一种脂肪组织STAU1特异性敲除小鼠模型的建立方法

一种脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法。


背景技术：

2.肥胖已成为一种全球性慢性代谢性疾病，可导致2型糖尿病、心脑血管疾病、脂肪肝、癌症等并发症，严重危害人类健康。肥胖的本质是机体能量摄入超过了能量消耗，多余的能量以甘油三酯的形式储存于体内。脂肪组织是肥胖的直接效应器官，在动物体内包括白色脂肪组织(whiteadiposetissue，wat)和棕色脂肪组织(brownadiposetissue，bat)两大类。其中，wat的主要功能是储存能量，同时其作为体内最大的内分泌器官，分泌多种具有生物学功能的脂肪因子，对糖脂代谢的调控起关键作用。棕色脂肪组织(bat)是耗能组织，bat主要由棕色脂肪细胞组成。
3.脂肪细胞分化异常是肥胖的病理生理学基础，在此过程中涉及许多转录因子，rna结合蛋白在转录后水平也调控脂肪细胞的分化，其中stau1促进脂肪细胞分化，参与脂肪组织的糖脂代谢调解，stau1敲除后，大量糖脂代谢相关基因表达发生变化，提示stau1能够在转录后水平调节糖脂代谢相关基因的表达。利用全身敲除小鼠无法阐明stau1在代谢中的具体机制，需建立组织特异性基因敲除小鼠。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法，为阐明stau1在脂肪组织介导的代谢异常中的作用及机制提供有力工具。
5.为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
6.提供一种脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法，该方法包括以下步骤：
7.将基因型为stau1
flox/flox
与adiponectin-cre的小鼠杂交，得到f1代，从f1代中筛选出基因型为stau1 flox/-，cre+和stau1 flox/-，cre-的小鼠进行交配，得到f2代；从f2代小鼠中筛选出基因型为stau1
flox/flox
；adipoq-cre的小鼠为脂肪组织stau1特异性敲除小鼠。
8.进一步地，从f2代小鼠中筛选出基因型为stau1
flox/flox
；adipoq-cre的小鼠的方法为pcr方法，所用引物序列如下：
9.stau1
flox/flox
上游引物：5
’‑
catttccaaaagacgtcaccctta-3’；
10.stau1
flox/flox
下游引物：5
’‑
agtagctgacacatgctatgtacg-3’；
11.adipoq-cre上游引物：5
’‑
gaacgcactgatttcgacca-3’；
12.adipoq-cre下游引物：5
’‑
gctaaccagcgttttcgttc-3’。
13.进一步地，以f2代小鼠的基因组dna为模板进行pcr扩增，满足下述要求的小鼠为脂肪组织stau1特异性敲除小鼠：使用stau1
flox/flox
上游引物和下游引物扩增得到一条186bp的条带，且使用adipoq-cre上游引物和下游引物扩增得到一条200bp的条带。
14.本发明的有益效果为：
15.本发明基于cre-loxp技术使stau1-flox小鼠和adipoq-cre小鼠杂交，构建了一种脂肪组织特异性敲除stau1基因小鼠模型(stau1-ako)，并对其生理代谢表型进行分析来探究stau1具有促进脂肪细胞糖脂代谢的可能性，为阐明stau1在脂肪组织介导的代谢异常中的作用及机制提供有力工具。
附图说明
16.图1为本发明脂肪组织stau1特异性敲除示意图；
17.图2为f1代小鼠基因型鉴定图；
18.图3为stau1fl/fl和stau1δ/adipo基因型鉴定图；
19.图4为stau1δ/adipo基因型小鼠iwat、ewat、bat中stau1蛋白表达示意图；
20.图5为stau1δ/adipo基因型小鼠心脏、肝脏、肾脏、胰腺、肌肉组织中stau1蛋白表达示意图；
21.图6为stau1fl/fl和stau1δ/adipo基因型小鼠体重增长曲线图；
22.图7为stau1fl/fl和stau1δ/adipo基因型小鼠对血糖浓度的调节示意图；
