拉曼免疫探针和SERS-胶体金免疫层析试纸以及它们的应用

拉曼免疫探针和sers-胶体金免疫层析试纸以及它们的应用
技术领域
1.本发明涉及表面增强拉曼散射和免疫层析检测技术领域，具体涉及一种拉曼免疫探针和sers-胶体金免疫层析试纸以及它们的应用。


背景技术：

2.胶体金快速检测试纸条是目前对样品中的病原体等目标物进行现场快速检测的常用方法之一，其具有操作简单而且试纸条的体积小易于携带等优点，但该方法通常只能实现定性检测，而且在检测的灵敏度方面还有较大的提高空间。而对于病原体的现场检测中，实现高灵敏度的定量检测对相关疾病的早期检测、早期治疗和经济损失的挽回都有着重要作用。
3.表面增强拉曼光谱(sers)是一种近年来高速发展的检测手段，其主要特点之一是具有极高的检测灵敏度，检测限可以低至单分子水平。目前，sers技术广泛应用于肿瘤目标物检测、污染物监测、食品卫生等领域。如果将sers技术与胶体金免疫层析技术相结合，既可以利用胶体金免疫层析技术的快速和现场检测便利性，又能通过sers技术极大提高检测灵敏度，并且能够通过便携式拉曼光谱仪等易于携带的小型设备实现现场定量检测，从而使得病原体等目标物的现场检测更加精准高效。
4.然而，目前sers检测中常用的纳米标记材料如纳米金锥、纳米金花等，在制备过程中为了实现对其结构的控制，常常会在制备过程中添加大量表面活性剂，使得获得的纳米材料表面附着的表面活性剂易刻蚀材料，从而造成sers信号明显减弱，而且材料的稳定性较差。采用这些材料制成的sers-胶体金免疫层析试纸不仅灵敏度提高幅度不足，而且也难以长期稳定储存，严重影响了该试纸的实际使用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种拉曼免疫探针和sers-胶体金免疫层析试纸以及它们的应用。本发明提供的拉曼免疫探针中采用通过ag
+
焊接法制成的金纳米二聚体作为sers检测的纳米标记材料，避免了表面活性剂的不利影响，从而使得该拉曼免疫探针具有更高的稳定性和灵敏度。
6.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种拉曼免疫探针，所述拉曼免疫探针包括金纳米二聚体，以及修饰在所述金纳米二聚体上的信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1。
7.本发明第二方面提供第一方面所述的拉曼免疫探针的制备方法，所述方法包括：
8.(1)金纳米二聚体的组装；
9.(2)信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1的修饰。
10.本发明第三方面提供一种表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸，所述试纸包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区，其中，所述结合物区包括结合垫，所述结合垫包含拉曼免疫探针，所述拉曼免疫探针为第一方面所述的拉曼免疫探针或
根据第二方面所述的方法制备获得的拉曼免疫探针。
11.本发明第四方面提供第一方面所述的拉曼免疫探针，或者根据第二方面所述的方法制备获得的拉曼免疫探针，或者第三方面所述的表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸在样品中的病原体检测中的应用，尤其是在样品中的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。
12.通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
13.(1)本发明提供的拉曼免疫探针中采用的金纳米二聚体在制备过程中无需使用表面活性剂，避免了表面活性剂附着于纳米材料表面对sers检测信号以及探针稳定性的不利影响。
14.(2)采用本发明提供的拉曼免疫探针制备的sers-胶体金免疫层析试纸兼具胶体金免疫层析试纸的便携性和sers检测的高灵敏性，并且，通过采用便携式拉曼光谱仪等小型设备即可实现样品的高精准度和高准确性现场定量检测，有效提高了病原体检测的效率，对于疾病和公共卫生事件的防控工作具有重大意义。
15.(3)得益于本发明提供的拉曼免疫探针的高稳定性，采用该探针制成的sers-胶体金免疫层析试纸能够长期稳定保存，实验表明，在4℃条件下储存6个月后，该试纸的sers信号强度仍能够基本保持原有水平。
16.(4)本发明提供的拉曼免疫探针的用途和使用方式广泛，应用前景十分广阔。其中采用该拉曼免疫探针制备的sers-胶体金免疫层析试纸还具有使用方法简单，易于操作，大幅降低了对检测仪器、实验场地和人员的专业要求，适合在基层推广应用。
附图说明
17.图1是制备例1中制备获得的金纳米二聚体的表征和质量水平检测结果。图1-a为琼脂糖凝胶电泳结果图；图1-b为纯化后的金纳米二聚体悬液；图1-c为金纳米二聚体悬液紫外吸收光谱图；图1-d为金纳米二聚体的透射电镜图。
18.图2是实施例1中拉曼免疫探针优化过程的检测结果图。图2-a为纯化后的金纳米二聚体悬液、金纳米二聚体-4-mba悬液、金纳米二聚体-4-mba-ab1悬液和拉曼免疫探针悬液的紫外分光光谱图；图2-b为采用不同浓度4-mba溶液制备的拉曼免疫探针的紫外分光光谱图；图2-c为采用不同浓度4-mba溶液制备的拉曼免疫探针的拉曼信号强度对比图。
