3-羟基苯乙酸在制备预防和/或治疗老年男性生殖功能障碍的药物中的应用

1.本发明涉及3-羟基苯乙酸在制备预防和/或治疗老年男性生殖功能障碍的药物中的应用，属于医药领域。


背景技术：

2.近年来，由于医学和公共卫生政策的进步，人们的预期寿命显著增加。然而，随着男性年龄的增长，睾丸功能逐渐下降，并导致其受精能力、整体健康状况和生活质量受到影响。因此，探索新的改善男性衰老所致的生殖系统功能障碍的方法具有重大意义。
3.目前临床上改善男性精子质量的药物主要有维生素e、辅酶q10和番茄红素等，这些药物的主要作用是抗氧化应激，但是截止目前，并没有明确的报道发现这些药物的治疗靶点。
4.目前文献报道3-羟基苯乙酸可改善心肌梗死小鼠模型的心室病理性重构（microbiome. 2022 may 31;10(1):82. doi: 10.1186/s40168-022-01271-6.），同时还有报道发现3-羟基苯乙酸具有降低血压（nutrients. 2022 jan 13;14(2):328. doi: 10.3390/nu14020328.）和预防酒精性肝损伤的作用（int j mol sci. 2022 feb 3;23(3):1762. doi: 10.3390/ijms23031762.），但尚未有人发现3-羟基苯乙酸与衰老男性生殖功能的关系。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供3-羟基苯乙酸的药物新用途。
6.本发明所提供的3-羟基苯乙酸的药物新用途是3-羟基苯乙酸在制备预防和/或治疗雄性生殖功能障碍的药物中的应用。
7.所述雄性生殖功能障碍具体可为衰老所致的雄性生殖功能障碍。
8.所述雄性生殖功能障碍具体指睾丸生精功能障碍。
9.本发明的另一目的是提供3-羟基苯乙酸在制备具有如下1）-4）中至少一种功能的药物中的应用：1）提高精子浓度；2）使睾丸内生精细胞排列层次增多、排列整齐；3）使各级生精细胞显著增多；4）降低睾丸的氧化应激水平。
10.所述降低睾丸的氧化应激水平指如下至少一种：1）使睾丸中的总谷胱甘肽过氧化物酶增高；2）使睾丸中的还原型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比例提高；3）使丙二醛含量降低。
11.本发明通过衰老小鼠模型，探讨了3-羟基苯乙酸在衰老小鼠睾丸生精功能障碍中的作用，结果表明3-羟基苯乙酸能够提高衰老小鼠的精子浓度，进一步通过对睾丸组织he
染色，发现3-羟基苯乙酸可以使衰老小鼠睾丸内生精细胞排列更加整齐，睾丸免疫荧光显示，经3-羟基苯乙酸治疗后，各级生精细胞显著增多。最后，本发明还发现3-羟基苯乙酸可以降低衰老小鼠睾丸的氧化应激水平。
12.本发明中3-羟基苯乙酸化学式明确，且为人体内源性代谢物，主要针对老年男性生殖能力降低，与现有的改善男性精子质量的药物有所区别。本发明解决临床上预防或治疗衰老所致的雄性生殖功能障碍的药物严重不足的问题，首次发现3-羟基苯乙酸显著改善衰老小鼠的生精功能，为老年男性生殖功能障碍提供了一种新的预防和治疗选择。
附图说明
13.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为本发明实施例1中小鼠精子密度、精子活力结果（a+b级精子比例，a+b+c级精子比例），其中以18-20个月衰老小鼠作为对照组，3-羟基苯乙酸指衰老小鼠给予3-羟基苯乙酸灌胃组（以下均相同）。*，p＜0.05；a为小鼠精子密度，b为a+b级精子比例，c为a+b+c级精子比例。
14.图2为本发明实施例1中小鼠精子运动内在参数检测结果；图2中a为直线速度、b为曲线速度、c为平均路径速度、d为鞭打频率、e为精子头部侧摆幅度及f为前向性。
15.图3为本发明实施例1中小鼠睾丸组织he染色结果。图3中的a为衰老小鼠组的睾丸he代表图，b为a的放大2倍代表图； c为衰老小鼠给予3-羟基苯乙酸灌胃组的睾丸he代表图，d为c的放大2倍代表图。
