胺化反应和迈克尔加成反应合成了fe3o4@pmma/pamam微球。酰胺化反应：将作为原料的7.5g聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、150ml n,n-二甲基甲酰胺和75ml乙二胺加入500ml的三颈烧瓶中并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应8小时，然后将产物冷却至室温，在外加磁场下磁固液分离产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，将获得的氨化的磁性聚合物微球命名为g-0，经过真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存；迈克尔加成反应：将作为原料的7.5g经酰胺化反应后获得的磁性聚合物微球g-0、
150ml n,n-二甲基甲酰胺和50ml丙烯酸甲酯加入500ml的三颈烧瓶中并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应8小时，反应完成后，将产物冷却至室温，在外加磁场下磁分离固液产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，经过真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存；然后将收集的固体代替酰胺化反应中的聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球再进行一次酰胺化反应(操作过程和条件同上述酰胺化反应)，所得的材料为第一代fe3o4@pmma/pamam微球，称之为g-1；4)以g-1代替上述步骤3)的原料重复上述步骤3)的反应即可制备第二代fe3o4@pmma/pamam微球，即g-2；5)以g-2代替上述步骤3)的原料重复上述步骤3)的反应即可制备第三代fe3o4@pmma/pamam微球，即g-3。
42.实施例2：脂肪酶酶活和固定化酶载酶量的测定
43.使用棕榈酸对硝基苯酯水解产生对硝基苯酚的反应测定游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活。通过检测在405nm处的吸光度，采用标准曲线法测定对硝基苯酚的浓度。
44.酶活力单位(u)定义为在一定条件下每分钟能水解棕榈酸对硝基苯酯产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量。具体过程如下：
45.将0.8g曲拉通x-100、0.2g阿拉伯树胶和100ml ph为8.0的磷酸盐缓冲液加入250ml烧杯中，搅拌至完全溶解，即为a液；将棕榈酸对硝基苯酯溶解到异丙醇中，即为b液；将a液和b液按3:1的体积比例混合均匀，配制成底物(棕榈酸对硝基苯酯)的质量浓度为5mg/ml的溶液，超声处理10分钟后，形成底物溶液；将1mg游离脂肪酶或固定化脂肪酶与3ml底物溶液加入10ml离心管中，然后在50℃下水浴加热反应10分钟，反应完成后，加入2ml 0.25mol/l na2co3溶液终止反应，再将其以6000rpm的转速离心10分钟，测定酶活。
46.脂肪酶的酶活按下式计算：
[0047][0048]
其中，c为对硝基苯酚的浓度(μmol/ml)，v为溶液的总体积(ml)，t为反应时间(分钟)，m为游离酶或固定化脂肪酶的质量(g)。
[0049]
酶负载量按下式计算：
[0050][0051]
其中，c1是脂肪酶的初始浓度(mg/ml)，c2是脂肪酶的剩余浓度(mg/ml)，v是溶液的总体积(ml)，m为载体的质量(g)。
[0052]
实施例3：fe3o4@pmma/pamam微球固定化米曲霉脂肪酶及接枝代数对固定化脂肪酶酶活(按实施例2方法测定)的影响
[0053]
将20mg fe3o4@pmma/pamam微球(分别为g-1、g-2或g-3)、5ml ph为8.0的磷酸盐缓冲液和0.2ml戊二醛加入50ml的锥形瓶中。然后，将锥形瓶放入摇床中，在30℃，180rpm的条件下培养10小时，然后将活化的载体(fe3o4@pmma/pamam微球)用磁铁磁磁分离并用去离子水洗涤后保存；
