α-倒捻子素衍生物及其制备方法与应用

1.本发明涉及化学、农业及医药技术领域，具体涉及α-倒捻子素衍生物及其制备方法与其在制备广谱抗菌药方面的应用。


背景技术：

2.细菌耐药性迅速增加和传播严重威胁全球公共卫生安全。抗菌药物是治疗耐药细菌的最有效手段。然而，临床可用的抗菌药越来越少，尤其是针对革兰阴性菌的抗菌药物(lancet,2022,399,2347；nature,2019,576,459)。近20年来无抗革兰阴性菌的药物获批(cell,2020,181,29-45)。这其中主要原因是由于革兰阴性菌的外膜的存在，阻碍了药物进入胞内，以及嵌入的外排泵，使大多数分子无法在胞内积聚，导致许多对阳性菌有效的药物对阴性菌失效(nature,2018,559,617)。因此，我们意在探究一种有效的策略以使现有的革兰阳性抗菌药具有广谱的抗菌活性。
3.目前报道的主要是通过协同增效剂或化学衍生两种手段来实现革兰阳性菌抗菌药的广谱性。通过间接机制增强抗菌药活性的化合物通常被称为协同增效剂。其优点是，可以直接延长现有药物的使用寿命，缩短药物研发的进程；然而，这样的药物组合可能会带来更多的不良反应。通过化学修饰现有对革兰阳性菌有效的化合物，使其活化并获得杀灭革兰阴性菌的能力是研发革兰阴性菌抗菌药的主要手段之一。临床上最成功的案例是通过将青霉素g增加初级胺获得衍生物氨苄青霉素，进而产生广谱抗菌活性，其主要区别是它们比青霉素g更容易穿透革兰阴性菌的外膜。本发明的目的是通过化学衍生的方法，对前期研究的植物源天然产物α-倒捻子素(amg)赋予广谱的抗菌活性。
4.在前期的研究中，我们从271种天然植物的次级代谢产物中筛选出85个异戊烯化的黄酮类化合物，从五大类黄酮化合物中各选出1个先导化合物，通过构效关系以及抗菌活性测定发现含2个异戊烯基取代的酮类化合物amg具有优异的抗革兰阳性菌活性，而对革兰阴性菌无活性(mic值大于128μg/ml)(advanced science,2021,8,e2100749；rsc medicinal chemistry,2021,13,107)。此外，虽然amg具有许多理想的药理特性，例如分子量、氢供体和受体的数和可旋转键的数量等方面。然而，amg低两亲性和低水溶性的劣势，使得其不易穿过革兰阴性菌的外膜。


技术实现要素：

5.本发明从α-倒捻子素仅对革兰阳性菌有效这一不足出发，设计了一系列α-倒捻子素衍生物(amg 1-14)，并探究了其对革兰阳性菌(包括标准菌株、临床敏感菌株、临床耐药菌株)如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、猪链球菌等和革兰阴性菌(包括标准菌株、临床敏感菌株、临床耐药菌株)如大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、气单胞菌等及真菌如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌的抗菌活性。
6.本发明的目的是提供一系列具有广谱抗菌活性的α-倒捻子素衍生物。
7.本发明所提供的α-倒捻子素衍生物，其结构式如式i所示：
[0008][0009]
式i中，r1可为卤素、h，所述卤素具体可为氯；
[0010]
r2、r3各自独立地选自其中n为1-4的整数，具体可为1-2；r4可选自-cn、-conh2、-nhcoch3、-conhch2ch2oh、-cooch2ch
2-ph-nh2、-conh(ch2)mn(r5)(r6)(m＝1-6，具体可为1-4或1、2、3、4，r5、r6各自独立地为h、c
1-c6烷基)、卤素、-n(r5)(r6)(r5、r6各自独立地为h、c
1-c6烷基)、-oh、
[0011]
(l为1-4的整数，具体可为1、2，r5、r6各自独立地为h、c
1-c6烷基)和中至少一种。
[0012]
具体地，所述α-倒捻子素衍生物为如下化合物中的任一种：
[0013]
[0014][0015]
上述α-倒捻子素衍生物在如下方面的应用也属于本发明的保护范围：
[0016]
1)抗细菌感染；
[0017]
2)抗真菌感染；
[0018]
3)制备抗菌剂。
[0019]
所述细菌包括革兰阳性菌和革兰阴性菌；
[0020]
所述细菌包括标准菌株、临床敏感菌株、临床耐药菌株；
[0021]
所述革兰阳性菌包括金黄色葡萄球菌、肠球菌、猪链球菌、产气荚膜梭菌等；
[0022]
所述革兰阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、气单胞菌等。
[0023]
所述真菌包括标准菌株和临床敏感菌株；
[0024]
所述真菌菌株包括白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌。
[0025]
所述金黄色葡萄球菌包括：金黄色葡萄球菌atcc 29213、金黄色葡萄球菌231、金黄色葡萄球菌232、金黄色葡萄球菌224、金黄色葡萄球菌233-2、金黄色葡萄球菌223-1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌dl44、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌dy82、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌sf30、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌74、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌155；
[0026]
肠球菌包括屎肠球菌20hb9rx11、屎肠球菌20hb9rx12、屎肠球菌20hb9rx15、屎肠球菌20hb9rx27、屎肠球菌20hb9rx36、粪肠球菌20hb9rx13、粪肠球菌20hb9rx19、粪肠球菌20hb9rx24、粪肠球菌20hb9rx2、粪肠球菌20hb9rx2；
[0027]
猪链球菌包括猪链球菌atcc43765、猪链球菌t73、猪链球菌b73-1、猪链球菌b40、猪链球菌b41、猪链球菌b58、猪链球菌b57、猪链球菌b56、猪链球菌b43；
[0028]
产气荚膜梭菌包括产气荚膜梭菌2020sj5rx165、产气荚膜梭菌21sx4pky10、产气
荚膜梭菌2020sj5rx13、产气荚膜梭菌20hb8pk32、产气荚膜梭菌20hb9rx14、产气荚膜梭菌19sx3rx70、产气荚膜梭菌19nm2cm20、产气荚膜梭菌19nm1cm25、产气荚膜梭菌19sx3fx100、产气荚膜梭菌19nm1cm9；
[0029]
大肠杆菌包括大肠杆菌atcc 25922、大肠杆菌1dm25、大肠杆菌1dm27、大肠杆菌1dm31、大肠杆菌1dm33、大肠杆菌1dm30、大肠杆菌1dm4、大肠杆菌1dm47、大肠杆菌1dm50、大肠杆菌1dm44、大肠杆菌b2、大肠杆菌16dqzxrf1sbc、大肠杆菌16qd8dz68bc、大肠杆菌16qd1ae8rc、大肠杆菌16qd1az6rc、大肠杆菌17qd3az38rc、大肠杆菌16qdzae6rc、大肠杆菌16qd21sdz87bc、大肠杆菌16qd1az1rc、肠炎沙门菌sh170、大肠杆菌15qdhsdz80bc、大肠杆菌16qd2az1rc、大肠杆菌sh130、大肠杆菌32-2、大肠杆菌10r1-1、大肠杆菌19qd1dz21r、大肠杆菌30-1r、大肠杆菌14-3r、大肠杆菌26-1、大肠杆菌6-1、大肠杆菌18qd2dz22wr、大肠杆菌18qd11mm2-1r、大肠杆菌18qd2nn7wr、大肠杆菌18qd2dz56-3-5r、大肠杆菌18qd3dz3rr、大肠杆菌50-2r、大肠杆菌45-1r、大肠杆菌18qd11mm2-35r、大肠杆菌18qd4nm2rr、大肠杆菌17qd5rh11rk、大肠杆菌17qd5rz8rk、大肠杆菌17qd5kz18rk、大肠杆菌17qd3rp3rk、大肠杆菌17qd3rp2rk、大肠杆菌17qd3rp15rk、大肠杆菌17qd5rh5rk、大肠杆菌17qd3rh5rk、大肠杆菌17qd5rz22rk、大肠杆菌17qd5rz17rk、大肠杆菌18qd2ry1rk、大肠杆菌17qd5rz35rk、大肠杆菌17qd5rz28rk、大肠杆菌17qd5rz25rk、大肠杆菌17qd5rz23rk、大肠杆菌17qd3rf20rk、大肠杆菌17qd3rf14rk、大肠杆菌17qd5rh4rk、大肠杆菌17qd5rz2rk；
[0030]
沙门氏菌包括沙门氏菌90、沙门氏菌89、沙门氏菌181、沙门氏菌236、沙门氏菌206、沙门氏菌92、沙门氏菌61、沙门氏菌190、沙门氏菌88；
[0031]
副猪嗜血杆菌包括副猪嗜血杆菌2by2、副猪嗜血杆菌by20-2、副猪嗜血杆菌by27、副猪嗜血杆菌by59-1、副猪嗜血杆菌tz73-2、副猪嗜血杆菌cy12、副猪嗜血杆菌sd101-1、副猪嗜血杆菌by29-2、副猪嗜血杆菌by10-2、副猪嗜血杆菌by13；
