大豆GmCCS7基因在植物抗干旱中的应用

大豆gmccs7基因在植物抗干旱中的应用
技术领域
1.本发明属于植物育种技术领域，具体涉及大豆gmccs7基因在植物抗干旱中的应用。


背景技术：

2.干旱、盐碱、低温和高温、重金属等非生物胁迫会严重影响植物的正常生长发育，尤其是作物的产量。干旱胁迫是严重影响植物生长和发育的主要环境制约因素之一(minusi winck，sarmento等人，2022年)。干旱胁迫会干扰生理生化过程，如光合作用、转运、呼吸和生长刺激物，从而降低大豆的生产力(imran、latif khan等人，2021)。在长时间的干旱胁迫条件下，反应氧物种(ros)过度积累并导致氧化损伤(asada 2006、jaspers和kangasjarvi 2010)。反应性氧物种(ros)是由植物中的氧化还原反应产生的，包括有氧呼吸和光合作用，并调节一些重要的途径，包括细胞凋亡、能量代谢、炎症反应和应激反应。高水平的活性氧，如1o2(单线态氧)、(超氧自由基)，在干旱胁迫过程中会产生oh(羟基自由基)和h2o2(过氧化氢)。为了克服干旱引起的损害，植物通过增强超氧化物歧化酶(sod)活性来清除多余的活性氧来激活其防御系统。
3.铜是一种必需的微量元素，属于微量元素，参与动植物的正常生理过程。先前的研究表明，必需铜辅因子是酵母中sod1的关键成分，而ccs作为铜伴侣发挥作用。ccs可以提高铜离子结合能力，将铜离子转移到sod1，然后使sod1活性成熟并激活，在sod1中生成二硫键(valentine和gralla 1997)。sod1的人类铜伴侣(命名为ccs)是20多年前作为酿酒酵母lys7的同系物发现的(culotta，klomp等人，1997)。2014年，在大豆中证明存在并克隆了铜氧化物歧化酶gmccs基因的叶绿体铜伴侣(sagasti，bernal等人，2014)。ccs会将铜离子吸收到需要铜的酶铜锌超氧化物歧化酶(sod1)中，而增加ccs的比例可以显著延长使用cuii的转基因小鼠的存活时间(furukawa和tokuda 2020)。ccs-sod1相互作用也是稳健mek1/2激活的必要先决条件，mek1/2激活反过来磷酸化并激活erk(benson，yu等人，2009年，grasso，bond等人，2021)。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了提供铜分子伴侣ccs新的功能。
5.本发明提供一种大豆gmccs7蛋白或编码大豆gmccs7蛋白基因在提高植物抗旱能力中的应用。
6.进一步地限定，所述植物为大豆。
7.进一步地限定，所述gmccs7蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述gmccs7蛋白的编码基因的序列如seq id no.1所示。
8.进一步地限定，所述抗旱能力为降低植物的气孔导度和蒸腾速率；所述干旱的条件为20％peg6000处理6天。
9.本发明提供一种携带seq id no.1所示的gmccs7蛋白的编码基因的重组载体在提
高植物抗旱能力中的应用。
10.进一步地限定，所述重组载体的出发载体为pcambia1300。
11.本发明提供一种携带seq id no.1所示的gmccs7蛋白的编码基因或表达seq id no.4所示的gmccs7蛋白的重组工程菌在提高植物抗旱能力中的应用。
12.进一步地限定，所述重组工程菌的出发菌株为原核微生物生物或者真核微生物。
13.本发明一种提高大豆抗旱能力的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
14.步骤1：将seq id no.1所示基因序列与pcambia1300载体连接获得重组载体；
15.步骤2：将步骤1获得的重组载体转入到农杆菌中，获得重组农杆菌；
16.步骤3：将步骤2获得的重组农杆菌侵染植物获得转基因植物。
17.进一步地限定，扩增seq id no.1所示基因序列的引物为seq id no.2和seq id no.3所示。
18.有益效果：gmccs7基因提高了大豆对氧化应激的抵抗力，并诱导应激反应基因的表达，以增强大豆的抗旱性，gmccs7基因过表达植物可能通过与sod1相互作用来抵御干旱胁迫，在干旱胁迫下，gmccs7基因通过加快关闭、降低蒸腾速率和气孔导度发挥调节作用。
附图说明
19.图1为gmccs7基因在大豆的不同组织中的表达水平，其中，横坐标是组织，纵坐标是相对表达量；
20.图2为gmccs7基因在大豆的不同胁迫条件下的表达水平，其中，横纵坐标是时间，纵坐标是相对表达量；
