一种血浆外泌体核酸释放方法以及NGS建库方法与流程

一种血浆外泌体核酸释放方法以及ngs建库方法
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种血浆外泌体核酸释放方法以及ngs建库方法。


背景技术：

2.外泌体(exosome)是一种30-150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。外泌体在被发现后的很长一段时间内都没有引起研究者的注意，直到纳米分析技术的引进，以及2013年诺贝尔生物医学奖的公布，这个直径只有几十纳米的颗粒受到了前所未有的重视。
3.据研究报道，外泌体中含有的内容物如dna、rna、蛋白质和信号复合物在受体细胞基因和蛋白表达调控中有重要作用。如血浆外泌体中的mirna(exosomal mirna)具有独特的介导细胞间通讯的功能，能特异性抑制靶细胞中的靶基因表达，因此与游离mirna相比，血浆exosomal-mirna水平的变化更加能代表恶性肿瘤的生物学功能的变化。另外，肿瘤细胞衍生外泌体通过传递的mirna还能调节肿瘤细胞转移前微环境的形成。
4.目前，市场上对血浆中外泌体内核酸的建库需要先将外泌体纯化，然后再将其内部的核酸提取、纯化出来，再进行建库工作。具体操作如下：
5.1、外泌体提取：通常采用纤维膜吸附、沉淀试剂沉淀、离心以及免疫吸附等方法进行外泌体分离与富集。
6.2、外泌体rna/dna提取：分离后的外泌体一般采用trizol或者高盐方法进行外泌体裂解，然后再进行核酸的纯化获得核酸产物，最后才进行建库。
7.当前的血浆外泌体内核酸建库缺点如下：
8.1、需要进行外泌体中的核酸纯化，通常采用的方法：操作步骤繁琐、耗时长，而且所用试剂大多有毒，对操作人员身体和环境可能造成危害。
9.2、目前市场上只有用于外泌体rna提取纯化的产品，暂无用于外泌体dna提取纯化的产品，无法实现外泌体dna建库实验。