[0054]
将20mg米曲霉脂肪酶、5ml ph为8.0的磷酸盐缓冲液和活化后的载体加入50ml的锥形瓶中，随后，将锥形瓶放入摇床中，在35℃下，以180rpm的转速培养4小时后，将获得的固定化脂肪酶在外加磁场下磁分离并用去离子水洗涤，经真空冷冻干燥后，将产物在4℃下
保存。
[0055]
fe3o4@pmma/pamam微球的接枝代数是影响固定化脂肪酶酶活的重要因素，因为不同接枝代数的fe3o4@pmma/pamam微球有着不同的氨基含量。
[0056]
以g-1、g-2和g-3为载体的固定化脂肪酶的相对酶活如图2所示，其中，固定化脂肪酶的最高酶活视为100％。显然，固定化脂肪酶的酶活随着接枝代数的增加而增加，使用g-3作为载体的固定化脂肪酶拥有最高的酶活，而以g-1和g-2为载体的固定化脂肪酶的酶活分别为g-3的73.74％和86％。主要原因是随着接枝代数的增加，载体含有的氨基数量也在增加，可以连接更多的脂肪酶，提高了固定化脂肪酶的酶活。因此，g-3作为固定化脂肪酶的载体被用于后续的实验中(下面的实施例均采用g-3载体)。
[0057]
将脂肪酶固定化时的上清液和洗涤液收集，使用bradford法测定固定化脂肪酶的酶负载量。
[0058]
实施例4：fe3o4@pmma/pamam微球的表征
[0059]
通过sem观察了g-3的形貌和大小。g-3的sem图像如图3所示，g-3大致具有球形形貌，平均直径在2-3μm之间，g-1和g-2的形貌与g-3类似，这为脂肪酶的固定化提供了较大的比表面积。
[0060]
通过dls测定了g-3的粒径分布。g-3的粒径分布如图4所示，g-3的大小大致分布在1.5-4.0μm之间且g-3的平均直径为2.6μm，这与通过sem观测的结果一致。
[0061]
通过eds分析了fe3o4@pmma/pamam微球的化学组成并验证了不同接枝代数树枝状大分子的接枝反应的成功发生。g-1、g-2和g-3的n元素占比如图5a所示，g-1、g-2和g-3的n元素含量分别为0.995％、1.175％和1.360％。fe3o4@pmma/pamam微球上的n元素的主要来源是酰胺和氨基。显然，n元素的比例随着接枝代数的增加而增加，这说明了不同接枝代数树枝状大分子的接枝反应的成功发生。g-3的eds映射图像如图5b-f所示，使用多种颜色绘制了eds映射图像，fe元素为蓝色，c元素为黄色，o元素为红色，n元素为绿色，结果表明fe、c、o、n四种元素均匀分布在g-3上。
[0062]
通过ea验证了不同接枝代数的树枝状大分子接枝的磁性聚合物微球的成功合成，它还可以用来分析fe3o4@pmma/pamam微球的c元素、n元素、h元素的组成比例。g-1、g-2和g-3中所含的c元素、n元素和h元素的质量百分比如表1所示，显然，c、n、h三种元素的比例均随着接枝代数的增加而增加，这说明了不同接枝代数的fe3o4@pmma/pamam微球均被成功制备。g-1、g-2和g-3的n元素含量分别为0.99％、1.13％和1.26％，这与eds分析的结果相似。
[0063]
表1.通过元素分析仪(ea)检测的fe3o4@pmma/pamam微球的结果
[0064][0065]
通过ft-ir，在400-4000cm-1
的范围内，检测了fe3o4@pmma/pamam微球所含的化学
键。g-1、g-2和g-3的ft-ir谱图如图6所示，g-1、g-2和g-3均在590cm-1
处有着fe-o键伸缩振动的特征吸收峰，结果表明g-1、g-2和g-3都含有fe3o4。g-1、g-2和g-3还在1690cm-1
，1565cm-1
和1410cm-1
处具有特征吸收峰，这与-co-nh-键的伸缩振动有关，这说明了酰胺化反应和迈克尔加成反应的成功进行。g-1、g-2和g-3的c
–
h键和n-h键的伸缩振动特征吸收峰则出现在2950cm-1
和3430cm-1
处。并且，ft-ir曲线也随着接枝代数的增加而展现出更强的特征吸收峰。从ft-ir谱图中也可以看出，g-1、g-2和g-3均被成功合成。
[0066]