[0032]
巴氏杆菌包括巴氏杆菌pmsh-2、巴氏杆菌pmsx-20、巴氏杆菌pmsx-4、巴氏杆菌pmsc-5、巴氏杆菌pmsc-3、巴氏杆菌pmsh-1、巴氏杆菌pmsx-24、巴氏杆菌pmsc-1、巴氏杆菌pmsc-2；
[0033]
肺炎克雷伯菌包括肺炎克雷伯菌atcc 43816、肺炎克雷伯菌jq2707、肺炎克雷伯菌jc4209、肺炎克雷伯菌jc4279、肺炎克雷伯菌jc4057、肺炎克雷伯菌jc4152、肺炎克雷伯菌jc3619、肺炎克雷伯菌jc3853、肺炎克雷伯菌jc3493、肺炎克雷伯菌jq2989；
[0034]
气单胞菌包括气单胞菌17qdfsk8bw、气单胞菌17qdfsk7bg、气单胞菌17qdfsk3bg、气单胞菌17qdfsk2bg、气单胞菌17qdfsk5bw、气单胞菌17qdfsk5bg、气单胞菌17qdfsk1bw、气单胞菌17qdfsk5bb。
[0035]
所述白色念珠菌包括candida albicansatcc10231、candida albicans cauf1、candida albicans cauf3、candida albicans cauf4；
[0036]
所述光滑念珠菌包括光滑念珠菌candida albicansatcc 2001；
[0037]
所述克柔念珠菌包括克柔念珠菌candida kruseiiatcc 6258；
[0038]
所述热带念珠菌包括热带念珠菌candida tropicaliscauf 2。
[0039]
在合成的20个衍生物中，amg-7、-10c、-11c、-11c-r、-11c-1、-12、-12-d和-14这八个衍生物均对革兰阳性菌表现出较好的抗菌作用，包括amg-7对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为8μg/ml；amg-10c对
葡萄球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为0.5μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-11c对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、梭菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-11c-r对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、梭菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml；amg-11c-1对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、梭菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-12对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为0.5μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为0.5μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-12-d对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为1μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-14对葡萄球菌属细菌的mic
50
值为0.5μg/ml、肠球菌属细菌的mic
50
值为0.5μg/ml、链球菌属细菌的mic
50
值为0.13μg/ml。
[0040]
在合成的20个衍生物中，amg-7、-10c、-11c、-11c-r、-11c-1、-12、-12-d和-14这八个衍生物均有效地拓展了抗菌活性，对革兰阴性菌表现出较好的抗菌活性，包括amg-7对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml；amg-10c对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-11c对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、嗜血杆菌属细菌的mic
50
值为8μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为3μg/ml、气单胞菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml；amg-11c-r对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为8μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为16μg/ml、嗜血杆菌属细菌的mic
50
值为32μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为12μg/ml、气单胞菌属细菌的mic
50
值为16μg/ml；amg-11c-1对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、嗜血杆菌属细菌的mic
50
值为8μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、气单胞菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml；amg-12对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml；amg-14对大肠埃希菌属细菌的mic
50
值为2μg/ml、沙门氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、不动杆菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml、克雷伯氏菌属细菌的mic
50
值为4μg/ml。
[0041]
表1为本发明合成的20个衍生物的理化性质。
[0042]
表1.α-倒捻子素衍生物的理化性质
[0043][0044]
本发明还提供一种抗菌剂，所述抗菌剂用于抗细菌感染和抗真菌感染。
[0045]
本发明所提供的抗菌剂，含有上述α-倒捻子素衍生物中的至少一种。
[0046]
本发明结合革兰阴性菌细胞膜的结构特征，在amg分子中引入了不同极性的基团以增加其与外膜的结合或者提高其在细菌胞内累积的可能性，并进一步探究其抗菌活性的变化。
附图说明
[0047]
图1为e.coli b2在不同浓度amg衍生物作用时的生长曲线。(a)多粘菌素e在不同浓度下对e.coli b2生长的抑制作用；(b)衍生物amg-9c在不同浓度下对e.coli b2生长的抑制作用；(c)衍生物amg-10c在不同浓度下对e.coli b2生长的抑制作用；(d)衍生物amg-11c在不同浓度下对e.coli b2生长的抑制作用。
[0048]
图2为衍生物amg-11c的安全性评估。(a)amg-11c对羊血红细胞具有较低的溶血性；(b)amg-11c的安全治疗指数较广。
[0049]
图3为衍生物amg-11c不同时间内在e.coli b2胞内的累积量。
[0050]
图4为e.coli b2感染72小时后大蜡螟的生存曲线。
具体实施方式
[0051]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐
明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0052]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]
试验所用菌株：本试验中标准菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)；其余临床耐药菌株为本实验室分离得到。
[0054]
主要试剂与耗材：mh培养基(mhb)购自北京陆桥技术股份有限责任公司；α-倒捻子素购于成都普瑞法科技开发有限公司；
[0055]
实施例1：α-倒捻子素衍生物的合成
[0056]
在α-倒捻子素的3位和5位的羟基上同时引入一系列的含氮原子或卤原子的基团，从而得到了α-倒捻子素衍生物(amg-1-14)。
[0057]
合成amg-1：
[0058][0059]