21.图3gmccs7转基因植株与野生型对照品种dn50干旱胁迫后表型分析及生物量分析；其中，(a)是体积分数20％ peg6000胁迫处理24h后对照品种dn50与转基因植株的表型，(c)是对照品种dn50与转基因植株的定量实时荧光定量pcr鉴定，(c)是体积分数20％peg6000胁迫处理24h后对照品种dn50与转基因植株根鲜重，(d)体积分数20％peg6000胁迫处理24h后对照品种dn50与转基因植株根干重；
22.图4为未处理及体积分数20％peg 6000处理24h后对照品种dn50与转基因植株响应情况分析；其中，(a)是20％ peg6000处理24h后对照品种dn50与转基因植株气孔长与宽统计，(b)是20％ peg6000处理24h后对照品种dn50与转基因植株气孔长/宽统计，(c)是20％ peg6000处理24h后对照品种dn50与转基因植株胞间co2浓度比较，(d)是20％peg6000处理24h后对照品种dn50与转基因植株蒸腾速率比较；
23.图5为gmccs7与sod1互作关系验证，其中，(a)是gmccs7亚细胞定位，(b)是bifc(双分子萤光互补实验)gmccs7与sod1验证互作关系，(c)是y2h(酵母双杂交验证)gmccs7与sod1互作关系；
24.图6为过表达gmccs7基因的不同的转基因植株中耐旱基因的表达水平。
具体实施方式
25.实施例1.植物表达载体的构建
26.首先在phytozome上查询gmccs7基因的编码序列信息，遵循引物设计基本原则设计基因引物，通过pcr引物扩增gmccs7的编码序列(seq id no.1),gmccs7-f:gagctggtacc
cggggatcgatggcattttctgagg(seq id no.2)，gmccs7-r:caccatggtgtcgactctgagcgagctaac(seq id no.3)。
27.seq id no.1：
28.atggcatttctgaggtcaatagcaacaacagcaattgctactatacctgcagccttagcattctcatcatcttcatcatcttctttccctcgctcttcccaatcccccaatccccaaaatagattaggtcttgtcaaaacacttgctactcctccctctgctctccacatggaccacaaactctcttctcagcctgacgctgtcttgcccgagttactgacggagttcatggtggacatgaaatgcgaaggttgtgttaatgctgtcaaaaataagttgaacgagataaatggagttaagaacgtagaggtggacttgagcaatcaggttgtgaggattctcggttcaacgccggtgaagactatgactgaagctttggagcagactggtagaaaagcccggttaattggacaaggagtgccggaagacttcttaatatctgctgctgtttccgaattcaaaggtccagatatttttggtgttgttcgcctggctcaagtaaatatggaactggctaggattgaagccaactttagcgggctgtcgccaggaaagcatggttggtctattaatgagtttggtgatctgactagaggtgcagcaagcactggtaaaatgttcaatccggtaaatgaggaaaacagtaaagagccactgggcgacctgggaacactagaagctaacgaaaagggtgaggccttctatagtggggtcaaagaaaagctgagggtggctgatcttattggacgatctgtggtggtatatgcaactgaagataaatcagaacatggtataactgctgcagtaattgccagaagtgctggggtgggtgagaactataagaaactctgtacgtgtgatggcaccaccatatgggaggccacggatacagattttgttactagcaaggtctga。
29.gmccs7氨基酸序列，seq id no.4：
30.maflrsiattaiatipaalafsssssssfprssqspnpqnrlglvktlatppsalhmdhklssqpdavlpelltefmvdmkcegcvnavknklneingvknvevdlsnqvvrilgstpvktmtealeqtgrkarligqgvpedflisaavsefkgpdifgvvrlaqvnmelarieanfsglspgkhgwsinefgdltrgaastgkmfnpvneenskeplgdlgtleanekgeafysgvkeklrvadligrsvvvyatedksehgitaaviarsagvgenykklctcdgttiweatdtdfvtskv。