19.图3是实施例1中制备sers-免疫层析试纸时t线包被的ab1的浓度优化结果图。图3-a为实验组试纸t线显色情况对比图；图3-b为实验组拉曼信号强度对比图；图3-c为实验组拉曼光谱曲线对比图；图3-d为对照组试纸t线显色情况对比图；图3-e为对照组拉曼信号强度对比图；图3-f为对照组拉曼光谱曲线对比图。
20.图4是实施例2中采用sers-免疫层析试纸对不同载毒量的pedv阳性样品液标准品进行定性和定量检测的结果图。图4-a为对不同载毒量的pedv阳性样品液标准品进行定性检测的试纸t线显色情况对比图；图4-b为对不同载毒量的pedv阳性样品液标准品进行定量检测的试纸t线区域拉曼光谱曲线对比图；图4-c为根据拉曼光谱中1586cm-1
位移处信号强度绘制的拉曼信号强度与阳性样品液标准品浓度的线性拟合图。
21.图5是实施例2中sers-免疫层析试纸的特异性检测结果图。图5-a为对不同致病菌或病毒样品进行检测的试纸t线显色情况对比图；图5-b为对各样品检测获得的拉曼光谱曲线对比图；图5-c为对各样品进行定量检测时，拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对
比图。
22.图6是实施例2中sers-免疫层析试纸的批内重复性检测结果图。图6-a为实验组试纸定性检测的t线显色情况对比图；图6-b为实验组试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图6-c为实验组试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图；图6-d为对照组试纸定性检测的t线显色情况对比图；图6-e为对照组试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图6-f为对照组试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图。
23.图7是实施例2中sers-免疫层析试纸的批间重复性检测结果图。图7-a为实验组i试纸定性检测的t线显色情况对比图；图7-b为实验组i试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图7-c为实验组i试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图；图7-d为对照组i试纸定性检测的t线显色情况对比图；图7-e为对照组i试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图7-f为对照组i试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图。
24.图8是实施例2中sers-免疫层析试纸的批间重复性检测结果图。图8-a为实验组ii试纸定性检测的t线显色情况对比图；图8-b为实验组ii试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图8-c为实验组ii试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图；图8-d为对照组ii试纸定性检测的t线显色情况对比图；图8-e为对照组ii试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图8-f为对照组ii试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图。
25.图9是实施例2中sers-免疫层析试纸的稳定性检测结果图。图9-a为保存不同时间的实验组试纸定性检测的t线显色情况对比图；图9-b为保存不同时间的实验组试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图9-c为保存不同时间的实验组试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图；图9-d为保存不同时间的对照组试纸定性检测的t线显色情况对比图；图9-e为保存不同时间的对照组试纸定量检测的拉曼图谱对比图；图9-f为保存不同时间的对照组试纸定量检测的拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度对比图。
26.图10是采用本发明的sers-免疫层析试纸进行pedv检测的流程和原理示意图。
具体实施方式
27.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
28.本发明中，“目标检测物”是指任意能够采用免疫(层析)法检测的物质，其可以为病毒、致病菌等病原体，也可以为毒素、蛋白、基因(片段)、生物标志物、药物分子等其他需要进行检测的物质。
29.本发明中，“拉曼免疫探针”又可称为“拉曼免疫标签”，简称为“免疫探针”或“免疫标签”，其意义相同，可以互换使用。是指能够特异性结合目标检测物，并且能够产生特定sers信号的免疫标签。