将α-倒捻子素(100mg，0.24mm)溶解在2ml二氯甲烷中，加入n-氯琥珀酰亚胺(70mg，0.53mm)进行搅拌溶解。将反应在室温条件下，通入氮气做保护，反应30min。反应液用饱和的硫代硫酸钠水溶液进行稀释，然后用二氯甲烷进行萃取。有机相用饱和食盐水进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(9:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-1(26mg)，产率24％。
[0060]
合成amg-2：
[0061][0062]
将α-倒捻子素(100mg，0.24mm)溶解在5ml丙酮中，加入碳酸钾(100mg，0.73mm)和二溴甲烷(130mg，0.75mm)进行搅拌溶解。将混合物在100℃下反应12h后，冷却至室温。向所得溶液中加入氰化亚铜(67mg，0.75mm)，将反应升温至130℃，再搅拌反应24h，然后冷却至室温，用水稀释，乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(3:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-2(26mg)，产率91％。
[0063]
合成amg-3，-5，-6：
[0064][0065]
将α-倒捻子素(1.0g，7.29mm)溶解在20ml乙腈中，加入碳酸钾(1.0g，7.29mm)和氯乙酸乙酯(0.89g，7.29mm)进行搅拌溶解。将混合物反应回流12h后，冷却至室温。反应液用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(1.30g)，产率92％。产物a(1.0g，1.71mm)溶解在5ml四氢呋喃中，加入8ml5％氢氧化锂水溶液，将反应体系在室温下搅拌反应2h，然后用乙酸进行中和。反应液用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(1:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物b(753mg)，产率84％。
[0066]
将溶解在3ml二甲基甲酰胺中，加入氯化铵(30mg，0.57mm)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(218mg，1.14mm)和二甲氨基吡啶(100mg，0.19mm)进行搅拌溶解。反应混合物在室温下搅拌12h，反应液用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到amg-3(92mg)，产率92％。
[0067]
将产物b(100mg，0.19mm)溶解在3ml二甲基甲酰胺中，加入乙醇胺(35mg，0.57mm)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(218mg，1.14mm)和二甲氨基吡啶(100mg，0.19mm)进行搅拌溶解，反应混合物在室温下搅拌反应12h，反应液用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到amg-5(76mg)，产率65％。
[0068]
将产物b(100mg，0.19mm)溶解在3ml二甲基甲酰胺中，加入对-fmoc-4-(2-氯乙基)苯胺(147mg，0.57mm)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(218mg，1.14mm)和二甲氨基吡啶(5mg，0.04mm)进行搅拌溶解，反应混合物在室温下搅拌反应12h，反应液用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(5:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物c(76mg)，产率88％。产物c(100mg，0.08mm)溶解在5ml四氢呋喃中，加入哌啶(15mg，0.32mm)进行搅拌溶解，反应体系在室温下搅拌反应2h，反应液用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(2:1，v/v)系统进行洗脱，得到amg-6(52mg)，产率80％。
[0069]
合成amg-4：
[0070][0071]
将α-倒捻子素(400mg，0.96mm)溶解在5ml丙酮中，加入碳酸钾(672mg，4.88mm)和1,2-二溴乙烷(2.74g，14.60mm)进行搅拌溶解。将混合物反应回流24h后，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂。然后用乙酸乙酯复溶，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(396mg)，产率65％。产物a(374mg，0.60mm)溶解在5ml无水二甲基甲酰胺中，加入邻苯二甲酰亚胺钾(222mg，1.20mm)进行搅拌溶解。将混合物在90℃下搅拌反应12h后，冷却至室温。用乙酸乙酯进行稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(2:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物b(322mg)，产率71％。将产物b(302mg，0.40mm)溶解在5ml甲胺(40％水)和10ml甲醇的混合溶液中，该混合物体系在70℃下回流7h，冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应混合物，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇-醋酸胺(50:1:0.5-15:1:0.15，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-11c(66mg)，产率35％。将amg-11c(37mg，0.08mm)溶解在1ml乙酸溶液中，加入乙酸酐(25mg，0.24mm)和甲磺酸(23mg，0.24mm)进行搅拌溶解。所得的混合物在70℃下搅拌反应30min后，用乙酸乙酯进行稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(10:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-4(23mg)，产率52％。
[0072]
合成amg-7：
[0073][0074]
将α-倒捻子素(1.0g，2.43mm)溶解在20ml丙酮中，加入碳酸钾(1.0g，7.29mm)和氯代乙酸乙酯(0.89g，7.29mm)进行搅拌溶解。将混合物反应回流12h后，冷却至室温，然后加入适量乙酸乙酯，并用饱和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，萃取，有机相用旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(1.3g)，产率92％。产物a(1.0g，1.71mm)溶解在5ml四氢呋喃中，加入5％氢氧化锂水溶液(8ml)进行搅拌溶解。将混合物在室温下搅拌反应2h后，加入乙酸进行中和。然后加入适量乙酸乙酯，并用饱和食盐水进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓
缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(1:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物b(753mg)，产率84％。将产物b(100mg，0.19mm)溶解在3ml四氢呋喃中，加入n-叔丁氧羰基乙二胺(91mg，0.57mm)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(218mg，1.14mm)和4-二甲基氨吡啶(5mg，0.04mm)，室温下搅拌反应12h。反应液加入适量的乙酸乙酯，用饱和食盐水溶液进行洗涤，萃取，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(5:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物c(121mg)，产率79％。将产物c(100mg，0.12mm)溶解在3ml四氢呋喃中，加入叔丁醇钠(71mg，0.73mm)，所得混合液回流反应3h后，冷却至室温，并用乙酸进行中和，搅拌30min后，加入6m氢氧化钠水溶液，调节至ph＝10.0。所得的混合液加入适量的乙酸乙酯，用饱和食盐水溶液进行洗涤，萃取，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇-醋酸胺(10:1:0.1，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-7(40mg)，产率54％(journal ofmedicinal chemistry,2011,59,171193)。