31.基因克隆反应体系如下表1：
32.表1
[0033]2×
easytaq mix10μlforward primer1μlreverse primer1μl模板1μlddh2o7μl总体系20μl
[0034]
pcr反应条件如下表2：
[0035]
表2
[0036][0037]
然后，限制位点(bamhi和xbai)。用bamhi和xbai(neb)酶切gmccs基因的pcr产物和pcambia1300载体，将酶切产物通过同源重组至pcambia1300中以生成pcambia1300-gmccs7。
[0038]
将pcambia1300载体和上述纯化的pcr产物分别用bamh i和xbai进行双酶切。
[0039]
载体反应体系如表3：
[0040]
表3
[0041][0042][0043]
目的基因酶切体系如表4：
[0044]
表4
[0045]
灭菌ddh2o65μlbuffer cutsmart10μlbamh i2.5μlxbai2.5μlgmccs720μl总体积100μl
[0046]
反应条件：37℃培养箱反应2h。
[0047]
连接反应体系如表5所示：
[0048]
表5
[0049]
灭菌ddh2o5μl5*ce ii buffer1μlexnase ii0.5μlpcambia1300线性化载体1.5μl
gmccs7 pcr产物2μl总体积10μl
[0050]
反应条件：37℃30min。
[0051]
实施例2.胁迫处理植物材料
[0052]
1.植物材料和胁迫处理
[0053]
以东农50(dn50)为野生型。对于各种非生物胁迫，包括干旱(20％peg6000用于模拟干旱胁迫的影响)、盐胁迫(150mm nacl)、碱胁迫(75mm nahco3)，dn50在水培中发芽2周，霍格兰营养液每三天更换一次(吴，林等，2018)。所有平板均置于生长室中，在潮湿条件下，温度保持在25℃，光照16h/8h黑暗。从不同植物组织(根、茎、叶、花、荚果)中提取总rna，提取时间分别为0、1、6、12、18、24h。
[0054]
以本氏烟为材料，用于做ccs7的亚细胞定位。种子在24
±
2℃和95％湿度的含蛭石的盆中发芽3周。
[0055]
2.rna提取、cdna合成和qpcr
[0056]
根据制造商说明书(transgen biotech)，使用植物rna提取试剂盒从组织中提取植物rna，并用于合成第一链cdna。在1.5％琼脂糖凝胶上检查rna的完整性，并用nanodrop(thermo scientific)检查总rna的质量评估。根据制造商的说明，使用transstart top green qpcr supermix(transgen biotech)将rna(1.5μg)转录成cdna。半定量rt-pcr用于检测gmccs7的mrna表达水平，tua5 mrna的表达水平作为对照。使用qpcr仪(applied biosystems)进行实时定量pcr分析。qpcr温度程序包括以下步骤：95℃10分钟；95℃15秒、55℃15秒、72℃15秒的40个循环；然后进行熔融曲线分析。管家基因tua5用作对照，以使每个相关基因的相对转录物丰度正常化。用于qrt pcr的引物为gmccs7-q-s:tgactagaggtgcagcaagc(seq id no.5)；gmccs7-q-as:aaggcctcacccttttcgtt(seq id no.6)。
[0057]
3.对干旱胁迫有反应的铜伴侣gmccs7基因的鉴定
[0058]
提取东农50(dn50)的rna，为了研究gmccs7的组织特异性表达，在营养生长期和生殖生长期，gmccs7在各个器官中的表达模式。
[0059]
结果如图1所示gmccs7在两个组织(根、叶)中的表达水平最高，在根中的表达水平最高。
[0060]
评估了gmccs7基因在各种胁迫下的表达模式，并通过qpcr分析了野生大豆dn50幼苗在霍格兰培养基中暴露于不同胁迫(150mm nacl，质量分数20％peg6000，75mm nahco3)处理3天后的gmccs7转录水平。
[0061]
结果如图2所示表明，20％peg处理6h后，显著诱导大豆根和叶中gmccs7的表达水平，并逐渐上调至12h，在18h时达到约15倍的峰值。在nacl和nahco3处理下，gmccs7的转录水平没有明显变化，基于这一结果，证明了gmccs7可能在干旱胁迫反应的早期阶段发挥关键作用。
[0062]
实施例3.获得转基因材料
[0063]
1.发根农杆菌介导的大豆毛状根转化
[0064]