技术实现要素：

10.本发明的目的是，提供一种血浆外泌体核酸释放方法以及ngs建库方法。主要解决现有技术中外泌体核酸建库需要先进行核酸提取纯化、操作步骤繁琐、耗时长、对环境有危害的问题。
11.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
12.一种血浆外泌体核酸释放方法，该方法为：将提取的外泌体悬浮于水中，得到的外泌体重悬液进行涡旋震荡和震荡孵育，其中涡旋震荡的速度≥500rpm。
13.作为优选实施方案，在血浆样本中加入外泌体捕获磁珠，离心沉淀，然后采用洗涤液进行洗涤，得到所述外泌体。
14.所述捕获磁珠为粒径0.8-3μm的羧基磁珠，浓度为0.1～1mg/ml。磁珠表面包被是
外泌体特异的抗体，抗体浓度为0.01～1mg/ml。优选捕获磁珠：粒径为1μm的羧基磁珠，磁珠表面包被外泌体特异性抗体为cd63，浓度为0.5mg/ml。所述捕获磁珠中的cd63抗体可以和外泌体表面特有的cd63抗原特异性结合，将外泌体吸附在免疫磁珠表面。
15.所述洗涤液包括终浓度为1～20mm的na2hpo4、终浓度为0.5～10mm的nah2po4和终浓度为0.1～2m的nacl。优选洗涤液包括：终浓度为15mm的na2hpo4、终浓度为8mm的nah2po4和终浓度为0.35m的nacl。
16.作为优选实施方案，3～10ml血浆样本提取的外泌体悬浮于水中制备100ul外泌体重悬液进行涡旋震荡。
17.作为优选实施方案，所述外泌体重悬液还包括防腐剂。
18.作为优选实施方案，所述防腐剂为叠氮化钠或proclin。叠氮化钠在重悬液中的浓度为0.25％。
19.作为优选实施方案，所述涡旋震荡时间为2min以上；所述震荡孵育温度为23-80℃、孵育时间为5min以上。
20.作为优选实施方案，所述涡旋震荡的速度为1000-2000rpm。
21.本发明还提供一种ngs建库方法，该建库方法包括本发明所述的血浆外泌体核酸释放方法。所述方法释放的核酸经瞬时离心后，取上清液进行ngs建库。
22.作为优选实施方案，本发明提供的ngs建库方法包括如下步骤：
23.(1)将血浆样本加入离心管中，加入捕获磁珠充分震荡混匀，然后震荡孵育；
24.(2)将离心管瞬时离心，置于磁力架上，吸弃液体；
25.(3)加入洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，吸弃液体；
26.(4)加入纯水得到重悬液，1000-2000rpm涡旋震荡，23-80℃震荡孵育；
27.(5)所得混合液瞬时离心，置于磁力架上；
28.(6)吸取上清进行后续的ngs建库操作。
29.参见图1，为本发明提供的核酸免提取ngs建库方法的实施流程图。
30.作为更具体的实施方案，所述ngs建库方法包括如下步骤：
31.(1)将1ml血浆样本加入离心管中，然后加入100μl的捕获磁珠，充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；
32.(2)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
33.(3)加入1ml的洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
34.(4)加入100μl的重悬液，2000rpm涡旋震荡2min，50℃震荡孵育5min；
35.(5)所得混合液瞬时离心约5s，置于磁力架上1min；
36.(6)吸取上清进行后续的建库操作。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
38.1，本发明提供的核酸释放方法中使用的重悬液组分简单，只需要纯水，不需要其他复杂成分，其中叠氮化钠(或者proclin)的作用只是起到防腐作用。纯化水加上涡旋震荡就可以实现外泌体核酸的释放，进而实现外泌体核酸免提取直接进行建库。
39.2，本发明的核酸释放方法，相比市场上的核酸释放剂，虽然在核酸产量上没有优势，但是在建库质量上明显好于市场上的核酸释放剂。
40.3，本发明提供的ngs建库方法不需要分别进行外泌体提取和核酸提取，实现一步法样本处理，省时、方便快速、操作简单、可实现自动化。
41.4，本发明的建库方法比现有的试剂盒产品在rna/dna产量上实现了提升，同时在相同核酸量建库后获得的文库总量无差别，证明本发明获得的核酸产量高，同时获得的核酸对后续建库不存在影响。
附图说明
42.图1是本发明提供的核酸免提取ngs建库方法的实施流程图。
具体实施方式
43.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
44.实施例1：血浆外泌体中rna/dna建库
45.同一样本分别用纯化水和含有0.25％叠氮化钠纯化水作为重悬液比较。
46.(1)将3ml血浆样本加入离心管中，然后加入150μl的捕获磁珠(粒径为1μm的羧基磁珠，磁珠表面包被外泌体特异性抗体为cd63，抗体浓度为0.5mg/ml)，充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；
47.(2)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
48.(3)加入3ml的洗涤液(15mm的na2hpo4、8mm的nah2po4和0.35m的nacl)，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
49.(4)重复步骤(3)1次；
50.(5)加入纯水制备成100μl的重悬液(样本p01加入纯化水不含叠氮化钠，样本p02加入含有0.25％叠氮化钠的纯水)，2000rpm涡旋震荡2min，50℃震荡孵育5min；
51.(6)所得混合液瞬时离心约5s，置于磁力架上1min；
52.(7)吸取上清进行后续的建库操作。
53.rna建库：(使用试剂盒为neb公司rrna depletion kit v2(human/mouse/rat)，货号：#e7400s)，rna建库结果见表1。
54.dna建库：(使用试剂盒为neb公司ultra
tm dna library prep kit for illumina)，货号：#e7645s)，dna建库结果见表2。
55.表1：rna建库结果
[0056][0057]
表2：dna建库结果
[0058][0059]
表1和表2的结果表明：采用纯水作为重悬液或者在重悬液中加入叠氮化钠，经涡旋震荡释放的核酸均能够成功进行rna和dna的文库构建。
[0060]
实施例2：重悬液所适用样本量研究
[0061]
针对重悬液的样本处理能力进行研究，分别设计样本量为3ml和10ml进行实验。
[0062]
(1)分别将3ml和10ml的血浆样本加入15ml的离心管中，然后3ml血浆样本的离心管中加入150μl的捕获磁珠，10ml血浆样本的离心管中加入500μl的捕获磁珠(采用粒径为1μm的羧基磁珠，磁珠表面包被外泌体特异性抗体为cd63，抗体浓度为0.5mg/ml)，充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；
[0063]
(2)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0064]