通过vsm，在室温且磁场强度为2t的条件下，测定了fe3o4@pmma/pamam微球的磁性特征。g-1、g-2和g-3的磁化曲线如图7所示，g-1、g-2和g-3均具有极低的剩磁和矫顽力以及完美的s型磁滞回线，这证明了g-1、g-2和g-3都拥有超顺磁性。g-1、g-2和g-3的最大饱和磁化强度值分别为25.58emu/g、25.01emu/g和24.65emu/g，结果表明最大饱和磁化强度值随着树枝状大分子的修饰反应的逐步进行而降低，这是因为随着接枝代数的增加，越来越多的非磁性聚合物被修饰在材料表面，导致最大饱和磁化强度值的降低。fe3o4@pmma/pamam微球不仅具有较高的最大饱和磁化强度值，还有着超顺磁性和优秀的磁响应性，这使其可以在外加磁场的作用下实现快速分离回收。在实际应用中，fe3o4@pmma/pamam微球固定化酶的分离回收和重复使用是非常便利的。
[0067]
通过xrd，在扫描速度为5
°
/min且扫描范围(2θ)为10
°‑
90
°
的条件下，检测了fe3o4@pmma/pamam微球的晶体结构。g-1、g-2和g-3的xrd谱图如图8所示，g-1、g-2和g-3都在2θ＝30.25
°
，35.55
°
，43.10
°
，53.88
°
，57.24
°
和62.93
°
处有着六个衍射峰，与标准fe3o4的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)的xrd峰相比(jcpds card no.65-3107)，峰位置基本相同。结果表明fe3o4@pmma/pamam微球的晶体结构在修饰过程中没有发生改变，即g-1、g-2和g-3都含有fe3o4。
[0068]
通过tga，在30-500℃的范围内，升温速率为10℃/min且有氮气保护的条件下，确定了脂肪酶是否被成功固定化到fe3o4@pmma/pamam微球上。g-3和使用g-3作为载体的固定化脂肪酶的热重曲线如图9所示，g-3和固定化脂肪酶的质量在300℃以下发生了略微地下降，分别为6.53％和6.26％，这主要归因于结合水的蒸发。而g-3和固定化脂肪酶的质量在300℃以上则迅速损失，分别为47.48％和56.79％，这主要是由有机层的热分解引起的。相较于g-3，固定化脂肪酶的重量损失更多，这与固定在载体上的脂肪酶的部分分解有关，这证明了脂肪酶被成功固定化到载体上。
[0069]
实施例5：脂肪酶固定化的工艺优化
[0070]
固定化过程中的最优固定化条件需要被确定以获得有着优秀性能的固定化脂肪酶。戊二醛用量、脂肪酶浓度、固定化时间、固定化ph值和固定化温度都是影响固定化脂肪酶酶活的重要因素。
[0071]
戊二醛用量的优化：参照实施例3中所述的方案进行操作(载体g-3)，过程和条件同实施例3，与其不同之处在于，分别以0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml戊二醛活化载体g-3来研究戊二醛用量对固定化脂肪酶活性的影响，其中，固定化脂肪酶的最高活性视为100％(实施例3中戊二醛用量0.2ml)，其活性变化如图10a所示。当戊二醛用量较少时，固定化脂肪酶的酶活随着戊二醛用量的增加而增加。当戊二醛用量为0.2ml时，固定化脂肪酶有着最高的酶活。当戊二醛用量进一步增加，固定化脂肪酶的酶活逐渐降低。这是因为当戊二醛用量较少时，仅有部分脂肪酶可以被连接到载体上，所以固定化脂肪酶的酶活较低。
而当戊二醛用量较多时，会导致部分活化的载体发生过度偶联，使其连接脂肪酶的能力降低，并且引起脂肪酶酶活的损失，所以固定化脂肪酶的酶活较差。因此，选择0.2ml作为最优的戊二醛用量用于后续的实验中。
[0072]
脂肪酶浓度的优化：参照实施例3中所述的方案进行操作(载体g-3)，过程和条件同实施例3，与其不同之处在于，分别加入5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg脂肪酶来研究脂肪酶浓度对固定化脂肪酶酶活的影响，其中，固定化脂肪酶的最高活性视为100％(实施例3中脂肪酶用量为20mg)，其活性变化如图10b所示。固定化脂肪酶的酶活随着脂肪酶的浓度增加而增加，直到脂肪酶浓度为4.0mg/ml时，固定化脂肪酶的酶活达到最大值。继续增加脂肪酶的浓度，固定化脂肪酶的酶活开始降低。主要原因是在较低的脂肪酶浓度下，没有足够的脂肪酶连接到载体上，载体还未达到饱和，所以固定化脂肪酶的酶活较低。而在较高的脂肪酶浓度下，载体已经过饱和，而且过量的脂肪酶之间的空间位阻还会阻止彼此与载体的接触，所以固定化脂肪酶的酶活较差。因此，选择4.0mg/ml作为最优的脂肪酶浓度用于后续的实验中。