30.本发明中，“表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸”简称为“sers-免疫层析试纸”，其意义相同，可以互换使用。是指将sers技术与(胶体金)免疫层析技术相结合而获得的既具有免疫层析技术的便携性高、检测方便等特征，又具有sers技术的灵敏度和准确性
高、方便实现(现场)定量检测等优势的一种新型免疫层析试纸。
31.本发明中，对于操作的编号，例如“第一接触”、“第二接触”、“第三接触”等，主要用于在描述上便于区分不同步骤中的操作，对于其具体对应的处理方式、条件或顺序等没有限制作用。例如，“第一接触”、“第二接触”、“第三接触”可以采用相同的处理方式和条件，也可以采用各不相同的处理方式和条件。
32.本发明中，对于所用试剂的编号，例如“抗体ab
1”、“抗体ab
2”等，主要用于在描述上便于区分试纸上不同部分采用的抗体，对于其具体采用的抗体种类和来源等没有限制作用。例如。抗体ab1是能够与目标检测物特异性结合的抗体，抗体ab2是能够与ab1特异性结合的抗体，上述抗体在具体进行选择是既可以为具有相应功能的鼠单克隆抗体，也可以为具有相应功能的兔单克隆抗体或羊单克隆抗体等，且ab1和ab2可以均为相同来源的抗体，或者也可以分别为不同来源的抗体(例如均为鼠单克隆抗体，或者其中一个为鼠单克隆抗体，另一个为兔或羊单克隆抗体等)。
33.本发明的发明人在研究中发现，通过将纳米金颗粒组装成能够放大拉曼信号的特殊结构，再在其表面修饰信号标记分子和目标检测物抗体等修饰基团，能够获得适用于免疫层析试纸中的sers标签，从而获得既具有携带和使用便利性高的优点，又能利用拉曼光谱仪等小型、易携带、易操作的设备进行现场直接定量检测的sers-免疫层析试纸。
34.通常，sers增强能力依赖于具有一定曲率的纳米金属标记材料，这就要求标记材料具有较多的尖端或凹陷等结构，然而，为了获得具有所需结构的纳米金属材料，往往需要使用大量的表面活性剂进行具有所需结构的纳米金属材料的制备。虽然表面活性剂的加入使得纳米材料的结构能够满足需要，但是表面活性剂的存在也极大影响了采用这样的标记材料制成的sers-免疫层析试纸的灵敏度，而且对于试纸条的稳定性和存储条件也造成了极大的负面影响。
35.经过大量研究后，本发明的发明人巧妙地发现，采用ag
+
焊接法将纳米金颗粒组装成金纳米二聚体，不仅避免了表面活性剂的使用，而且还能够获得对sers信号具有较好增强效果的纳米金结构。此外，采用该金纳米二聚体与特定信号标记分子以及目标检测物抗体相结合制成的sers标签不仅具有极高的灵敏度、特异性和准确性，而且还具有重复性好和能够长期稳定保存的优点。这使得该sers标签十分适合用于sers技术与免疫层析技术相结合的sers-免疫层析试纸的制备。
36.基于上述发现，本发明一方面提供一种拉曼免疫探针，所述拉曼免疫探针包括金纳米二聚体，以及修饰在所述金纳米二聚体上的信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1。
37.本发明中，“金纳米二聚体”是指由两个粒径相近的纳米金颗粒(例如两个粒径比不超过1∶1.2的纳米金颗粒)组装而成的金纳米结构，这两个纳米金颗粒之间具有一个亚纳米级的缝隙，从而具有了很好的sers信号增强能力。任意具有上述结构的金纳米二聚体均可适用于本发明提供的拉曼免疫探针。为了进一步提高金纳米二聚体的sers信号增强能力，并且保证其在信号分子和抗体修饰过程中的胶体稳定性，根据本发明的优选实施方式，其中，所述金纳米二聚体由两个粒径不超过30nm的纳米金颗粒组装形成，间距不超过1nm。
38.优选地，所述金纳米二聚体由两个粒径20-25nm的纳米金颗粒组装形成。
39.本发明中，“信号标记分子”是指具有明确的sers特征信号的化合物，通过对sers
检测结果中的信号峰位置与强度即可实现对目标检测物的定性及定量检测。任意具有上述特征的化合物均可作为信号标记分子适用于本发明提供的拉曼免疫探针。根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述信号标记分子选自4-硝基苯硫醇(4-ntp，特征峰位于1330cm-1
处)、4-巯基吡啶(4-mpy，特征峰位于1105cm-1
处)、4-巯基苯甲腈(4-mbn，特征峰位于2246cm-1
处)和4-巯基苯甲酸(4-mba，特征峰位于1080cm-1
处)中的任意一种。
40.根据本发明的优选实施方式，其中，所述拉曼免疫探针还包括和封闭剂。封闭剂的作用在于避免拉曼免疫探针在试纸条上的非特异性吸附干扰测定结果，任意具有该作用并且对于本发明提供的拉曼免疫探针的准确性、灵敏度以及稳定性等效果没有不利影响的物质均可作为封闭剂适用于本发明提供的拉曼免疫探针。
41.优选地，所述封闭剂选自牛血清蛋白(bsa)。
42.本发明中，对于特异性结合目标检测物的抗体ab1的具体选择没有特别限制，只要能够与对应的目标检测物特异性结合的抗体均可适用于本发明。本发明中，对于抗体ab1的来源也没有特别限制，其可以是通过商购或定制途径获得的成品产品，或者也可以为根据现有技术自行制备的相关产品。
43.根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述拉曼免疫探针为以猪流行性腹泻病毒(pedv)为目标检测物的探针。