(3)加入3ml的洗涤液(15mm的na2hpo4、8mm的nah2po4和0.35m的nacl)，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0065]
(4)重复步骤(3)1次；
[0066]
(5)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；加入1ml的洗涤液重悬(15mm的na2hpo4、8mm的nah2po4和0.35m的nacl)，然后转移到1.5ml的离心管；
[0067]
(6)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0068]
(7)加入纯水制备成100μl的重悬液，2000rpm涡旋震荡2min，50℃震荡孵育5min；
[0069]
(8)所得混合液瞬时离心约5s，置于磁力架上1min；
[0070]
(9)吸取上清进行产量检测。检测结果见表3。
[0071]
表3不同样本量的重悬液核酸产量结果
[0072]
样本重悬液rna产量(ng)重悬液dna产量(ng)3ml血浆4.923.1810ml血浆15.549.57
[0073]
表3结果表明：100μl的重悬液能够处理10ml血浆样本中外泌体dna/rna的释放。当重悬液体积增大时还可以实现更大的样本量处理。
[0074]
实施例3：重悬液释放核酸条件的优化
[0075]
(1)将3ml血浆样本加入离心管中，然后加入150μl的捕获磁珠(粒径为1μm的羧基磁珠，磁珠表面包被外泌体特异性抗体为cd63，抗体浓度为0.5mg/ml)，充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；
[0076]
(2)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0077]
(3)加入3ml的洗涤液(15mm的na2hpo4、8mm的nah2po4和0.35m的nacl)，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0078]
(4)重复步骤(3)1次；
[0079]
(5)加入纯水制备成100μl的重悬液，根据表4中设置的实验条件分别对重悬液进行处理；
[0080]
表4
[0081][0082]
(6)所得混合液瞬时离心约5s，置于磁力架上1min；
[0083]
(7)吸取上清进行产量检测。检测结果参见表5。
[0084]
表5
[0085]
组别重悬液rna产量(ng)重悬液dna产量(ng)a2.971.35b4.652.41c4.492.39d4.752.38e4.652.51
[0086]
表5数据结果表明：重悬液进行涡旋震荡时，涡旋转速达到1000rpm就可以实现核酸的完全释放，更高的转速也可以。b、d、e组比较说明孵育温度在室温至80℃的范围均可以实现核酸释放。涡旋和孵育时间分别选择2min和5min以上即可。
[0087]
实施例4：本发明方法与现有试剂盒建库产品比较
[0088]
a.本发明方法
[0089]
(1)将3ml血浆样本加入离心管中，然后加入150μl的捕获磁珠(粒径为1μm的羧基磁珠，磁珠表面包被外泌体特异性抗体为cd63，抗体浓度为0.5mg/ml)，充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；
[0090]
(2)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0091]
(3)加入3ml的洗涤液(15mm的na2hpo4、8mm的nah2po4和0.35m的nacl)，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0092]
(4)重复步骤(3)1次；
[0093]
(5)加入纯水制备成100μl的重悬液，2000rpm涡旋震荡2min，50℃震荡孵育5min；
[0094]
(6)所得混合液瞬时离心约5s，置于磁力架上1min；
[0095]
(7)吸取上清进行产量检测及建库。
[0096]
b.现有试剂盒
[0097]
b-1：rna提取，采用qiagen-exorneasy midi kit(货号77144)进行外泌体和rna提取；
[0098]
b-2：dna提取，目前市场上没有用于外泌体dna提取的产品，故采用norgen的
plasma/serum exosome purification kit(货号：57400)进行外泌体提取，然后采用qiagen的qiaamp minelute virus spin kit(货号：57704)试剂盒进行dna提取；
[0099]
rna建库：(使用试剂盒为neb公司rrna depletion kit v2(human/mouse/rat)，货号：#e7400s)，rna建库结果见表6。
[0100]
dna建库：(使用试剂盒为neb公司ultra
tm dna library prep kit for illumina)，货号：#e7645s)，dna建库结果见表7。
[0101]
表6本发明与现有试剂盒的rna建库结果
[0102][0103]
表7本发明与现有试剂盒的dna建库结果
[0104][0105]
表6和表7的结果表明：本发明的核酸免提取建库方法比现有的试剂盒建库产品在rna/dna产量上实现了提升，同时在相同核酸量建库后获得的文库总量无差别，说明本发明方法获得的核酸产量得到提高，同时获得的核酸对后续建库不存在影响。
[0106]
实施例5：本发明重悬液与市场常用免提取核酸释放剂比较
[0107]
使用现在市场上常见的核酸释放剂对比本发明的重悬液
[0108]
(1)准备2组血浆样本，分别取3ml加入离心管中，然后各加入150μl的捕获磁珠(粒径为1μm的羧基磁珠，磁珠表面包被外泌体特异性抗体为cd63，抗体浓度为0.5mg/ml)，充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；
[0109]
(2)将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0110]
(3)加入3ml的洗涤液(15mm的na2hpo4、8mm的nah2po4和0.35m的nacl)，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；
[0111]
(4)重复步骤(3)1次；
[0112]
(5)本发明组加入含0.25％叠氮化钠的纯化水制备成100μl的重悬液，对照组加入100μl的市售核酸释放剂(北京百奥莱博科技有限公司，货号：btn61202)。2000rpm涡旋震荡2min，50℃震荡孵育5min；
[0113]
(6)所得混合液瞬时离心约5s，置于磁力架上1min；
[0114]
(7)吸取上清进行产量检测及建库。检测结果见表8。
[0115]
表8本发明重悬液与现有核酸释放剂的对比结果
[0116][0117][0118]
表8数据结果表明：相比市场上的核酸释放剂，本发明的核酸释放方法虽然在核酸产量上没有优势，但是在建库质量上明显好于市场上的核酸释放剂。
[0119]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