[0073]
固定化时间的优化：参照实施例3中所述的方案进行操作(载体g-3)，过程和条件同实施例3，与其不同之处在于，分别选用1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时的培养时间来研究固定化时间对固定化脂肪酶酶活的影响，其中，固定化脂肪酶的最高酶活视为100％(实施例3中固定化时间为4小时)，其酶活变化如图10c所示。当固定化时间小于4小时，固定化脂肪酶的酶活随着固定化时间的增长而增加。当固定化时间为4小时，固定化脂肪酶具有最高的酶活。这是因为较短的固定化时间导致载体与脂肪酶无法充分接触，载体上固定化的脂肪酶量较少，所以固定化脂肪酶的酶活较低。当固定化时间大于4小时，固定化脂肪酶的酶活随着固定化时间的增长而降低。主要原因是脂肪酶与活化的载体的长时间接触引起了脂肪酶酶活的损失，所以固定化脂肪酶的酶活较差。因此，选择4小时作为最优的固定化时间用于后续的实验中。
[0074]
固定化ph值的优化：参照实施例3中所述的方案进行操作(载体g-3)，过程和条件同实施例3，与其不同之处在于，使用ph值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的磷酸盐缓冲液来研究固定化ph值对固定化脂肪酶酶活的影响，其中，固定化脂肪酶的最高酶活视为100％(实施例3中固定化ph值为8.0)，其酶活变化如图10d所示。固定化脂肪酶的酶活随着缓冲液ph值的增加而逐渐增加，直至固定化ph值为8.0时，固定化脂肪酶的酶活达到最高。在ph值较高的缓冲液下，固定化脂肪酶的酶活随着缓冲液ph值的增加而降低。由于脂肪酶的构象特性，固定化脂肪酶在固定化ph值较低或较高的情况下酶活较低。因此，选择8.0作为最优的固定化ph值用于后续的实验中。
[0075]
固定化温度的优化：参照实施例3中所述的方案进行操作(载体g-3)，过程和条件同实施例3，与其不同之处在于，分别采用20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的培养温度来研究固定化温度对固定化脂肪酶酶活的影响，其中，固定化脂肪酶的最高酶活视为100％(实施例3中固定化温度为35℃)，其酶活变化如图10e所示。当固定化温度为20-35℃时，固定化脂肪酶的酶活随着固定化温度的增加而增加。当固定化温度为35℃时，固定化脂肪酶拥有最高的酶活。当固定化温度为35-45℃时，固定化脂肪酶的酶活随着固定温度的增加而降低。这是因为在较低的固定化温度下，固定化温度的升高促进了脂肪酶与载体的接触。在较高的固定化温度下，由于热变性，脂肪酶的构象发生改变，固定化脂肪酶的酶活较差。因
此，选择35℃作为最优的固定化温度用于后续的实验中。
[0076]
实施例6：游离脂肪酶(米曲霉脂肪酶)和固定化脂肪酶(实施例3制备的固定化脂肪酶(载体g-3))的酶学性质及性能的研究
[0077]
酶在不同反应条件下的酶活是影响固定化脂肪酶实际应用的重要因素。
[0078]
最适反应ph值：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，使用ph值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的磷酸盐缓冲液来研究反应ph值对游离脂肪酶和固定化脂肪酶酶活的影响，其中，游离脂肪酶和固定化脂肪酶在最适反应ph值下的酶活视为100％(实施例2中反应ph值为8.0)，其酶活变化如图11a所示。当反应ph值为5.0时，游离脂肪酶的相对酶活仅为38.5％，而固定化脂肪酶的相对酶活则为58.37％。当反应ph值小于最适条件时，游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活均随着反应ph值的增加而增加。