44.优选地，所述拉曼免疫探针中选用的特异性结合pedv的抗体ab1选自pedv鼠单克隆抗体、pedv兔单克隆抗体、pedv羊单克隆抗体中的至少一种。
45.本发明第二方面提供第一方面所述的拉曼免疫探针的制备方法，所述方法包括：
46.(1)金纳米二聚体的组装；
47.(2)信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1的修饰(图10中示例性地示出了一种优选的制备流程)。
48.本发明中，步骤(1)的目的在于将纳米金颗粒组装成用于拉曼免疫探针中能够增强sers信号的金纳米二聚体结构。为了避免表面活性剂等试剂对拉曼免疫探针的sers信号增强效果造成不利影响，本发明在步骤(1)中优选采用无需使用具有上述作用和效果的试剂(例如表面活性剂等)的方法进行金纳米二聚体的组装。
49.根据本发明的一种优选实施方式，其中，步骤(1)中，采用ag
+
焊接法进行金纳米二聚体的组装。ag
+
焊接法是指利用ag
+
和金纳米颗粒表面配体分子之间的相互作用，诱导金纳米颗粒发生聚集，再由鱼精dna终止聚集反应，促使形成稳定的金纳米颗粒寡聚体的过程。
50.优选地，步骤(1)包括：将鱼精dna(fsdna)、ag
+
溶液在缓冲体系中与胶体金溶液混合，进行诱导组装反应。
51.本发明中，缓冲体系的作用是为ag
+
焊接法的反应体系提供缓冲环境，以确保鱼精dna在溶液中具有很好的溶解性，并且能够和金纳米表面产生较好的吸附作用。任意本领域中能够起到上述作用的缓冲液均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述缓冲体系包括tbe缓冲液，优选浓度为0.3
×‑1×
。
52.本发明中，鱼精dna的作用是能够快速终止金纳米颗粒的聚集，并吸附在聚集后的纳米结构表面以保证其胶体稳定性，便于后续的分离和应用。本发明对于步骤(1)中鱼精dna的用量没有特别限定，只要能够达到上述目的即可。根据本发明的一些优选实施方式，所述鱼精dna的用量使得其在反应体系中的终浓度为1-5μg/μl。优选为1-3μg/μl。
53.本发明中，ag
+
溶液的作用在于为反应体系提供ag
+
，从而促使纳米金颗粒组装成金纳米二聚体。任意能够提供ag
+
，且对于反应没有不利影响的试剂的水溶液均可适用于本发明提供的方法中。优选地，所述ag
+
溶液可以为硝酸银的水溶液。
54.为了提高制备金纳米二聚体的产率，更优选地，所述ag
+
溶液的用量使得ag
+
在反应体系中的终浓度为10-20mm。
55.更优选地，所述胶体金溶液的用量使得纳米金颗粒在反应体系中的终浓度不低于30nm。优选为30-50nm。
56.本发明的发明人在研究中还发现，构成金纳米二聚体的纳米金颗粒的粒径对于二聚体的胶体稳定性和sers信号增强能力等具有重要影响。而且，构成金纳米二聚体的两个纳米金颗粒的粒径比还会影响金纳米二聚体的分离纯化效果。因此，选择粒径合适且粒径分布较为均一胶体金溶液进行金纳米二聚体的制备对于获得灵敏度高、准确度高且稳定性高的拉曼免疫探针十分重要。
57.优选地，所述胶体金溶液中，粒径不超过30nm的纳米金颗粒占纳米金颗粒总量的90％以上，优选粒径20-25nm的纳米金颗粒占纳米金颗粒总量的80％以上。
58.本发明提供的方法中，步骤(1)中可以采用将一定浓度的各组分储液混合后，再额外添加水(例如无菌水、去离子水、超纯水等)的方式对反应体系中各组分的终浓度进行调节，也可以按照所需反应体系的总体积先计算各组分的用量，并将其配制成适当浓度的溶液后直接混合。
59.为了避免加样过程中混匀程度的细微差别对组装效果产生的不良影响，根据本发明的一种优选实施方式，其中，步骤(1)中采用分步混合的方式将反应体系所用的试剂进行混合。优选先将鱼精dna、缓冲体系(如tbe缓冲液等)和ag
+
溶液进行第一混合，然后再将第一混合产物与胶体金溶液进行第二混合，获得混合后的反应体系。为使反应体系中的各组分充分混匀，优选所述第一混合和第二混合均在剧烈搅拌的条件下进行。
60.优选地，所述第一混合的条件包括：温度20-30℃，搅拌转速1500-2500rpm，时间10-40s。
61.优选地，所述第二混合的条件包括：温度20-30℃，搅拌转速1500-2500rpm，时间10-40s。
62.为了使得反应体系充分混匀，优选第二混合的时间略长于第一混合(例如在第一混合的时间基础上延长10-20s)。
63.根据本发明的优选实施方式，其中，所述诱导组装反应的方式包括：将混匀后的反应体系于20-30℃下静置40-80min。
64.优选地，步骤(1)中还包括对诱导组装反应的产物中的金纳米二聚体进行纯化的操作。优选所述纯化包括采用凝胶电泳法筛选均一的金纳米二聚体，并对所述均一的金纳米二聚体进行回收。
65.具体地，对金纳米二聚体进行纯化的方式可以包括采用琼脂糖凝胶(0.8-1.5重量％)对反应产物进行电泳，然后将带有金纳米二聚体条带的凝胶块切下后粉碎，再将粉碎后的凝胶浸泡于tbe缓冲液中10-20h。浸泡结束后进行离心，获得的沉淀即为纯化后的金纳米二聚体。通常，可以采用直接观察采用tbe缓冲液重悬的金纳米二聚体悬液的颜色、采用紫外分光光度仪扫描金纳米二聚体悬液的紫外吸收图谱以及采用透射电镜观察金纳米二
聚体的颗粒大小和均一性等方式来确定纯化后的金纳米二聚体的质量和均一性。