[0075]
合成amg-8：
[0076][0077]
将α-倒捻子素(100mg，0.24mm)溶解在3ml丙酮中，加入碳酸钾(168mg，1.22mm)和1,4-二溴丁烷(788mg，3.65mm)进行搅拌溶解。将混合物反应回流24h后，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂。然后用乙酸乙酯复溶，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(119mg)，产率72％。产物a(102mg，0.15mm)溶解在二甲基亚砜中，加入二乙胺(110mg，1.5mm)，将混合物在室温下搅拌反应4h后，加入适量乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到amg-8(65mg)，产率65％(journal ofmedicinal chemistry,2011,59,171193)。
[0078]
合成amg-9a-11c：
[0079][0080]
将α-倒捻子素(400mg，0.96mm)溶解在5ml丙酮中，加入碳酸钾(672mg，4.88mm)和1,2-二溴乙烷(2.74g，14.60mm)(或1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷)进行搅拌溶解。将混合物反应回流24h后，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂。然后用乙酸乙酯复溶，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(396mg)，产率65％。产物a(374mg，0.60mm)溶解在5ml无水二甲基甲酰胺中，加入邻苯二甲酰亚胺钾(222mg，1.20mm)进行搅拌溶解。将混合物在90℃下搅拌反应12h后，冷却至室温。用乙酸乙酯进行稀
释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(2:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物b(322mg)，产率71％。将产物b(302mg，0.40mm)溶解在5ml甲胺(40％水)和10ml甲醇的混合溶液中，该混合物体系在70℃下回流7h，冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应混合物，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇-醋酸胺(50:1:0.5-15:1:0.15，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-11c(66mg)(或amg-10c或amg-9c)，产率35％(journal ofmedicinal chemistry,2011,59,171193)。
[0081]
合成amg-11c优化路线：
[0082][0083]
将α-倒捻子素(400mg，0.96mm)溶解在5ml丙酮中，加入碳酸钾(672mg，4.88mm)和n-(2-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(3.51g，13.76mm)进行搅拌溶解，将混合液反应回流24h，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂。然后用乙酸乙酯复溶，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(5:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(701mg)，产率65％。将产物a(701mg，0.80mm)溶解在5ml甲胺(40％水)和10ml甲醇的混合溶液中，该混合物体系在70℃下回流7h，冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应混合物，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇-醋酸胺(50:1:0.5-15:1:0.15，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-11c(120mg),产率52％。
[0084]
该优化合成路线相较于文献报道的(journal ofmedicinal chemistry,2011,59,171193)，运用了一种简便的中间体，这样的优势是减少了母核的损耗，进而提高了终产物的产率。
[0085]
合成amg-11c-r:
[0086][0087]
将α-倒捻子素(300mg，0.72mm)溶解在5ml甲醇中，加入钯碳催化剂(15mg(5％,w/w))在室温下通入氢气剧烈搅拌反应8h。反应液在硅藻土上过滤除去沉淀，减压浓缩滤液，得到中间体a。将a(200mg，0.48mm)溶解在3ml丙酮中，加入碳酸钾(336mg，2.44mm)和1，2-二溴乙烷(1.37g，7.3mm)，回流反应24h，冷却至室温。减压浓缩，将浓缩物溶解在乙酸乙酯中，然后依次用用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)进行洗脱，得到中间
体b(205mg),产率68％。产物b(187mg，0.3mm)溶解在无水dmf中，加入邻苯二甲酰亚胺钾(111mg，0.6mm)90℃下搅拌反应12h，冷却至室温。用乙酸乙酯进行稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)进行洗脱，得到产物c(171mg)，产率75％。中间体c(151mg，0.2mm)溶解在5ml甲胺(40％水溶液)和10ml甲醇的混合溶液中，混合溶液在70℃下回流反应7h，然后冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应液，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇-醋酸胺(50:1:0.5-15:1:0.15，v/v)系统进行洗脱，得到产物amg-11c-r(88mg)，产率88％。
[0088]
合成amg-11c-1:
[0089][0090]
将α-倒捻子素(200mg，0.48mm)溶解在3ml丙酮中，加入碳酸钾(336mg，2.44mm)和1,2-二溴乙烷(1.37g，7.30mm)进行搅拌溶解。将混合物加热回流24h后，冷却至室温，蒸干除去溶剂。用乙酸乙酯溶解，然后用饱和的碳酸氢钠和氯化钠洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(20:1，v/v)系统进行洗脱，得到中间体a(198mg)，产率为65％。中间体a(187mg，0.3mm)溶解在5ml甲胺溶液中(含有2.0m四氢呋喃)，在室温下搅拌反应96h后，蒸干除去溶剂。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇-醋酸胺(50:1:0.5-30:1:0.5，v/v)系统进行梯度洗脱，得到产物amg-11c-1(113mg)，产率72％。
[0091]
合成amg-12：
[0092][0093]
将α-倒捻子素(100mg，0.24mm)溶解在5ml乙醇中，加入氢氧化钾(68mg，1.22mm)在室温下搅拌反应10min后，加入环氧溴丙烷(500mg，3.65mm)75℃下搅拌反应8h后，冷却至室温，加入适量的乙酸乙酯，用饱和食盐水溶液进行洗涤，萃取，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(4:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(64mg)，产率50％。产物a(60mg，0.11mm)溶解在1ml40％甲胺水溶液中并加入2ml乙醇，在室温下搅拌反应5h后，加入适量的正丁醇，用饱和食盐水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过反相hplc进行纯化，采用等度60％(甲醇-水，0.1％甲酸)洗脱，得到产物amg-12(27mg)，产率40％(journal ofmedicinal chemistry,2011,59,171193)。
[0094]
合成amg-12-d：
[0095]
[0096]