16.图4为本发明实施例1中小鼠睾丸组织各级生精细胞免疫荧光结果。dazl为精原细胞的标志物，sycp3为精母细胞的标志物，pgk2为圆形精子的标志物，tnp1为长形精子的标志物，wt1为支持细胞的标志物。
17.图5为本发明实施例1中睾丸中抗氧化物质的检测结果。图5中的a为总抗氧化能力结果，b为总谷胱甘肽过氧化物酶含量的结果，c为超氧化物歧化酶含量的结果，其中，**，p＜0.01。
18.图6为本发明实施例1中睾丸中谷胱甘肽含量检测结果。图6中的a为还原型谷胱甘肽的含量结果，b为还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值，其中，*，p＜0.05，**，p＜0.01。
19.图7为本发明实施例1中睾丸中的丙二醛含量的检测结果。其中，*，p＜0.05。
具体实施方式
20.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
21.在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
22.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
23.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
24.1.实验动物：衰老小鼠18-20个月，c57bl/6品系，雄性，spf级，由北京大学医学部动物部提供。适应性喂养1周后，分别为空白对照组（灌胃生理盐水），模型组（灌胃25mg/kg的3-羟基苯乙酸（使用生理盐水配置为10mg/ml的浓度）），每日一次，连续灌胃6周。实验结束后，处死小鼠，取出附睾、睾丸，睾丸称重并进行相应处理。
25.动物实验严格遵循北京大学第三医院动物实验管理规定，经动物实验伦理委员会审核。
26.（1）组织留取：小鼠称重、睾丸组织称重。留取新鲜附睾。一侧睾丸组织行4%的多聚甲醛固定、常规酒精脱水和石蜡包埋切片；另一侧睾丸组织直接提取蛋白或行液氮冻存。
27.（2）检测对睾丸组织生精小管形态学的影响：睾丸组织的石蜡切片，进行常规组织形态学染色（苏木精-伊红染色法）观察各组小鼠睾丸组织生精小管形态学变化，如生精小管排列、管腔形状、各级生精细胞的排列及多少等。
28.（3）测定对精液质量的影响：新鲜附睾，采用扩散法收集附睾精子并利用计算机辅助精液分析系统（北京穗加软件有限公司）检测小鼠的精子密度、前向运动比例及精子运动总比例；直线速度、曲线速度、平均路径速度、鞭打频率、精子头部侧摆幅度及前向性。
29.（4）睾丸免疫荧光病理学检测：睾丸组织的石蜡切片，进行常规脱蜡后，在95℃的edta中抗原修复30分钟，使用10%的驴血清封闭1小时，各级生精细胞的标志物抗体4℃孵育过夜，二抗孵育及dapi染核后，在蔡司lsm880共聚焦显微镜下拍摄。
30.（5）根据碧云天公司提供的总抗氧化能力、总谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽和丙二醛检测试剂盒的说明，对睾丸氧化应激状态进行检测。
31.（6）所有数据至少代表三次独立实验，数据以均数
±
标准误（sem）表示。使用graphpad prism9 进行t检验分析，p值＜0.05认为差异具有统计学意义，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。
32.2.实验结果：2.1 小鼠精子密度和精子运动指标首先，我们通过计算机辅助精液分析的方法检测了对照组和3-羟基苯乙酸两组小鼠治疗结束时的精液质量，结果发现（见图1）：与对照组小鼠相比较，3-羟基苯乙酸小鼠的精子密度明显增高，p＜0.05，而3-羟基苯乙酸小鼠精子的前向运动比例和运动总比例相比对照组没有显著改变。