为了产生转化的大豆毛状根，大豆品种东农50(dn50)被用于发根农杆菌介导的转化。种子在25℃的湿度室中，在16h光照/8h暗光照下萌发。一周后，向健康植物注射含有
pcambia1300(ck)或pcambia1300-gmccs7载体的菌株k599。然后将感染的植株转移到室内，并保持在高湿度下，直到感染部位产生毛状根，并生长到2-5厘米长。将原主根从感染部位下方0.5cm的区域移开，然后将具有2-5cm毛状根的幼苗移入盆栽5天。
[0065]
2.过量表达gmccs7提高大豆抗旱性
[0066]
鉴于gmccs7的表达模式在干旱胁迫下表现出强烈的诱导作用，推测gmccs7可能在干旱胁迫反应中发挥关键作用。使用发根农杆菌k599介导的毛状根系统，pcambia1300空载体转化和pcambia1300-gmccs7转化大豆获得转基因大豆，其中pcambia1300用作阴性对照。
[0067]
为了证明转基因大豆植株的产生，使用pcr方法在转基因大豆和野生型dn50中扩增gmccs7的编码序列。通过绝对实时pcr测定的gmccs7转录水平，过表达植株中gmccs7的表达水平比野生型dn50高12.4到46.2倍。使用三个表达水平相对较高的gmccs7过表达大豆品系(品系#1、品系#2和品系#3)来研究gmccs7在大豆干旱胁迫反应中的作用。在干旱处理条件下(20％peg6000处理苗期大豆24h)，与野生型相比，转基因植株长势良好，而野生型对照品种dn50植株出现萎蔫，野生型对照品种dn50萎蔫率高于转基因植株。
[0068]
结果如图3所示，与野生型植物相比，转基因植物表现出更强的耐旱性，野生型叶片变黄并且出现枯萎。20％peg6000处理苗期大豆24h后，通过测量其生长发育来评估其耐逆性。我们测量了对照和干旱胁迫下wt和gmccs7过表达植物的根长、根鲜重、根干重。干旱胁迫明显降低了根生物量和叶生物量，但野生型转基因植株的生物量下降比所有转基因植株更为显著。
[0069]
3.gmccs7过表达增加气孔闭合
[0070]
光合生理和气孔生理是控制叶片水分状况的性状。保卫细胞在叶表皮上形成气孔，并通过改变气孔孔径对环境因素作出反应。分析了干旱胁迫前后大豆叶片的蒸腾速率、气孔大小(气孔长度和宽度)和密度。干旱胁迫前气孔的长宽比最小，在这些植物中没有表现出显著差异。在gmccs7过表达植株和野生型植株之间，气孔密度没有显示出显著差异。有趣的是，在干旱胁迫体积分数20％peg 6000模拟干旱胁迫24h后，gmccs7过表达植物和野生型植物之间的气孔孔径显著小于未处理植物。gmccs7过表达植株气孔关闭更为明显。为了研究干旱胁迫下的光合速率，测定了蒸腾速率和胞间co2浓度。
[0071]
结果如图4表明，与对照植物相比，gmccs7过表达植物的蒸腾速率显著降低。因此，在干旱胁迫下，gmccs7可能通过保卫细胞膨胀加快关闭气孔、降低蒸腾速率发挥调节作用。
[0072]
4.互作试验
[0073]
为了构建用于bifc分析的质粒，通过pcr扩增gmccs7和sod1的完整编码区，并分别使用一步克隆试剂盒(vazyme)将其克隆到pcambia 1300-35s-n-yfpn和pcambia 1300-35s-n-yfpc中获得重组载体pcambia1300-35s-n-yfpn-gmccs7和pcambia 1300-35s-n-yfpc-sod1。
[0074]
将上述两个重组载体分别转化到具有活性的大肠杆菌菌株trans1-t1中，提取质粒进行转化。然后，将重组质粒转移到根癌农杆菌菌株gv3101中，通过农杆菌介导的瞬时转化将其转移到烟叶中，结果如图5(b)所示，gmccs7与sod1在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质中存在互作关系；同时，我们也分析了gmccs7的亚细胞定位情况，发现gmccs7定位于细胞核和叶绿体中。
[0075]
5.y2h分析
[0076]
y2h分析使用gal4系统进行，对融合到gal4激活域的大豆叶片cdna文库进行筛选。将gmccs7蛋白的完整编码序列用作大豆诱饵，并克隆到含有gal4 dna结合域的pgbkt7载体中：用gmccs7同源臂引物gmccs7-bd-s:atggccatggaggccgaattcatggcatttctgaggtcaatag(seq id no.7)；gmccs7-bd-as:tcgacggatccccgggaattcgaccttgctagtaacaaaatctgtat(seq id no.8)以gmccs7为模板，进行扩增，将pcr产物进行2％琼脂糖凝胶进行检测，出现目的条带后将pcr产物进行纯化，然后将酶切后的线性化载体进行1.5％琼脂糖凝胶检测，然后将酶切后的载体进行胶回收，将线性化载体的胶回收产物与pcr产物纯化后的目的片段进行重组，然后将重组产物进行转化大肠杆菌，获得pgbkt7-gmccs7。