游离脂肪酶的最适反应ph值为8.0，而固定化脂肪酶的最适反应ph值为9.0。脂肪酶固定化到载体上后，最适反应ph值发生了明显变化，主要原因是脂肪酶所处的微环境发生了改变。当反应ph值大于最适条件时，游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活均随着反应ph值的增加而降低，但固定化脂肪酶的下降幅度较小。当反应ph值为10.0时，游离脂肪酶的剩余酶活仅为60.82％，而固定化脂肪酶的剩余酶活则为86.72％。总之，结果表明游离脂肪酶对反应ph值非常敏感，仅能在ph为8.0附近的较窄的反应ph值范围内具有较高的酶活，而固定化脂肪酶则能在更宽的反应ph值范围内保留较高的酶活。这是因为脂肪酶固定化到fe3o4@pmma/pamam微球上后，可以减弱酸性和碱性条件下反应ph值对脂肪酶的不利影响，保护了脂肪酶的构象完整性。
[0079]
最适反应温度：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下水浴加热反应来研究反应温度对游离脂肪酶和固定化脂肪酶酶活的影响，其中，游离脂肪酶和固定化脂肪酶在最适反应温度下的酶活视为100％(实施例2中反应温度为50℃)，其酶活变化如图11b所示。当反应温度为30℃时，游离脂肪酶的相对酶活为63.19％，而固定化脂肪酶的相对酶活为57.53％，这是因为固定化脂肪酶与底物之间的传质受到限制。当反应温度为30-50℃时，游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活均随着反应温度的增加而增加。游离脂肪酶和固定化脂肪酶的最适反应温度均为50℃。当反应温度为50-80℃时，游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活均随着反应温度的增加而降低，但固定化脂肪酶的下降幅度较小。当反应温度为80℃时，游离脂肪酶的剩余酶活仅为30.32％，而固定化脂肪酶的剩余酶活则为54.7％。总之，结果表明游离脂肪酶对反应温度十分敏感，仅能在50℃左右的较小的反应温度范围内拥有较高的酶活。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶可以在更大的反应温度范围内保留较高的酶活。主要原因是通过在固定化过程中形成大量的共价键，降低了脂肪酶的酶活损失，并在较高的反应温度下保持了脂肪酶构象的完整性。
[0080]
酶的热稳定性和ph稳定性也是影响其实际应用的重要性质。
[0081]
热稳定性：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，在热处理前测定游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活，并将其视为100％。然后，将游离脂肪酶和固定化脂肪酶置于50℃的水浴锅中分别处理1小时、2小时、3小时、4小时、5小时后，测定其酶活，研究了游离脂肪酶和固定化脂肪酶的热稳定性，其酶活变化如图12a所示。随着热处理时间的增长，游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活均逐渐降低，但固定化脂肪酶的
下降幅度低于游离脂肪酶。在热处理5小时后，游离脂肪酶的剩余酶活仅为21.36％，相比之下，固定化脂肪酶的相对酶活明显高于游离脂肪酶，为55.52％。结果表明固定化脂肪酶拥有优秀的热稳定性。
[0082]
ph稳定性：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，在ph处理前测定游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活，并将其视为100％。然后，将游离脂肪酶和固定化脂肪酶置于ph为9.0的磷酸盐缓冲液中分别处理1小时、2小时、3小时、4小时、5小时后，测定其酶活，研究了游离脂肪酶和固定化脂肪酶的ph稳定性，其酶活变化如图12b所示。随着ph处理时间的增长，游离脂肪酶和固定化脂肪酶的酶活均逐渐降低，但固定化脂肪酶的下降幅度低于游离脂肪酶。在ph处理5小时后，游离脂肪酶的剩余酶活仅为30.49％，与之相比，固定化脂肪酶的相对酶活明显高于游离脂肪酶，为85.41％。结果表明固定化脂肪酶有着优秀的ph稳定性。