23.图8为stau1fl/fl和stau1δ/adipo基因型小鼠对胰岛素耐受情况示意图。
具体实施方式
24.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
25.实施例
26.一、方法
27.采用spf级stau1
flox/flox
小鼠(c57bl/6j背景)与adiponectin-cre小鼠杂交，获得f1代，从f1代中筛选出基因型为stau1 flox/-，cre+和stau1flox/-，cre-的小鼠进行交配，得到f2代；从f2代小鼠中筛选出基因型为stau1
flox/flox
；adipoq-cre的小鼠为脂肪组织stau1特异性敲除小鼠。
28.其中从f1代中筛选出基因型为stau1 flox/-，cre+和stau1 flox/-，cre-的小鼠的具体方法为：从活体的刚出生小鼠上剪尾提取dna，鼠尾鉴定体系：试剂(天根预混taqmixkt201)，gdna：2ul；2xtaqmix：5ul；f：1ul；r：1ul；无酶水：1ul；pcr反应条件：95℃5min、95℃30s、60℃30s、72℃35s、30cycle、72℃10min。其鉴定结果如图2所示。
29.小鼠在交配前严格按照以下条件分笼喂养：标准小鼠饲料(3.7％脂肪，4％纤维素，21％蛋白质、71％碳水化合物)、高脂饲料购自research diet，货号：d12492(60％脂肪，20％碳水化合物，20％蛋白质)，生存环境常年室温20-22℃，自由摄食和饮水，稳定人工光照，周期为(6:00到20:00光照，20:00到6:00黑暗)。8周龄雄鼠和雌鼠按1：3比例合笼交配。实验所用动物均由新疆大学医学院动物中心伦理委员会提供监管。
30.二、基因型鉴定(琼脂糖凝胶电泳法鉴定pcr产物)
31.loxp和cre基因扩增：
32.以待鉴定小鼠基因组dna为模板，loxp和cre基因上下游引物进行pcr扩增，引物序列来自gene bank网站。
33.stau1
flox/flox pcr引物序列：
34.forward:5
’‑
catttccaaaagacgtcaccctta-3’35.reverse:5
’‑
agtagctgacacatgctatgtacg-3’36.adipoq-cre引物序列：
37.forward:5
’‑
gaacgcactgatttcgacca-3’38.reverse:5
’‑
gctaaccagcgttttcgttc-3’39.体系如下：
[0040][0041]
总反应体积10μl，95℃预变性5min，在95℃30s、60℃30s、72℃10min循环30次，最终延伸72℃2min。
[0042]
pcr产物电泳：
[0043]
(1)称取0.6g琼脂糖粉到锥形瓶中，加入60ml 1
×
tae，用锡纸包裹锥形瓶口。在微波炉中加热，直到瓶内液体变得澄清透明。
[0044]
(2)拿出锥形瓶，加入0.6μl golden view核酸染料，搅拌均匀，快速倒入插好梳子的模具中；放置30min，让胶彻底凝固。
[0045]
(3)缓慢将梳子垂直拔出，将凝胶置于电泳槽中，倒入1
×
tae电泳缓冲液，直到凝胶被完全浸没，上样孔位于电泳槽负极端。
[0046]
(4)在每孔加入10μl pcr产物，在第一孔和最后一孔加5μl的trans dnamarker plus ii。
[0047]
(5)在120v持续电压下操作15min，一旦溴酚蓝跑至凝胶2/3处，就停止电泳，轻轻拿出凝胶并将其放在凝胶成像仪上观察结果，并拍照保存结果。
[0048]
如图3所示，pcr产物电泳结果显示在250bp-100bp之间扩增出186bp特异性条带，为loxp基因，是stau1fl/fl和stau1δ/adipo型小鼠；在250bp-100bp之间扩增出200bp特异性条带，为cre基因，为stau1δ/adipo型小鼠。
[0049]
鼠尾组织dna抽提：
[0050]
1.小鼠在出生10天内通过剪脚趾的方法进行编号，取3周龄小鼠用剪刀剪去0.5cm长鼠尾，弃去第一滴血后将血移入1.5ml离心管并标记。
[0051]
2.加400ul裂解液，50ul蛋白酶k储存液，置于55℃水浴箱溶解12小时。