将α-倒捻子素(200mg，0.48mm)溶解在8ml乙醇中，加入氢氧化钾(136mg，2.44mm)在室温下搅拌反应10min后，加入环氧溴丙烷(1g，7.30mm)75℃下搅拌反应8h后，冷却至室温，加入适量的乙酸乙酯，用饱和食盐水溶液进行洗涤，萃取，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用石油醚-乙酸乙酯(4:1，v/v)系统进行洗脱，得到产物a(128mg)，产率50％。中间体a(120mg，0.22mm)溶解在1ml氨水和4ml甲醇的混合液中，混合液在室温下搅拌反应5h。反应液用1-丁醇进行稀释，然后用饱和食盐水进行洗涤。有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过反相hplc进行纯化，采用等度60％(甲醇-水，0.1％甲酸)洗脱，得到产物amg-12-d(22mg)，产率18％。
[0097]
合成amg-13：
[0098][0099]
将α-倒捻子素(100mg，0.24mm)溶解在5ml二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾(168mg，1.22mm)和2-溴乙醇(304mg，2.44mm)进行搅拌溶解。将反应混合物在90℃下搅拌反应5h，冷却至室温。反应液用用水进行稀释，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水溶液进行洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩。粗品通过硅胶色谱柱，用二氯甲烷-甲醇(100:1-50:1，v/v)系统进行洗脱，得到amg-13(79mg)，产率65％(journal ofmedicinal chemistry,2011,59,171193)。
[0100]
合成amg-14：
[0101][0102]
将amg-11c(37mg，0.08mm)溶解在1ml二甲基甲酰胺溶液中，加入1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐(35mg，0.24mm)和n,n-二异丙基乙胺(31mg，0.24mm)，在室温下搅拌反应过夜，加入适量的乙醚，过滤不溶性固体并用乙醚进行洗涤。粗品用甲醇-甲基叔丁基醚重结晶，得到amg-14(27mg)，产率62％(journal of medicinal chemistry,2011,59,171193)。
[0103]
结构确证数据：
[0104]
amg：hresi-ms：计算值为c
24h26
o6[m-h]-409.1657,实测值为409.1654。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.72(s,1h,oh)，11.01(s,1h,oh)，10.82(s,1h,oh)，6.80(s,1h,ar
–
h)，6.34(s,1h,ar
–
h)，5.16(m,2h,2
×
ch)，4.01(d,2h,ch2)，3.70(s,3h,och3)，3.20(d,2h,ch2)，1.77(s,3h,ch3)，1.72(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0105]
amg-1：hresi-ms：计算值为c
24h25
clo6[m-h]-443.1267,实测值为443.1268。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.73(s,1h,oh)，11.23(brs,1h,ar
–
oh)，10.63(brs,1h,ar
–
oh)，6.86(s,1h,ar
–
h)，5.15(m,2h,2
×
ch)，4.00(d,2h,ch2)，3.72(s,3h,och3)，3.30(d,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0106]
amg-2：hresi-ms：计算值为c
28h28
n2o6[m-h]-487.1875,实测值为487.1878。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.47(s,1h,oh)，7.34(s,1h,ar
–
h)，6.83(s,1h,ar
–
h)，5.44(s,2h,ch2)，5.39(s,2h,ch2)，5.15(m,2h,2
×
ch)，4.04(d,2h,ch2)，3.74(s,3h,och3)，3.27(d,2h,ch2)，1.79(s,3h,ch3)，1.75(s,3h,ch3)，1.63(s,6h,2
×
ch3)。
[0107]
amg-3：hresi-ms：计算值为c
28h32
n2o8[m-h]-523.2086,实测值为523.2082。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.51(s,1h,oh)，7.54(s,1h,nh)，7.49(s,2h,2
×
nh)，7.40(s,1h,nh)，6.97(s,1h,ar
–
h)，6.52(s,1h,ar
–
h)，5.18(m,2h,2
×
ch)，4.73(s,2h,ch2)，4.63(s,2h,ch2)，4.04(d,2h,ch2)，3.77(s,3h,och3)，3.32(d,2h,ch2)，1.79(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0108]
amg-4：hresi-ms：计算值为c
32h40
n2o8[m-h]-579.2712,实测值为579.2714。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ：13.49(s,1h,oh)，6.74(s,1h,ar
–
h)，6.30(s,1h,ar
–
h)，6.05(t,1h,nh)，5.89(t,1h,nh)，5.22(m,2h,2
×
ch)，4.17(t,2h,ch2)，4.13(t,2h,2
×
ch2)，3.80(s,3h,och3)，3.75(m,4h,2
×
ch2)，3.37(d,2h,ch2)，2.03(s,3h,ch3)，2.01(s,3h,ch3)，1.85(s,3h,ch3)，1.81(s,3h,ch3)，1.70(s,3h,ch3)，1.69(s,3h,ch3)。
[0109]
amg-5：hresi-ms：计算值为c
32h40
n2o
10
[m-h]-611.2610,实测值为611.2612。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.52(s,1h,oh)，8.07(t,1h,nh)，7.93(t,1h,nh)，6.99(s,1h,ar
–
h)，6.52(s,1h,ar
–
h)，5.18(m,2h,2
×
ch)，4.77(s,2h,ch2)，4.77(m,2h,2
×
oh)，4.68(s,2h,ch2)，4.04(d,2h,ch2)，3.77(s,3h,och3)，3.45(m,4h,2
×
ch2)，3.32(d,2h,ch2)，3.22(m,4h,2
×
ch2)，1.79(s,3h,ch3)，1.73(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0110]
amg-6：hresi-ms：计算值为c
44h48
n2o
10
[m-h]-763.3236,实测值为763.3242。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.53(s,1h,oh)，7.05(s,1h,ar
–
h)，6.87(d,4h,4
×
ar
–
h)，6.53(s,1h,ar
–
h)，6.47(d,4h,4
×
ar
–
h)，5.20(m,2h,2
×
ch)，5.07(s,2h,ch2)，4.98(s,2h,ch2)，4.89(s,4h,2
×
nh2)，4.25(q,4h,2
×
ch2)，4.05(d,2h,ch2)，3.75(s,3h,och3)，3.30(d,2h,ch2)，2.73(m,4h,2
×
ch2)，1.79(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.63(s,3h,ch3)，1.62(s,3h,ch3)。
[0111]
amg-7：hresi-ms：计算值为c
32h42
n4o8[m-h]-609.2930,实测值为609.2930。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ：8.22(t,1h,nh)，8.08(t,1h,nh)，6.99(s,1h,ar
–
h)，6.51(s,1h,ar
–
h)，5.18(m,2h,2
×
ch)，4.77(s,2h,ch2)，4.67(s,2h,ch2)，4.03(d,2h,ch2)，3.77(s,3h,och3)，3.37(m,4h,2