[0077]
将5μg诱饵质粒dna pgbkt7-gmccs7转化到酵母染色剂y2hgold中以产生诱饵克隆。将单个酵母菌落接种在10ml酵母提取物蛋白胨-葡聚糖培养基(ypd)中作为预培养(wu，scholten等人，2020)。细胞在30℃下以220rpm的速度生长。将10ml预培养物进一步在100ml ypd培养基中培养过夜。收集3ml细胞并记录od
546
。然后收集30个od
546
细胞并在200ml ypd培养基中培养3-5小时，直到od
546
达到0.6-0.7。将200ml培养物分为四个50ml ep管，在700
×
g下离心5分钟收集细胞。分别用1ml 0.9％nacl和10ml醋酸锂/tris-edta缓冲液(lioac/te主混合物)清洗细胞，然后将细胞重新放入600μl lioac/te主混合物中。每个部分(4
×
)用7μg文库、100μl单链载体dna、600μl细胞、2.5ml peg/lioac主混合物建立。将混合物旋转1分钟，并在30℃下培养45分钟(每15分钟轻轻旋转一次)。然后，添加150μl二甲基亚砜并将其混合到该部分中。将混合物在42℃下热冲击20分钟。收集细胞并将其重新悬浮在补充有腺嘌呤(ypda)的3ml ypd中，并在30℃下培养90分钟(以150rpm的速度振荡)。最后，将细胞重新悬浮在4.8ml 0.9％nacl中，并在选择性平板、sd/his-trp-leu培养基(100μl/90mm平板)上培养。为了计算转化效率，在sd/his-trp-leu培养基上将细胞稀释至1:100和1:1000。所有转化板在30℃下培养2-3天。使用引物对5'-taatacgactcactataggg-3'和5'-agatggtgcacgatgcacag-3'对sd/his-trp-leu培养基中的所有菌落进行pcr扩增。pcr产物在2％琼脂糖凝胶上分离，使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化单个感兴趣的条带，并由comate bioscience有限公司测序。测序结果由ncbi blast程序检查。
[0078]
将sod1的全长cds(seq id no.9：atggtgaaggctgtggcagttcttggcagcagcgagggtgtcactggaactattttcttcactcaggagggaaatggtccaaccaccgtaactggatctcttgctggtcttaagcctggtctccatggcttccatgtccatgccttgggggacactaccaatggttgcctgtcaactggagcgcatttcaatcctaataacaacgagcacggtgcccctgaggacgagaatcgtcatgctggtgatcttgggaatgttaatgtcggtgatgatggtaccgttagcttcagtattaccgacagtcagattcctctcactggaccaaactccatcataggaagggctgttgttgtccatgctgattctgatgaccttggaaaaggtggtcatgagcttagcaaaactactggaaatgctggtggcagagtagcttgtggtatcattggtctgcaaggataa)克隆到pgadt7中，生成融合的gal4 dna激活域作为大豆猎物。通过ecori消化将sod1编码区插入pgadt7载体，构建pgadt7-sod1载体。将诱饵质粒pgbkt7-gmccs7和猎物质粒pgadt7-sod1共转化到y2hgold酵母细胞中。
[0079]
将阴性对照载体(pgadt7和pgbkt7、pgadt7-sod1和pgbkt7、pgadt7和pgbkt7-gmccs7)在sd/-trp leu培养基下转化到酵母菌株y2hgold中。所有转化板在30℃下培养2-3天。分别用特异引物对平板中的所有菌落进行pcr扩增，然后将阳性菌落重新接种在选择平板sd/ade-his-trp-leu培养基上。y2hgold酵母细胞在gal4上游激活序列的控制下含有四个报告基因(his2、ade2、mel1和aur1)，用于检测两种杂交相互作用。
[0080]