[0083]
脂肪酶与fe3o4@pmma/pamam微球间的共价交联不仅提高了热稳定性还提高了ph稳定性。稳定性增强的主要原因是脂肪酶与载体间形成的共价键限制了脂肪酶构象的变化，使其在较为恶劣的条件下保持稳定。
[0084]
酶促反应动力学：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，分别配制成棕榈酸对硝基苯酯的质量浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml的底物溶液来测定游离脂肪酶和固定化脂肪酶的棕榈酸对硝基苯酯水解反应动力学(实施例2中底物的质量浓度为5mg/ml)，其lineweaver-burk图如图13所示。
[0085]
最大反应速度(v
max
)和米氏常数(km)由lineweaver-burk方程计算得出：
[0086][0087]
其中，v0为酶促反应速率(mmol/l*min)，[s]为底物浓度(mmol/l)。
[0088]
通过lineweaver-burk图计算了游离脂肪酶和固定化脂肪酶的动力学参数，包括最大反应速率(v
max
)和米氏常数(km)。结果表明游离脂肪酶的v
max
＝0.8414mmol/l*min，固定化到载体上后，由于脂肪酶与载体之间的共价交联，导致脂肪酶的结构转变为活性较低的构象，还阻碍了底物与脂肪酶活性位点的接触，v
max
下降为0.6857mmol/l*min，但是下降幅度较小。因此，脂肪酶的酶活在固定化后仍能得到很大程度的保留。km反映了酶与底物的亲和力，km越低，亲和力越强。在棕榈酸对硝基苯酯的水解反应中，固定化脂肪酶有着比游离脂肪酶更强的底物亲和力，因为它的km＝2.6897mmol/l，低于游离脂肪酶的km(6.0735mmol/l)。这说明了将脂肪酶固定化到fe3o4@pmma/pamam微球上后，脂肪酶和底物的亲和力显著提高。
[0089]
固定化脂肪酶的重复使用性和储存稳定性对其实际应用来说非常重要。
[0090]
重复使用性：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，在连续循环反应开始前，测定固定化脂肪酶的酶活，并将其视为100％。然后，在外加磁场下将固定化脂肪酶从反应体系中分离回收并用去离子水洗涤后，进行下一轮反应，直至连续循环十次。其间，每次循环结束后测定一次固定化酶的酶活，研究了固定化脂肪酶的重复使用性，其酶活变化如图14a所示。随着循环次数的增加，固定化脂肪酶的酶活逐渐降低。重复使用十次后，固定化脂肪酶仍能维持82.12％的酶活。结果表明固定化脂肪酶具有优异的重复使用性，这是因为fe3o4@pmma/pamam微球与脂肪酶的相互作用减少了脂肪酶从载体
上的脱落，降低了脂肪酶在重复使用的过程中因构象变化而引起的酶活损失。
[0091]
储存稳定性：参照实施例2中所述的方案，过程和条件同实施例2，与其不同之处在于，在置于4℃冰箱中前测定固定化脂肪酶的酶活，并将其视为100％。将固定化脂肪酶在4℃冰箱中储存30天，其间，每隔5天测定一次固定化脂肪酶的酶活，研究了固定化脂肪酶的储存稳定性，其酶活变化如图14b所示。随着储存时间的增长，固定化脂肪酶的酶活逐渐降低。储存30天后，固定化脂肪酶仍能保持80.24％的酶活。结果表明固定化脂肪酶有着优异的储存稳定性，主要原因是fe3o4@pmma/pamam微球与脂肪酶的相互作用增强了脂肪酶对构象变化的抵抗能力，降低了脂肪酶在长时间储存的过程中因构象变化引起的酶活损失。
[0092]
fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的酶活为2482u/g
载体
，载酶量为150mg
蛋白质
/g
载体
。fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶具有优秀的酶活和载酶量。