×
ch2)，3.33(d,2h,ch2)，3.17(m,4h,2
×
ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.73(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0112]
amg-8:hresi-ms：计算值为c
40h60
n2o6[m-h]-664.4451,实测值为664.4449。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：13.50(s,1h,oh)，6.72(s,1h,ar
–
h)，6.29(s,1h,ar
–
h)，5.25(m,2h,2
×
ch)，4.13(d,2h,ch2)，4.10(t,2h,ch2)，4.06(t,2h,ch2)，3.80(s,3h,och3)，3.36(d,2h,ch2)，2.55(m,12h,6
×
ch2)，1.68(m,4h,2
×
ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)，1.04(s,12h,4
×
ch3)。
[0113]
amg-9a:计算值为c
32h40
br2o6[m+h]
+
679.1264,实测值为679.1262。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ：13.48(s,1h,oh)，6.71(s,1h,ar
–
h)，6.28(s,1h,ar
–
h)，5.25(m,2h,2
×
ch)，4.13(t,2h,ch2)，4.09(t,2h,ch2)，4.07(d,2h,ch2)，3.80(s,3h,och3)，3.53(t,2h,ch2)，3.50(t,2h,ch2)，3.35(d,2h,ch2)，2.14(m,8h,4
×
ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,
6h,2
×
ch3)。
[0114]
amg-9c:hresi-ms：计算值为c
32h44
n2o6[m-h]-551.3127,实测值为551.3125。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.50(s,1h,oh)，6.72(s,1h,ar
–
h)，6.29(s,1h,ar
–
h)，5.24(m,2h,2
×
ch)，4.13(d,2h,ch2)，4.10(t,2h,ch2)，4.06(t,2h,ch2)，3.80(s,3h,och3)，3.36(d,2h,ch2)，2.55(m,12h,6
×
ch2)，1.92(m,4h,2
×
ch2)，1.82(s,3h,ch3)，1.80(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0115]
amg-10a:hresi-ms：计算值为c
30h36
br2o6[m+h]
+
651.0951,实测值为651.0949。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：13.48(s,1h,oh)，6.76(s,1h,ar
–
h)，6.33(s,1h,ar
–
h)，5.25(m,2h,2
×
ch)，4.24(t,2h,ch2)，4.20(t,2h,ch2)，4.13(d,2h,ch2)，3.79(s,3h,och3)，3.67(t,2h,ch2)，3.62(t,2h,ch2)，3.36(d,2h,ch2)，2.45(m,2h,ch2)，2.37(m,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0116]
amg-10c:hresi-ms：计算值为c
30h40
n2o6[m-h]-523.2814,实测值为523.2812。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.50(s,1h,oh)，6.73(s,1h,ar
–
h)，6.30(s,1h,ar
–
h)，5.25(m,2h,2
×
ch)，4.13(d,2h,ch2)，4.09(t,2h,ch2)，4.07(t,2h,ch2)，3.79(s,3h,och3)，3.36(d,2h,ch2)，2.58(m,16h,2
×
ch2)，2.45(m,2h,ch2)，2.37(m,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0117]
amg-11a:hresi-ms：计算值为c
28h32
br2o6[m+h]
+
623.0638,实测值为623.0636。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.47(s,1h,oh)，6.69(s,1h,ar
–
h)，6.26(s,1h,ar
–
h)，5.25(m,2h,2
×
ch)，4.41(t,2h,ch2)，4.37(t,2h,ch2)，4.14(d,2h,ch2)，3.86(s,3h,och3)，3.76(t,2h,ch2)，3.70(t,2h,ch2)，3.38(d,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0118]
amg-11c：hresi-ms：计算值为c
28h36
n2o6[m-h]-495.2501,实测值为495.2498。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：7.03(s,1h,ar
–
h)，6.52(s,1h,ar
–
h)，5.16(m,2h,2
×
ch)，4.11(t,2h,ch2)，4.04(t,2h,ch2)，4.01(d,2h,ch2)，3.74(s,3h,och3)，3.25(d,2h,ch2)，2.97(t,2h,ch2)，2.93(t,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0119]
amg-11c-r：hresi-ms：计算值为c
28h40
n2o6[m-h]-499.2814,实测值为499.2814。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：6.92(s,1h,ar
–
h)，6.43(s,1h,ar
–
h)，4.07(t,2h,ch2)，4.00(t,2h,ch2)，3.75(s,3h,och3)，2.97(t,2h,ch2)，2.92(t,2h,ch2)，2.50(m,4h,2
×
ch2)，1.66(m,1h,ch)，1.52(m,1h,ch)，1.32(m,4h,2
×
ch2)，0.95(s,3h,ch3)，0.93(s,3h,ch3)，0.91(s,3h,ch3)，0.89(s,3h,ch3)。
[0120]
amg-11c-1：hresi-ms：计算值为c
30h40
n2o6[m+h]
+
525.2959,实测值为525.2955。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：7.05(s,1h,ar
–
h)，6.55(s,1h,ar
–
h)，5.15(m,2h,2
×
ch)，4.20(t,2h,ch2)，4.14(t,2h,ch2)，4.02(d,2h,ch2)，3.73(s,3h,och3)，3.25(d,2h,ch2)，2.92(t,2h,ch2)，2.88(t,2h,ch2)，2.37(s,3h,ch3)，2.36(s,3h,ch3)，1.77(s,3h,ch3)，1.73(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0121]
amg-12：hresi-ms：计算值为c
32h44
n2o8[m-h]-583.3025,实测值为583.3025。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：8.32(s,2h,2
×
nh)，7.09(s,1h,ar
–
h)，6.59(s,1h,ar
–
h)，5.17(m,2h,2
×
ch)，4.17(dd,2h,ch2)，4.12(dd,2h,ch2)，4.10(brs,2h,2
×
ch)，4.04(d,2h,ch2)，3.75(s,3h,och3)，3.28(d,2h,ch2)，2.93(m,2h,ch2)，2.84(m,2h,ch2)，2.47(s,3h,ch3)，2.46(s,
3h,ch3)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0122]
amg-12-d：hresi-ms：计算值为c
30h40