技术特征：
1.一种血浆外泌体核酸释放方法，该方法为：将提取的外泌体悬浮于水中，得到的外泌体重悬液进行涡旋震荡和震荡孵育，其中涡旋震荡的速度≥500rpm。2.如权利要求1所述的血浆外泌体核酸释放方法，其特征在于，所述外泌体的提取方法为：在血浆样本中加入外泌体捕获磁珠，离心沉淀，然后采用洗涤液进行洗涤，得到所述外泌体。3.如权利要求2所述的血浆外泌体核酸释放方法，其特征在于：3～10ml血浆样本提取的外泌体悬浮于水中制备100ul外泌体重悬液进行涡旋震荡。4.如权利要求1所述的血浆外泌体核酸释放方法，其特征在于：所述外泌体重悬液还包括防腐剂。5.如权利要求4所述的血浆外泌体核酸释放方法，其特征在于：所述防腐剂为叠氮化钠或proclin。6.如权利要求1所述的血浆外泌体核酸释放方法，其特征在于：所述涡旋震荡时间为2min以上；所述震荡孵育温度为23-80℃、孵育时间为5min以上。7.如权利要求1所述的血浆外泌体核酸释放方法，其特征在于：所述涡旋震荡的速度为1000-2000rpm。8.一种ngs建库方法，该方法包括权利要求1-7任一项所述的血浆外泌体核酸释放方法。9.如权利要求8所述的ngs建库方法，其特征在于：所述方法释放的核酸经瞬时离心后，取上清液进行ngs建库。10.如权利要求8所述的ngs建库方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将血浆样本加入离心管中，加入捕获磁珠充分震荡混匀，然后震荡孵育；(2)将离心管瞬时离心，置于磁力架上，吸弃液体；(3)加入洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，吸弃液体；(4)加入纯水得到重悬液，1000-2000rpm涡旋震荡，23-80℃震荡孵育；(5)所得混合液瞬时离心，置于磁力架上；(6)吸取上清进行后续的ngs建库操作。

技术总结
本发明公开了一种血浆外泌体核酸释放方法以及NGS建库方法。所述外泌体核酸释放方法为：将提取的外泌体悬浮于水中，得到的外泌体重悬液进行涡旋震荡和震荡孵育，其中涡旋震荡的速度≥500rpm。所述涡旋震荡时间为2min以上；所述震荡孵育温度为23-80℃、孵育时间为5min以上。所述外泌体释放的核酸经瞬时离心后，取上清液进行NGS建库。本发明方法中使用的重悬液组分简单，只需要纯化水，不需要复杂的成分。纯化水加上涡旋震荡就可以实现外泌体核酸的释放，进而实现外泌体核酸免提取直接进行NGS建库。本发明提供的NGS建库方法，实现了一步法样本处理，省时、方便快速、操作简单、可实现自动化。现自动化。现自动化。


技术研发人员：马跃 唐华 蔡瑶 赵小玉 张亚楠
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2023/7/25