[0052]
3.将样本12000rpm离心10分钟。
[0053]
4.吸取上清置入1.5ml已标记离心管，加800ul无水乙醇，盖后振摇，可见絮状沉淀。
[0054]
5.12000rpm4℃离心10分钟。
[0055]
6.弃上清，待乙醇完全挥发。
[0056]
7.加looulte液吹打溶解放置-20℃冻存备用。
[0057]
构建脂肪组织stau1特异性敲除小鼠及提取组织蛋白：
[0058]
1.颈脱臼处死小鼠，剪开皮肤，取左侧腹股沟白色脂肪组织，放入提前加好蛋白裂解液(ripa:pmsf:edta:蛋白酶抑制剂＝100:1:1:1)和研磨珠(2颗5mm+3颗3mm)的管子里，全程在冰上操作。
[0059]
2.用提前制冷的研磨仪研磨组织，条件为：60hz一个循环开60s，停10s，共进行2-3个循环，研磨至无肉眼可见组织块。
[0060]
3.将研磨后的组织进行超声破损，条件为：20％功率，超声开5s，超声关5s，共进行1min。超破后的组织离心，12000rpm，4℃，10min，置于-80℃冰箱中保存。
[0061]
蛋白定量：
[0062]
1.bca工作液：算好7个标准品及待测样品的数量，将bca-a液和bca-蛋白定量b液按照50:1的体积比，配制bca工作液。
[0063]
2.样本稀释：在96孔板中加8μl pbs和2μl样品。
[0064]
3.在孔板中加200μl bca工作液，完全结合，在37℃孵育30min。
[0065]
4.在562nm处测量吸光度(a＝562nm)。计算标准曲线并计算蛋白浓度。待测蛋白与4
×
蛋白上样缓冲液按7.5:1比例混匀后，在恒温器中100℃放10min。
[0066]
凝胶电泳：
[0067]
1.用蒸馏水洗将玻璃板，并在烘箱中烘干，同时将玻璃板对准并卡紧。
[0068]
2.选择与目的蛋白分子量大小合适的不同浓度分离胶，本实验选10％分离胶。
[0069]
3.用1ml移液器将胶沿玻璃杯边缘打入缝隙中，观察是否漏胶，并避免气泡的产生，加至玻璃板的3/4处后，立刻加入异丙醇。30min后，看到异丙醇与胶之间有折线，倒去胶上的异丙醇。
[0070]
4.加浓缩胶，并在加时将梳子立即插入浓缩胶中，大约30min后定型。
[0071]
5.将配好的凝胶放入电泳槽，倒入1l电泳液，用加样枪缓慢而轻柔地冲洗胶孔，避免产生杂质和气泡。
[0072]
6.连接电源设备，将程序设置为80v，持续30min，然后将电压改为120v，继续电泳60-90min，一旦marker明显分离，就停止电泳。每孔样品加15μl，蛋白marker加4μl。
[0073]
转膜：
[0074]
剪一块pvdf膜，大小与胶相仿，放入纯甲醇中30s激活。将海绵垫和厚滤纸放入转膜液中浸湿，从上到下的顺序是黑海绵-滤纸-胶-pvdf膜-滤纸-黑海绵，切胶时不要将胶弄破，将切好的胶快速放在pvdf膜上，用胶板将膜和胶之间的气泡全部赶走，将其放在转膜槽中，并在槽中放上冰袋。在外面也放上装满冰的泡沫箱中。连接电源，转膜电流为400ma，1h。
[0075]
封闭：
[0076]
取出pdvf膜，放在5％脱脂奶中置于摇床，室温封闭1h。
[0077]
孵育抗体：
[0078]
切开相应分子量的膜，并将其置于相应的一抗中，抗体与5％奶按1:1000，将膜在4℃摇床过夜。第二天，用tbst洗膜3次，每次10min。
[0079]
二抗与5％脱脂奶的比例是1:5000。室温摇床孵育1h后，用tbst清洗3次，每次10min。物种选择根据一抗。
[0080]
ecl化学发光法检测：
[0081]
将ecl检测试剂盒的a液和b液1:1的定量关系配好，完全混合后涂抹在pvdf膜上，用azure-600仪器拍照并观察。
[0082]
凝胶图象分析：
[0083]
利用imagej图象处理分析目的蛋白和内参的灰度值，计算出目的蛋白的相对表达量。
[0084]
如图4-5所示，与stau1fl/fl小鼠相比，stau1δ/adipo小鼠的iwat、ewat、bat中无stau1蛋白表达，在其他组织中均有stau1蛋白表达。
[0085]
小鼠一般情况观察：
[0086]
观察动物的一般表现、行为、进食及死亡情况。3周小鼠分笼，6周开始称重到实验终止，依次每周定时称量体重一次。