66.本发明中，步骤(2)的目的在于将具有sers特征信号峰的信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1修饰在金纳米二聚体表面，从而形成拉曼免疫标签。
67.任意本领域能够将信号标记分子和抗体ab1修饰在金纳米二聚体表面的方式均可适用于本发明，本发明中对于具体的修饰方式、条件和顺序等没有特别限制。为了使信号标记分子和抗体ab1能够更紧密地结合在金纳米二聚体的表面，根据本发明的一种优选实施方式，其中，步骤(2)包括先将信号标记分子与金纳米二聚体进行第一接触，获得金纳米二聚体-信号标记分子，再将特异性结合目标检测物的抗体ab1与金纳米二聚体-信号标记分子进行第二接触，获得金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物。
68.本发明的发明人在研究的过程中还发现，第一接触的反应体系中信号标记分子的浓度对于拉曼免疫探针的制备十分关键。若浓度过低，则会导致拉曼免疫标签的检测信号差，灵敏度下降，若浓度过高则会导致金纳米二聚体发生沉聚或团聚。
69.优选地，第一接触的反应体系中，信号标记分子的终浓度为5-15μm。优选为5-10μm。
70.优选地，第一接触的反应体系中，金纳米二聚体的终浓度为30-50nm。
71.更优选地，第一接触的反应体系中，信号标记分子与金纳米二聚体的终浓度比为3000-5000∶1。
72.为了使得第一接触体系反应充分，优选地，所述第一接触的条件包括：温度20-30℃，时间1-5h。优选在1000-1500rpm的振荡条件下进行第一接触，以使信号标记分子能够更均匀地结合在反应体系中的各个金纳米二聚体上。
73.优选地，第二接触的反应体系中，特异性结合目标检测物的抗体ab1的终浓度为1-10μg/ml。
74.优选地，第二接触的反应体系中，金纳米二聚体-信号标记分子的终浓度为0.5-2nm。
75.更优选地，相对于1nm的金纳米二聚体-信号标记分子，特异性结合目标检测物的抗体ab1的用量为2-20μg/ml。
76.优选地，所述第二接触的条件包括：温度20-30℃，时间1-5h。优选在1000-1500rpm的振荡条件下进行第二接触，以使得信号标记分子能够更均匀地结合在反应体系中的各个金纳米二聚体上。
77.为了提高抗体ab1修饰到金纳米二聚体表面的结合率，优选地，步骤(2)中，在将特异性结合目标检测物的抗体ab1与金纳米二聚体-信号标记分子进行第二接触之前，先采用edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)对金纳米二聚体-信号标记分子进行免疫偶联活化，获得活化的金纳米二聚体-信号标记分子，然后再将活化的金纳米二聚体-信号标记分子与特异性结合目标检测物的抗体ab1进行所述第二接触。
78.更优选地，所述免疫偶联活化的反应体系中，edc的终浓度为20-30μm，nhs的终浓度为20-30μm，优选edc和nhs的终浓度比为1∶0.8-1.2。
79.更优选地，免疫偶联活化的反应体系中，金纳米二聚体-信号标记分子的终浓度为0.5-3μm。优选相对于1nm的金纳米二聚体-信号标记分子，edc的用量为20-30μm。
80.根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括步骤(3)拉曼探针封闭。
81.步骤(3)的目的在于避免拉曼免疫探针在试纸条上的非特异性吸附干扰测定结果。本发明中对于具体的封闭方式或条件等没有特别限制，任意本领域能够实现上述目的的封闭方式均可适用于本发明。
82.优选地，步骤(3)包括将金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物与封闭剂进行第三接触。
83.优选地，第三接触的反应体系中，封闭剂(优选为bsa)的终浓度为0.5-1.5重量％。
84.优选地，第三接触的反应体系中，金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物的终浓度为0.5-2nm。
85.优选地，相对于1nm的金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物，封闭剂的用量为0.5-1.5重量％。
86.本发明进一步提供第一方面所述的拉曼免疫探针，或者第二方面所述的方法制备的拉曼免疫探针在检测样品中目标检测物中的应用，尤其是对病原体等对于检测速度、灵敏度和精准度等方面具有较高要求的目标检测物的检测中的应用。
87.本发明中，对于上述应用的具体形式没有特别限制，本领域中任意能够通过拉曼光谱-免疫偶联的方法实现样品中目标检测物的(定性和/或定量)检测的方式均可适用于本发明。例如可以直接将本发明提供的拉曼免疫探针与样品接触，并对其进行拉曼光谱检测和免疫检测(例如酶联免疫检测等)，还可以将本发明提供的拉曼免疫探针制成表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸进行检测。
88.本发明第三方面提供一种表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸，所述试纸包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区，其中，所述结合物区包括结合垫，所述结合垫包含拉曼免疫探针，所述拉曼免疫探针为第一方面所述的拉曼免疫探针或根据第二方面所述的方法制备获得的拉曼免疫探针。