[0093]
fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的这些优点对于脂肪酶的广泛实际应用具有非常重要的意义。因此，fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶是一种稳定高效且有着广大前景的生物催化剂，可以满足各种行业的需求。fe3o4@pmma/pamam微球也是一种极具潜力和研究意义的优秀酶固定化载体并在生物催化领域有着广阔应用前景。
[0094]
在本发明的启示下且不脱离本发明技术方案的情况下，依据本发明申请专利的范围所做的任何简单修改、均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖和保护范围内。

技术特征：
1.一种fe3o4@pmma/pamam微球的合成方法，其特征在于：首先采用共沉淀法制备了油酸修饰的fe3o4，再以油酸修饰的fe3o4为原料通过悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，再以聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球为原料使用发散合成法合成了fe3o4@pmma/pamam微球(聚酰胺-胺树枝状大分子接枝的聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体过程包括以下步骤：(一)、油酸修饰的fe3o4的制备：将2-5g(优选3-4g)fecl2·
4h2o和4-7g(优选5-6g)fecl3加入容器中，再向其中加入180-220ml(优选190-210ml)去离子水并在氮气保护下搅拌排除反应体系内溶解的氧气后，加热至80-90℃(优选83-87℃)，然后向反应体系中倒入18-22ml(优选19-21ml)氨的质量浓度23-27％(优选24-26％)nh3·
h2o，并恒温反应3-7分钟(优选4-6分钟)后，并向其中滴加6-9ml(优选7-8ml)油酸，再恒温反应25-35分钟(优选28-32分钟)后，将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，并用去离子水洗涤固体产物，干燥后即可获得油酸修饰的fe3o4；(二)、聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球的合成：将5-8g(优选6-7g)聚乙烯醇1788和230-270ml(优选240-260ml)去离子水加入容器中，将混合物在磁力搅拌的条件下加热至85-95℃(优选88-92℃)，然后加入5-8g(优选6-7g)nacl，完全溶解后，得水相；将1-5g(优选2-4g)油酸修饰的fe3o4、22-26ml(优选23-25ml)甲基丙烯酸甲酯、1-4ml(优选2-3ml)二乙烯苯和0.5-1.5g(优选0.8-1.2g)过氧化苯甲酰加入容器中，将混合物在室温下搅拌混合均匀后，得油相；将油相和水相在容器中混合并在氮气保护下搅拌排除反应体系内溶解的氧气后，开始加热至75-85℃(优选78-82℃)，恒温反应8-12小时(优选9-11小时)，反应完成后，将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，并用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，干燥后即可获得聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球；(三)、fe3o4@pmma/pamam微球的合成：(1)酰胺化反应：将作为原料的6-9g(优选7-8g)聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、130-170ml(优选140-160ml)n,n-二甲基甲酰胺和60-90ml(优选70-80ml)乙二胺加入容器中并在氮气保护下搅拌排除反应体系内溶解的氧气后，开始加热至75-85℃(优选78-82℃)，恒温反应6-10小时(优选7-