n2o8[m-h]-555.2712,实测值为555.2709。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：8.34(s,2h,2
×
nh)，7.11(s,1h,ar
–
h)，6.55(s,1h,ar
–
h)，5.14(m,2h,2
×
ch)，4.16(dd,2h,ch2)，4.11(dd,2h,ch2)，4.09(brs,2h,2
×
ch)，4.03(d,2h,ch2)，3.73(s,3h,och3)，3.27(d,2h,ch2)，2.93(m,2h,ch2)，2.84(m,2h,ch2)，1.76(s,3h,ch3)，1.72(s,3h,ch3)，1.60(s,6h,2
×
ch3)。
[0123]
amg-13：hresi-ms：计算值为c
28h34
o8[m-h]-497.2181,实测值为497.2180。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.53(s,1h,oh)，7.07(s,1h,ar
–
h)，6.56(s,1h,ar
–
h)，5.17(m,2h,2
×
ch)，4.98(t,1h,oh)，4.92(t,1h,oh)，4.20(t,2h,ch2)，4.13(t,2h,ch2)，4.03(d,2h,ch2)，3.80(m,4h,2
×
ch2)，3.75(s,3h,och3)，3.27(d,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.73(s,3h,ch3)，1.62(s,6h,2
×
ch3)。
[0124]
amg-14：hresi-ms：计算值为c
32h44
n2o8[m+h]
+
581.3082,实测值为581.3061。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：13.54(s,1h,oh)，7.78(t,2h,2
×
nh)，7.11(s,1h,ar
–
h)，6.61(s,1h,ar
–
h)，5.17(m,2h,2
×
ch)，4.27(t,2h,ch2)，4.23(t,2h,ch2)，4.04(d,2h,ch2)，3.74(s,3h,och3)，3.67(dd,2h,ch2)，3.63(dd,2h,ch2)，3.29(d,2h,ch2)，1.78(s,3h,ch3)，1.74(s,3h,ch3)，1.63(s,6h,2
×
ch3)。
[0125]
实施例2、α-倒捻子素衍生物抗菌活性的测定
[0126]
参照美国临床实验室标准化委员会(clsi 2022)推荐的微量肉汤稀释法，对amg及其衍生物进行包括标准菌株、临床敏感菌株、临床耐药菌株的最小抑菌浓度(mic)测定，mic结果判断主要参照clsi m100-32st edition(2022)标准执行。检测最小抑菌浓度的步骤如下：
[0127]
a)将待测化合物溶解在适量的二甲基亚砜(dmso)中，在96孔u型板中加入100μlmhb肉汤培养基，取100μl一定浓度的化合物加入到96孔u型板的第一列中，倍比稀释至第10列。
[0128]
b)挑取测试菌株的单菌落于bhi肉汤中，在37℃摇床上培养至细菌对数生长期。用麦氏比浊仪调节细菌浊度至麦氏比浊度为0.5，并用mhb肉汤培养基稀释100倍(约为106cfu/ml)，取100μl上述菌液加入到96孔u型板中。
[0129]
c)第11列和12列分别只含有mhb肉汤培养基和待测菌液，且作为阴性对照和阳性对照。将96孔u型板置于37℃恒温培养箱内培养16-18h，读取实验结果，以肉眼可见的抑制细菌生长的最低药物浓度为该化合物的mic值。每个实验设置三个重复。
[0130]
结果：药敏试验表明，相比于amg，本发明的部分衍生物对革兰阳性菌效果更好，这可能是由于amg改造后对细菌膜完整性的破坏力增强有关。值得关注的是，部分amg衍生物可以逆转对革兰阴性菌的抗菌活性，包括标准菌株、临床敏感菌株、临床耐药菌株，尤其是amg-7、-9c、-11c、-11c-r、-11c-1、-12、-12-d、-14抗菌效果最为优异，最小抑菌浓度在0.5-4μg/ml,数据如表2所示。这些数据表明amg经过改造后，实现了其抗菌活性的广谱性。
[0131]
表2.α-倒捻子素衍生物的抗菌活性
[0132][0133][0134]
备注：amg-x中的x代表数字1-14。
[0135]
续表2.α-倒捻子素衍生物的抗菌活性
11c、11c-r和11c-1其作用均强于已知衍生物amg-9c(mic
g+
值范围分别为为1-4μg/ml；mic
50
为4μg/ml；mic
90
为4μg/ml；mic
g-值范围分别为为8-128μg/ml；mic
50
为32μg/ml；mic
90
为64μg/ml)。因此，以上数据表明，α-倒捻子素经过改造后，不仅可以保留对革兰阳性菌良好的抗菌活性，还可以拓展α-倒捻子素对革兰阴性菌的抗菌活性，使其成为较好的广谱抗菌化合物。
[0141]
表3α-倒捻子素衍生物amg-9c、11c、11c-r和11c-1的抗菌活性
[0142]
[0143]
[0144]
[0145][0146]
[0147]
实施例4、α-倒捻子素衍生物amg-9c、11c、11c-r和11c-1与不同类型抗菌药抗菌活性的对比
[0148]
试验方法同实施例2，对比了衍生物amg-9c、11c、11c-r和11c-1与不同类型的常用抗菌药对28株标准菌株和临床耐药菌株的最小抑菌浓度(mic)，mic结果判断主要参照clsi m100-32st edition(2022)标准执行。
[0149]
结果：通过药敏试验表明，amg-9c、11c、11c-r和11c-1对选取的28株标准菌株和临床耐药菌株(包括革兰阳性菌和革兰阴性菌)均表现出良好的抗菌活性，甚至其抗菌作用强于常用抗菌药如氟苯尼考、多西环素以及红霉素，特别地amg-11c、11c-r和11c-1表现出良好的抗菌作用。因此，以上数据表明，α-倒捻子素经过改造后，不仅可以保留对革兰阳性菌良好的抗菌活性，还可以拓展α-倒捻子素对革兰阴性菌的抗菌活性，使其成为较好的广谱抗菌化合物。
[0150]
表4、α-倒捻子素衍生物amg-9c、11c、11c-r和11c-1与常用抗菌药抗菌活性对比
[0151]
[0152][0153]
续表4、α-倒捻子素衍生物amg-9c、11c、11c-r和11c-1与常用抗菌药抗菌活性对比
[0154]
[0155][0156]
实施例5：α-倒捻子素衍生物的抗真菌活性
[0157]
按照nccls方案进行，稍加修改即：各受试白色念珠菌菌株在沙保弱培养基上转种2次，以确保其生长纯度和活力。经24h培养后选择生长较好的菌落，用无菌生理盐水制成菌悬液。接种时以rpmi 1640培养液将其稀释成(0.5-0.25)
×
103cfu/ml。用rpmi 1640培养液倍比稀释α-倒捻子素衍生物，使其终浓度为128-0.25μg/ml，于96孔培养板上每行1-10列孔内加入系列稀释药液100μl，同行做3行复孔。每个11孔为阴性对照，12孔为阳性对照。加入已制备好的白色念珠菌菌悬液100μl于各孔中，阴性对照不加。再于各孔中加入10μlalamar蓝，各孔变为蓝色。经35℃培养48h后，观察结果。有白色念珠菌生长的孔由蓝色变为紫红色或亮红色；阴性对照孔全部保持蓝色不变，阳性对照孔全部变为亮红色。以刚变色的前一孔的浓度作为mic值。
[0158]
结果：在选择的部分α-倒捻子素衍生物中，除了amg-12的抗真菌活性较弱以外，其他的衍生物均具有较好的抗真菌活性，且作用效果与amg保持一致。因此，经过改造以后，该类化合物仍可以保持一定的抗真菌的作用。
[0159]
表5部分α-倒捻子素衍生物的抗真菌活性
[0160][0161]
实施例6、α-倒捻子素衍生物amg-11c的生长曲线测定
[0162]
挑取大肠杆菌e.coli b2单克隆至bhi肉汤培养基中，在摇床中37℃，200rpm培养至对数生长期。用麦氏比浊仪调节细菌浊度至麦氏比浊度0.5，并用mh肉汤培养基稀释100倍(约1.0
×
106cfus/ml)后备用。用mh肉汤培养基将待测试药物稀释为所需浓度，取100μl加入96孔平底板中，每孔加入100μl稀释好的待测菌液。设置只含有mh肉汤培养基和含有待测菌液的阴性及阳性对照。设置酶标仪系统温度为37℃，检测od
600nm
处的吸光度，每小时检测一次，共检测24h。每个处理设置3个生物学重复。
[0163]
结果见图1。从细菌生长曲线发现当化合物amg-9c(浓度在16μg/ml)、amg-10c(浓度在4μg/ml)、amg-11c(浓度在4μg/ml)作用后可以显著的抑制e.coli b2的生长，并且呈剂
量依赖性，尤其是化合物amg-11c抗菌效果最为明显，这与药敏试验结果相一致。
[0164]
实施例7、α-倒捻子素衍生物amg-11c的安全性测定
[0165]