89.本发明中，对于将拉曼免疫探针固定在结合垫上的具体方式没有特别限制，任意本领域常用于制备免疫层析试纸结合垫的方式均可适用于本发明。例如，可以浸渍法制备结合垫，也即，将拉曼免疫探针分散在缓冲液(例如teb缓冲液等)中，制成一定浓度的分散液，然后将结合垫所用的材料(例如硝酸纤维素膜等)浸渍于该分散液中一段时间后取出烘干。又例如，还可以采用喷涂法制备结合垫，也即，将拉曼免疫探针分散液采用喷涂法直接喷涂在结合垫所用材料表面。
90.优选地，采用浸渍法进行结合垫制备时，采用的拉曼免疫探针分散液中拉曼免疫探针的浓度为0.5-2nm。
91.优选地，采用喷涂法进行结合垫制备时，采用的拉曼免疫探针分散液中拉曼免疫探针的浓度为0.5-2nm。
92.根据本发明的优选实施方式，其中，所述加样区包括样品垫。优选所述样品垫采用玻璃纤维膜和/或聚酯纤维膜制成。
93.根据本发明的优选实施方式，其中，所述观测区包括层析膜，所述层析膜上固定有检测线(t线)和控制线(c线)，其中，检测线包被有特异性结合目标检测物的抗体ab1，控制线包被有特异性结合抗体ab1的抗体ab2。优选所述层析膜采用硝酸纤维素膜制成。更优选采用hf0135、hf180(milipore生产)和cn140(sartorius生产)中的至少一种型号的硝酸纤维
素膜。
94.本发明中，对于将t线和c线所用抗体固定在层析膜上的具体方式和条件没有特别限制，任意本领域用于制备免疫层析试纸时采用的固定t线和c线的方式均可适用于本发明。例如可以采用喷涂法分别将一定浓度的抗体ab1溶液和抗体ab2溶液喷涂至层析膜表面，形成t线和c线。
95.优选地，所述抗体ab1溶液的浓度不低于0.25mg/ml。优选为0.5-1mg/ml。
96.优选地，所述抗体ab2溶液的浓度不低于0.25mg/ml。优选为0.25-1mg/ml。
97.根据本发明的优选实施方式，其中，所述吸水区包括吸水纸。
98.优选地，所述吸水纸克重90-150g/m2，厚度0.35-0.60mm，水爬速3-5cm/s，蓄水量400-600g/m2。
99.为了方便携带和储存，优选地，所述表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸还包括外壳，所述外壳在加样区位置设置有加样孔，在观测区位置设置有观测窗，观测窗的尺寸使得t线和c线能够通过该观测窗被完整地观测到(即加入含有目标检测物的阳性样品时，能够通过观测窗同时观测到t线和c线)。
100.本发明第四方面提供第一方面所述的拉曼免疫探针，或者根据第二方面所述的方法制备获得的拉曼免疫探针，或者第三方面所述的表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸在样品中的病原体检测(优选现场检测)中的应用。尤其是在样品中的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。
101.本发明进一步提供一种检测样品中猪流行性腹泻病毒(pedv)的方法(检测流程和原理可参考图10)，所述方法包括采用第三方面所述的表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸对样品进行检测。
102.具体地，所述方法可以包括以下步骤：
103.(a)将样品配制成样品溶液，然后将该样品溶液加入到所述的表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸的加样孔中；
104.(b)加入样品溶液后至少将试纸静置10min，然后对检测结果进行定性和/或定量分析。
105.优选地，步骤(a)中，所述样品溶液中，pedv的浓度不低于1tcid
50
/ml。优选不低于100tcid
50
/ml。更优选为1
×
10
2-1
×
106tcid
50
/ml。1
×
10ntcid
50
/ml是指1毫升病毒溶液稀释1
×
10n倍后恰好能够致半数的细胞感染。
106.优选地，加入到加样孔中的样品溶液的量优选为40-80μl。
107.优选地，步骤(b)中所述静置的时间为10-20min。
108.优选地，步骤(b)中采用直接观察试纸t线和c线显色情况的方式对样品进行定性分析。优选所述定性分析的方式包括：当t线和c线均显色，说明样品中含有目标检测物(阳性样品)；当c线未显色，无论t线是否显色，均视为无效检测；当t线未显色，仅c线显色，说明样品中不含目标检测物(阴性样品)，或目标检测物含量过低，无法检出。
109.优选地，步骤(b)中采用对t线区域进行拉曼光谱检测的方式对样品进行定量分析。优选在t线区域随机选择3-10个点进行拉曼光谱分析，取平均值。
110.由于本发明提供的sers-免疫层析试纸的定性检测的检测限高于定量检测的检测限，因此，当出现t线未显色，但c线显色的情况，可以采用以下方式进行进一步检测以确定
样品中是否含有目标检测物：
111.(i)对试纸进行定量检测，也即，对t线区域进行拉曼光谱检测；
112.(ii)提高样品溶液浓度后重新进行定性检测(如有必要，在此基础上可再进行定量检测)。
113.若进一步检测仍显示阴性结果，即可以判定为阴性样品。