33.2.2小鼠精子运动内在参数通过计算机辅助精液分析的方法检测两组小鼠的精子运动内在参数，如图2所示，stz小鼠精子的内在运动指标包括直线速度(a)、曲线速度(b)、平均路径速度(c)、鞭打频率(d)、精子头部侧摆幅度(e)及前向性(f)，两组之间未见明显的差异。
34.2.3 小鼠睾丸组织he染色结果
对两组小鼠的睾丸组织进行苏木精-伊红(he)染色，结果发现（见图3）：衰老组小鼠的生精小管中各级生精细胞排列层次减少，管腔中精子稀疏；而3-羟基苯乙酸小鼠的生精小管中各级生精细胞排列层次增多，排列整齐，管腔中可见增多的成熟精子。
35.2.4小鼠睾丸组织免疫荧光的结果小鼠睾丸组织的免疫荧光结果（见图4）显示，圆形精子的标志物pgk2和长形精子的标志物tnp1的表达在3-hpaa组明显高于对照组，可以看出3-羟基苯乙酸的治疗可以提高衰老小鼠的精子浓度。
36.2.5 小鼠睾丸氧化应激水平表达的结果通过试剂盒的方法检测了两组小鼠总抗氧化能力、总谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽和丙二醛水平的变化，结果发现（见图5、图6和图7）：3-羟基苯乙酸组小鼠睾丸中的总谷胱甘肽过氧化物酶（gpx）显著增高，p＜0.01；同时，3-羟基苯乙酸治疗后，小鼠睾丸中的还原型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比例都显著提高，p＜0.05；反映脂质氧化水平的丙二醛在3-羟基苯乙酸组中显著降低，p＜0.05。
37.由上述实施例可知，本发明基于衰老小鼠在3-羟基苯乙酸治疗后，通过计算机辅助精液分析系统、睾丸组织学染色、免疫荧光及睾丸氧化应激水平检测，发现3-羟基苯乙酸能够提高衰老小鼠的精子浓度，改善衰老小鼠睾丸结构，使生精细胞增多，减轻衰老小鼠睾丸的氧化应激水平。据此，可将3-羟基苯乙酸应用于制备改善老年男性生殖功能障碍的治疗药物。
38.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.3-羟基苯乙酸在制备预防和/或治疗雄性生殖功能障碍的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雄性生殖功能障碍为衰老所致的雄性生殖功能障碍。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雄性生殖功能障碍指睾丸生精功能障碍。4.3-羟基苯乙酸在制备具有如下1）-4）中至少一种功能的药物中的应用：1）提高精子浓度；2）使睾丸内生精细胞排列层次增多、排列整齐；3）使各级生精细胞显著增多；4）降低睾丸的氧化应激水平。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降低睾丸的氧化应激水平指如下至少一种：1）使睾丸中的总谷胱甘肽过氧化物酶增高；2）使睾丸中的还原型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比例提高；3）使丙二醛含量降低。

技术总结
本发明提供了3-羟基苯乙酸在制备预防和/或治疗老年男性生殖功能障碍的药物中的应用。本发明通过衰老小鼠模型，探讨了3-羟基苯乙酸在衰老小鼠睾丸生精功能障碍中的作用，结果表明3-羟基苯乙酸能够提高衰老小鼠的精子浓度，通过对睾丸组织HE染色，发现3-羟基苯乙酸可以使衰老小鼠睾丸内生精细胞排列更加整齐，睾丸免疫荧光显示，经3-羟基苯乙酸治疗后，各级生精细胞显著增多。本发明还发现3-羟基苯乙酸可以降低衰老小鼠睾丸的氧化应激水平。以降低衰老小鼠睾丸的氧化应激水平。以降低衰老小鼠睾丸的氧化应激水平。


技术研发人员：张哲 金滋润 杭婧 曹亚磊 姜辉 刘强
受保护的技术使用者：北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/7/25