9小时)，然后将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，干燥后获得的氨化的磁性聚合物微球，命名为g-0；(2)迈克尔加成反应：将作为原料的6-9g(优选7-8g)经酰胺化反应后获得的磁性聚合物微球g-0、130-170ml(优选140-160ml)n,n-二甲基甲酰胺和45-55ml(优选47-53ml)丙烯酸甲酯加入容器中并在氮气保护下搅拌排除体系内溶解的氧气后，开始加热至75-85℃(78-82℃)，恒温反应6-10小时(7-9小时)，反应完成后，将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，干燥；然后将收集的固体代替步骤(1)酰胺化反应中的原料再进行一次步骤(1)酰胺化反应操作，其过程和条件同步骤(1)，所得的材料为第一代fe3o4@pmma/pamam微球，称之为g-1；和/或，(3)以g-1代替上述步骤(2)的原料g-0重复上述步骤(2)的反应即可制备第二代fe3o4@pmma/pamam微球，即g-2；
和/或，(4)以g-2代替上述步骤(2)的原料g-0重复上述步骤(2)的反应即可制备第三代fe3o4@pmma/pamam微球，即g-3。3.一种采用权利要求1-2任一所述的合成方法制备得到fe3o4@pmma/pamam微球g-1、g-2、g-3中的一种或二种或三种。4.一种固定化脂肪酶，其采用权利要求3所述的fe3o4@pmma/pamam微球为载体固定脂肪酶。5.根据权利要求4所述的固定化脂肪酶，其特征在于，以戊二醛为交联剂，具体过程为：fe3o4@pmma/pamam微球固定化脂肪酶的制备：1)将18-22mg(优选19-21mg)fe3o4@pmma/pamam微球、3-7ml(优选4-6ml)ph为7.0-9.0(优选7.5-8.5)的磷酸盐缓冲液和0.1-0.4ml(优选0.2-0.3ml)戊二醛加入容器中；在25-35℃(优选28-32℃)，160-200rpm(优选170-190rpm)的条件下培养8-12小时(优选9-11小时)，固液分离，并用去离子水洗涤固体，得活化后的载体；2)将18-22mg(优选19-21mg)脂肪酶、3-7ml(优选4-6ml)ph为7.0-9.0(优选7.5-8.5)的磷酸盐缓冲液和活化后的载体加入容器中，在30-40℃(优选33-37℃)下，以160-200rpm(优选170-190rpm)的转速培养2-6小时(优选3-5小时)后，固液分离，并用去离子水洗涤固体，干燥后获得固定化脂肪酶。6.根据权利要求4或5所述的固定化脂肪酶，其特征在于，所述的脂肪酶是米曲霉脂肪酶。7.根据权利要求4或5所述的固定化脂肪酶，其特征在于，fe3o4@pmma/pamam微球是一种微米级微球，这为酶的固定化提供了较大的比表面积；fe3o4@pmma/pamam微球含有大量的氨基官能团，这使其可以连接大量的脂肪酶；fe3o4@pmma/pamam微球具有超顺磁性以及优秀的磁响应性，这使其可以在外加磁场的作用下实现快速分离回收。

技术总结
本发明公开了一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球及其合成与应用，采用共沉淀法制备了油酸修饰的Fe3O4，再通过悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，使用发散合成法合成了Fe3O4@PMMA/PAMAM微球。然后使用戊二醛作为交联剂，将Fe3O4@PMMA/PAMAM微球应用于脂肪酶的固定化。与游离脂肪酶相比，Fe3O4@PMMA/PAMAM微球固定化脂肪酶能在更大的反应温度和反应pH值范围内保留较高的酶活且其具有优秀的热稳定性和pH稳定性，其对底物的亲和力也比游离脂肪酶更强。此外，Fe3O4@PMMA/PAMAM微球固定化脂肪酶还有着优秀的酶活和载酶量以及优异的重复使用性和储存稳定性。复使用性和储存稳定性。


技术研发人员：李佥 郭俊宏 杨帆 李宪臻 李苗 黄帆
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/7/25