114.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
115.以下实施例中，鼠抗pedv抗体(ab1)购自北京金诺百泰生物技术有限公司，牌号为jn1401，山羊抗鼠抗pedv抗体的抗体(ab2)购自北京索莱宝科技有限公司，牌号为spa131。未做特殊说明的情况下，采用的其他试剂均为购自正规化学或生物试剂供应商的商购产品，纯度为分析纯。
116.以下实施例中采用的样品稀释液的成分为：bb缓冲液(ph＝8)添加1体积％tween-20。
117.制备例1
118.本制备例用于说明本发明提供的拉曼免疫标签的制备。
119.(1)金纳米二聚体的组装
120.在试管中放入转子，将试管处于高速旋转的状态下(约1500rpm)，依次加入50μl超纯水、100μl tbe缓冲液(1
×
)、400μl浓度为5μg/μl的fsdna溶液和150μl浓度为100mm的agno3溶液，快速混合20s后，加入300μl胶体金溶液(采用柠檬酸三钠法制备，浓度为30nm，其中粒径≤30μm的纳米金颗粒占比约为90％，粒径为20-25μm的纳米金颗粒占比约为80％)，混匀30s，停止搅拌，静置1h等待反应。
121.反应结束后，在剧烈旋转的状态下(约1500rpm)加入25μl的75％甘油混匀。在电泳仪里调节电压120v，时间设置为60min，在1％琼脂糖凝胶中运行结束后将带有二聚体条带胶块切下并切碎，用tbe缓冲液过夜浸泡后(tbe缓冲液用量使其完全没过胶块碎末即可)，分装至离心管中，5000rpm/min，离心15min，弃上清液后，用少量tbe缓冲液重悬，制成浓度约为1nm的金纳米二聚体悬液。
122.观察金纳米二聚体悬液的颜色，利用紫外分光光度计扫描紫外吸收图谱，采用透射电镜观察其中金纳米二聚体的均一性和颗粒大小，判断制备的金纳米二聚体的质量水平。结果详见图1。
123.图1-a中示出了琼脂糖凝胶电泳的结果，从图中可以看出，金纳米二聚体的条带分明，无拖带模糊等现象，说明金纳米二聚体无团聚且分布均匀。
124.图1-b中示出了纯化后的金纳米二聚体悬液，从图中可以看出，该金纳米二聚体悬液呈浅紫色，清澈透明无杂质，说明纯化成功。
125.图1-c中示出了金纳米二聚体悬液的紫外吸收光谱图，从图中可以看出该金纳米二聚体较为稳定。
126.图1-d中示出了金纳米二聚体的透射电镜图，从图中可以看出，金纳米二聚体的形状均匀，大小一致，分布均匀。
127.通过以上图片内容可以看出，采用上述方法制备的金纳米二聚体的质量较高。
128.(2)信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1的修饰。
129.取1ml金纳米二聚体悬液于透明干净玻璃瓶中，加入20μl一定浓度的4-mba溶液，室温下混匀后1000rpm振荡反应3h。反应结束后4000rpm离心15min，弃上清，再用1ml超纯水重悬沉淀。获得金纳米二聚体-4-mba悬液。
130.在金纳米二聚体-4-mba悬液中加入2.5μl浓度10mm的edc溶液与2.5μl浓度10mm的nhs溶液，混匀后静置反应15min。反应结束后4000rpm离心15min，弃上清，再用1ml超纯水重悬。获得活化的金纳米二聚体-4-mba悬液。
131.在活化的金纳米二聚体-4-mba悬液中加入5μl浓度1mg/ml的鼠抗pedv抗体(ab1)，混匀后1000rpm振荡反应2h。反应结束后4000rpm离心15min，弃上清，用1ml超纯水重悬。获得金纳米二聚体-4-mba-ab1悬液。
132.在金纳米二聚体-4-mba-ab1悬液中加入100μl浓度10重量％的bsa溶液，混匀后1000rpm振荡封闭1h。获得拉曼免疫探针悬液。
133.制备例2
134.本制备例用于说明本发明提供的sers-免疫层析试纸的制备。
135.将nc膜、玻璃纤维膜和吸水纸裁切成矩形条状备用。
136.将一定浓度的ab1溶液采用喷涂法按照垂直于nc膜条长边的方向固定在nc膜上形成t线，再将一定浓度的ab2溶液也采用喷涂法以平行于t线的方向固定在nc膜条上形成c线，作为层析膜。喷涂时注意控制t线和c线的距离，使其能够通过外壳上预留的观测窗被同时观测到。
137.采用超纯水和制备例1中制得的拉曼探针配制成浓度约为1nm的拉曼探针悬液，采用喷涂法将拉曼探针悬液固定在一张新的矩形nc膜条上，作为结合垫。
138.sers-免疫层析试纸的组装：取塑料层析膜外壳，从下至上依次将吸水纸、结合垫、层析膜和样品垫(玻璃纤维膜)装入其中，调整膜条的位置，将外壳上预留的加样口位于样品垫位置，并使得t线和c线可同时在外壳上预留的观测窗位置观测到。
139.实施例1
140.本实施例用于说明本发明提供的sers-免疫层析试纸的拉曼信号强度优化。
141.(一)拉曼免疫探针的优化
142.配制不同浓度梯度的4-mba溶液，按照制备例1的方法制备拉曼免疫探针。4-mba溶液的浓度梯度设置为：2
×
10-4
m、4
×
10-4
m、6
×
10-4
m、8
×
10-4
m、10
×
10-4
m、12
×
10-4
m、14
×
10-4
m。
143.在制备过程中，分别将纯化后的金纳米二聚体悬液、金纳米二聚体-4-mba悬液、金纳米二聚体-4-mba-ab1悬液和拉曼免疫探针悬液进行紫外分光光谱检测。结果如图2-a所示(示出了4
×
10-4