[0087]
如图6所示，体重增长曲线显示，高脂饮食喂养8周后stau1δ/adipo小鼠体重即明显低于对照小鼠，而高脂喂养到17周时，stau1δ/adipo小鼠平均体重比对照小鼠体重减轻了约5克，差异有统计学意义。
[0088]
鼠糖代谢指标观察：
[0089]
gtt试验：
[0090]
腹腔注射葡萄糖耐量试验(intra-peritoneal glucose tolerance test,ipgtt):小鼠禁食，不禁水，并更换笼底。空腹14h后，测量小鼠体重及空腹血糖(即0min血糖)。根据小鼠体重经腹腔注射20％葡萄糖溶液(葡萄糖使用量1g/kg，用生理盐水配成20％的葡萄糖溶液，每克体重注射0.01ml。)并开始计时。在注射葡萄糖后15min，30min，60min，90min，120min分别测量小鼠血糖。实验完成后恢复小鼠饮食。如图7所示，stau1δ/adipo小鼠对葡萄糖有较好的调控作用。
[0091]
itt实验：
[0092]
小鼠禁食，不禁水，并更换笼底，空腹6h后，测量小鼠体重及空腹血糖(即0min血糖)。根据小鼠体重经腹腔注射0.1u/ml胰岛素溶液(注射总量为0.5u/kg。)并开始计时。在注射胰岛素溶液后15min，30min，60min，90min，120min分别测量小鼠血糖。实验完成后恢复小鼠饮食。如图8所示，stau1δ/adipo小鼠胰岛素抵抗也明显改善。
[0093]
本发明基于cre-loxp技术使stau1-flox小鼠和adipoq-cre小鼠杂交，构建了一种脂肪组织特异性敲除stau1基因小鼠模型(stau1-ako)，并对其生理代谢表型进行分析来探究stau1具有促进脂肪细胞糖脂代谢的可能性，为阐明stau1在脂肪组织介导的代谢异常中的作用及机制提供有力工具。
[0094]
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0095]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员
可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：将基因型为stau1
flox/flox
与adiponectin-cre的小鼠杂交，得到f1代，从f1代中筛选出基因型为stau1 flox/-，cre+和stau1 flox/-，cre-的小鼠进行交配，得到f2代；从f2代小鼠中筛选出基因型为stau1
flox/flox
；adipoq-cre的小鼠为脂肪组织stau1特异性敲除小鼠。2.根据权利要求1所述的脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法，其特征在于，从f2代小鼠中筛选出基因型为stau1
flox/flox
；adipoq-cre的小鼠的方法为pcr方法，所用引物序列如下：stau1
flox/flox
上游引物：5
’‑
catttccaaaagacgtcaccctta-3’；stau1
flox/flox
下游引物：5’agtagctgacacatgctatgtacg3’；adipoq-cre上游引物：5
’‑
gaacgcactgatttcgacca-3’；adipoq-cre下游引物：5
’‑
gctaaccagcgttttcgttc-3’。3.根据权利要求2所述的脂肪组织stau1特异性敲除小鼠模型的建立方法，其特征在于，以f2代小鼠的基因组dna为模板进行pcr扩增，满足下述要求的小鼠为脂肪组织stau1特异性敲除小鼠：使用stau1
flox/flox
上游引物和下游引物扩增得到一条186bp的条带，且使用adipoq-cre上游引物和下游引物扩增得到一条200bp的条带。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种脂肪组织STAU1特异性敲除小鼠模型的建立方法，该方法包括以下步骤：将基因型为STAU1


技术研发人员：梁小弟 孟轩羽 关亚群
受保护的技术使用者：新疆医科大学
技术研发日：2022.10.24
技术公布日：2023/7/25