结果如图5所示，gmccs7与叶绿体中超氧化物歧化酶sod1相互作用：为了识别gmccs7蛋白的功能，以gmccs7为诱饵，通过酵母双杂交筛选鉴定gmccs7相互作用蛋白。将gmccs7的cds区克隆到pgbkt7载体中，然后将构建的载体或空载体分别转化到酵母菌株y2hgold中。sod1最初被鉴定为gmccs7的相互作用子，然后使用酵母双杂交法测试gmccs7和sod1之间的相互作用。将sod1的cds区克隆到pgadt7载体中，pgadt7和pgadt7-sod1，pgbkt7和pgbkt7-gmccs7，pgadt7和pgbkt7，pgadt7-sod1和pgbkt7-gmccs7分别转化为y2hgold。随后，将转化体生长在sd/ade-his-trp-leu培养板上。结果表明，pgadt7-sod1和pgbkt7-gmccs7能够激活报告基因的转录，而阴性对照(pgadtt7+pgadt7-sod1、pgbkt7+pgbkt7-gmccs7、pgadtt7+pgbkt7)不能激活报告基因。我们证实了gmccs7和sod1的相互作用。为推测gmccs7过表达植物可能通过与sod1相互作用来抵御干旱胁迫提供了证据。
[0081]
6.参与gmccs7介导干旱胁迫的抗逆相关基因
[0082]
为了直接证明在干旱胁迫发生时，sod1活性的变化可以阻止活性氧产量的大幅增加，我们检测了sod(sod1和sod2)的表达模式。sod-s:atggtgaaggctgtggca(seq id no.10)；sod-as:ttatccttgcagaccaatgatac(seq id no.11)。
[0083]
为了进一步了解gmccs7过表达植物抗逆性改变的机制，还分析了抗氧化剂和应激反应基因(gmtrxs、gmglr、gmrd26、gmpyl5、gmpyl2、gmgrx)的转录水平。
[0084]
结果如图6表明，在干旱胁迫下，gmccs7过表达植株中sod1和sod2的转录显著增加(p《0.05)。与对照组相比，在干旱胁迫下，gmccs7过表达植株中gmpyl5、gmpyl2和gmrd26的表达分别高出4倍、5.3倍和7.9倍(p《0.05)。然而，野生型植物和gmccs7过表达植物的其他基因表达增加，而与对照组相比没有显著差异。符合gmccs7和sod1之间可能相互作用的假设，提高了大豆对氧化应激的抵抗力，并诱导应激反应基因的表达，以增强大豆的抗旱性。

技术特征：
1.大豆gmccs7蛋白或编码大豆gmccs7蛋白基因在提高植物抗旱能力中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述gmccs7蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述gmccs7蛋白的编码基因的序列如seq id no.1所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗旱能力为降低植物的气孔导度和蒸腾速率；所述抗旱的条件为20％peg6000处理24h。5.一种携带seq id no.1所示基因的重组载体在提高植物抗旱能力中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pcambia1300。7.一种携带seq id no.1所示基因或表达seq id no.4所示蛋白的重组工程菌在提高植物抗旱能力中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组工程菌的出发菌株为原核微生物生物或者真核微生物。9.一种提高大豆抗旱能力的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：步骤1：将seq id no.1所示基因序列与pcambia1300载体连接获得重组载体；步骤2：将步骤1获得的重组载体转入到农杆菌中，获得重组农杆菌；步骤3：将步骤2获得的重组农杆菌侵染植物获得转基因植物。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，扩增seq id no.1所示基因序列的引物为seq id no.2和seq id no.3所示。

技术总结
本发明一种大豆GmCCS7基因在植物抗干旱中的应用，属于植物育种技术领域，为了提供铜分子伴侣CCS新的功能。本发明提供大豆GmCCS7蛋白或编码大豆GmCCS7蛋白基因在提高植物抗旱能力中的应用，利用20％PEG6000处理过表达GmCCS7基因的大豆24h，GmCCS7基因可以降低植物的气孔导度和蒸腾速率，GmCCS7基因提高了大豆对氧化应激的抵抗力，并诱导应激反应基因的表达，以增强大豆的抗旱性。以增强大豆的抗旱性。以增强大豆的抗旱性。


技术研发人员：焦爽 柏锡 周静文 曹凤鸣 冯瑞
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2022.10.13
技术公布日：2023/7/25