药物的安全性是决定药物是否具有潜在研发价值的关键因素之一。因此，我们对amg衍生物的安全性进行了评价，主要对羊血红细胞的溶血性进行测定。a)在96孔板中前11列加入100μl/孔的pbs溶液，最后一列加入100μl 0.2％triton x-100作为阳性对照。第一列加入amg及其衍生物的药液100μl，依次倍比稀释至第10列，第11列作为阴性对照。
[0166]
b)2ml脱纤维羊血于4℃，3,000g离心5min后，用pbs轻轻吹打冲洗2次后，用2mlpbs重悬(100％的红细胞)。1ml红细胞加入11.5ml的pbs中，配制成8％的红细胞悬液，100μl/孔加入到96孔板中。
[0167]
c)37℃放置1小时后，吸取120μl上清于新的1.5ml离心管中，3,000g离心10min后取100μl测定其在576nm的吸光值。
[0168]
溶血率的计算如下所示：
[0169]
hemolysis(％)＝[(od
576sample-od
576blank
)/(od
5760.2％tritonx-100-od
576 blank
)]
×
100％
[0170]
结果见图2。我们对化合物amg-11c的安全性进行评价，我们发现化合物amg-11c的半数溶血浓度(hly
50
)为42.13μg/ml，并且相对于amg，amg-11c的安全治疗指数大大增加。这些结果表明，amg经过结构改造后，其溶血性明显降低，具有较好的安全性。
[0171]
实施例8、α-倒捻子素衍生物的体外细胞毒性试验
[0172]
体外细胞毒性是评价药物安全性的主要指标，为化合物的改造提供研究方向。根据细胞的大小和生长速度将适量的细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时的细胞密度不超过80-90％满。加入不同药物进行处理，并设置对照。药物刺激完毕后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。尽量吸除上清，加入150μl用pbs稀释了10倍的试剂盒提供的ldh释放试剂(10倍体积pbs中加入1体积ldh释放试剂并混匀)，适当摇晃培养板混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育1小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到新的96孔板相应的孔中，随即用酶标仪在490nm处测定吸光度。
[0173]
结果：在选取的衍生物中，12和12-d的体外细胞毒性均弱于amg。因此,经过改造后的衍生物的体外安全性有一定的提高。通过构效关系分析，表明仲胺衍生物的细胞毒性弱于伯胺衍生物。
[0174]
表6部分α-倒捻子素衍生物的体外细胞毒性
[0175][0176]
实施例9、α-倒捻子素衍生物amg-11c的胞内累积试验
[0177]
大多数的小分子无法快速穿过革兰阴性菌的外膜并在这些细胞内累积，这使得寻找针对这些病原菌的药物具有挑战性。因此，评价α-倒捻子素衍生物在胞内的累积量具有重要的意义。
[0178]
a)挑取bhi琼脂培养基上e.coliatcc25922的单克隆，接种于bhi肉汤培养基中，在37℃，200rpm转速培养至对数生长期。将培养液在4℃，3000g离心10min，收集细菌沉淀，并用pbs(0.01m，ph＝7.4)清洗三遍。用新鲜无菌的pbs(0.01m，ph＝7.4)将细菌重悬，等分至无菌的1.5ml管内，调节细菌的浓度为10
10
cfu/ml。
[0179]
b)依次加入不同浓度的α-倒捻子素衍生物amg-11c，分别混匀后置于37℃培养箱内震荡孵育10、20、30、60、120min。4℃，1200rpm，离心3min，收集细菌沉淀。加入400μl无菌水重悬细菌沉淀，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次(每次各3min)以充分裂解细菌。
[0180]
c)分别4℃，1200rpm，离心3min，收集上清液。将剩余的细菌沉淀重新悬浮于200μl甲醇中，涡旋后离心，收集上清液。将两次上清液合并，1200rpm，离心3min，并过滤膜，备用。
[0181]
d)通过lc-ms 8045质谱仪测定上清液中α-倒捻子素衍生物amg-11c的含量。液相色谱柱为waters acquity uplct3(2.1
×
100mm，3μm)；进样量为1μl；流动相a为0.1％甲酸-乙腈，流动相b为0.1％甲酸-水，洗脱条件见表4。采用多反应监测(mrm)的正离子模式来定量细胞内amg-11c的含量[m/z＝355.05(定量离子)，m/z＝398.15和381.20(定性离子)]。
[0182]
结果见图3。我们对化合物amg-11c的胞内累积量进行了测定，我们发现化合物amg-11c的胞内累积量在处理不同时间后呈浓度依赖性的增长，且高浓度处理组的增长较为明显。这些结果表明，amg经过结构改造后，增加了其胞内累积量，进而表现出对革兰阴性菌的抗菌作用。
[0183]
表液相色谱梯度洗脱条件
[0184][0185]
实施例8、α-倒捻子素衍生物amg-11c的大蜡螟感染模型
[0186]
药物的动物试验模型可以预测化合物的治疗效果，因此，我们进行了大蜡螟感染模型试验来预测化合物amg-11c的治疗效果。
[0187]
将500mg左右的大蜡螟幼虫以8只每组的数量随机分成5组。每只大蜡螟从左副足中注射10μl的e.colib2菌悬液(终浓度为7
×
106cfu/只)。细菌感染1h后，4组大蜡螟从右副足中注射10μl的化合物amg-11c，其中浓度为0，4，8，20mg/kg和多粘菌素8mg/kg。在治疗72h后，计算大蜡螟的存活率。
[0188]
结果见图4。大蜡螟感染模型已经被广泛地应用于药物的筛选及其体内有效性的验证。在e.colib2的急性大蜡螟感染模型中，amg-11c给药组均具有良好的治疗效果且强于多粘菌素。因此，该类衍生物具有良好的体内治疗效果。
[0189]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.α-倒捻子素衍生物，其结构式如式i所示：式i中，r1为卤素、h；r2、r3各自独立地选自h、其中n为1-4的整数；r4选自-cn、-conh2、-nhcoch3、-conhch2ch2oh、-cooch2ch
2-ph-nh2、-conh(ch2)
m
n(r5)(r6)(m＝1-6，r5、r6各自独立地为h、c
1-c6烷基)、卤素、-n(r5)(r6)(r5、r6各自独立地为h、c
1-c6烷基)、-oh、(l为1-4的整数，r5、r6各自独立地为h、c
1-c6烷基)和中至少一种。2.根据权利要求1所述的α-倒捻子素衍生物，其特征在于：所述α-倒捻子素衍生物为如下化合物中的任一种：
3.权利要求1或2所述的α-倒捻子素衍生物在如下方面的应用：1)抗细菌感染；2)抗真菌感染；3)制备抗菌剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述细菌包括革兰阳性菌和革兰阴性菌。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述革兰阳性菌包括金黄色葡萄球菌、肠球菌、猪链球菌、产气荚膜梭菌；所述革兰阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、气单胞菌；所述真菌菌株包括白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌。6.一种抗菌剂，其特征在于：所述抗菌剂，含有权利要求1或2中任一项所述的α-倒捻子素衍生物中的至少一种。7.根据权利要求6所述的抗菌剂，其特征在于：所述抗菌剂用于抗细菌感染和抗真菌感染，其中，所述细菌包括革兰阳性菌和革兰阴性菌。8.根据权利要求7所述的抗菌剂，其特征在于：所述革兰阳性菌包括金黄色葡萄球菌、肠球菌、猪链球菌、产气荚膜梭菌；所述革兰阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、气单胞菌；所述真菌菌株包括白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌。

技术总结
本发明公开了α-倒捻子素衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的α-倒捻子素衍生物，其结构式如式I所示。其解决了α-倒捻子素仅对革兰阳性菌有效的弊端，提出了一种赋予α-倒捻子素具有广谱抗菌活性的方法。结果表明，在合成的20个衍生物中，AMG-7、-10c、-11c、-11c-r、-11c-1、-12和-14等7个衍生物均表现出较好的广谱抗菌活性，不仅对多数革兰阳性菌具有良好的抗菌活性，而且对多数的革兰阴性菌也均具有优异的抗菌活性，其中AMG-11c和AMG-11c-1的抗菌效果最为优异。1的抗菌效果最为优异。1的抗菌效果最为优异。


技术研发人员：沈建忠 朱奎 刘晓佳 刘颖
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/25