m的4-mba溶液制备的拉曼免疫探针的紫外分光光谱图，其余浓度的4-mba制备的拉曼免疫探针的检测结果与之类似)。从图中可以看出，二聚体修饰信号分子mba后、连接pedv抗体后和加入bsa完成封闭制备成拉曼信号分子后与原二聚体的紫外吸收曲线相比，有明显的红移现象，证明信号分子和抗体都成功修饰到了二聚体上。
144.将拉曼免疫探针悬液的浓度均调整至1nm后，对其进行拉曼光谱检测。结果如图2-b和图2-c所示。从图2-c中可以看出，采用不同浓度的4-mba溶液制备的拉曼免疫探针的拉曼信号强度有所不同，其中4-mba溶液浓度为4
×
10-4
m(对应反应体系中的终浓度为7.84μm)时的信号最强，之后随着4-mba溶液浓度的提高，信号逐渐减弱，当采用的4-mba溶液浓度达
到12
×
10-4
m后，信号强度急剧下降，说明在4-mba溶液的浓度超过4
×
10-4
m之后，金纳米二聚体开始发生团聚现象，并且随着浓度的提高，团聚情况愈发严重。这一点从图2-b中也得到了证实，图中630nm处的耦合峰的大幅降低同样说明了金纳米二聚体发生团聚。
145.(二)t线中包被的ab1的浓度优化
146.采用浓度为4
×
10-4
m的4-mba溶液，按照制备例1的方法制备的拉曼免疫探针，按照制备例2的方法制成sers-免疫层析试纸。试纸制备过程中，配制不同浓度梯度的ab1溶液，并利用这些ab1溶液包被t线，获得不同抗体浓度的sers-免疫层析试纸。ab1溶液的浓度设置为0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml。
147.采用样品稀释液将pedv配制成载毒量1
×
102tcid
50
/ml的pedv阳性样品液。
148.每种抗体浓度的sers-免疫层析试纸各取2条，分别标记为实验组和对照组。其中实验组试纸加样口中滴加60μl pedv阳性样品液，对照组试纸加样口中滴加60μl样品稀释液。
149.静置15min，观察各试纸的t线显色情况，并分别对各试纸的t线区域进行拉曼光谱检测(采用卓立汉光公司rts2型号的拉曼光谱仪，每个试纸在t线区域选取5个点进行检测，各检测点之间的间距为100μm，取平均值)，检测条件包括激发时间5000ms，激发功率50％。结果详见图3。
150.图3-a至图3-c中分别示出了实验组试纸t线显色情况、拉曼信号强度以及拉曼光谱曲线。从中可以看出，t线包被的抗体ab1浓度为0.25mg/ml时显色较浅，其他三个浓度的显色情况则较为类似。拉曼信号强度也显示出类似的结果。但是不论t线包被的抗体ab1浓度如何变化，其在拉曼光谱中均显示出了在1586cm-1
位移处的特征峰。
151.图3-d至图3-f分别示出了对照组试纸t线显色情况、拉曼信号强度以及拉曼光谱曲线。从图中可以看出不同包被浓度的t线试纸阴性结果良好，无论是t线显色还是拉曼图谱检测均未出现假阳现象。
152.实施例2
153.本实施例用于说明本发明提供的sers-免疫层析试纸的灵敏度、特异性、重复性和稳定性等特性的检测。
154.本实施例中使用的试纸为采用浓度为4
×
10-4
m的4-mba溶液，按照制备例1的方法制备的拉曼免疫探针，然后按照制备例2的方法制成sers-免疫层析试纸，其中包被t线所使用的ab1溶液的浓度为0.5mg/ml。
155.(一)灵敏度检测
156.用样品稀释液配制pedv载毒量为1
×
106tcid
50
/ml、1
×
105tcid
50
/ml、1
×
104tcid
50
/ml、1
×
103tcid
50
/ml、1
×
102tcid
50
/ml、1
×
101tcid
50
/ml和1
×
100tcid
50
/ml、1
×
10-1
tcid
50
/ml的阳性样品液标准品。
157.按照实施例1中试验(二)的方法分别对上述不同载毒量的pedv阳性样品液标准品进行定性和定量检测。结果详见图4。
158.图4-a中由左至右依次示出了浓度由高到低的阳性样品液标准品的定性检测中t线的显色情况。从图中可以看出，随着阳性样品液标准品中pedv载毒量的降低，t线的颜色逐渐变浅，定性检测的检测限为1
×
102tcid
50
/ml(5号试纸，在其之后的试纸t线均未显色)。
159.图4-b中示出了对图4-a中各试纸中t线区域进行定量检测时的拉曼光谱图。从图
中可以看出，定量检测的检测限为1
×
100tcid
50
/ml，且4-mba的特征信号峰(1586cm-1
位移处)的信号强度随着阳性样品液标准品中pedv载毒量的提高而逐渐上升。
160.图4-c中示出了根据图4-b中1586cm-1
位移处信号强度和阳性样品液标准品浓度绘制的线性拟合图。从图中可以看出，4-mba特征信号峰的信号强度与阳性样品液标准品中pedv载毒量呈较好的线性关系，线性方程为y＝3560.0098x+1843.52691，r2＝0.9916。
161.(二)特异性检测
162.按照实施例1中试验(二)中的方法，分别采用sers-免疫层析试纸对样品稀释液(阴性对照，编号1)、轮状病毒液(编号2)、猪圆环病毒液(编号3)、伪狂犬病毒液(编号4)、传染性胃肠炎病毒液(编号5)、金黄色葡萄球菌液(编号6)、鼠伤寒沙门氏菌液(编号7)、溶藻弧菌液(编号8)、肠炎沙门氏菌液(编号9)、副溶血弧菌液(编号10)、大肠杆菌液(编号11)和猪流行性腹泻病毒液(编号12)进行定性和定量检测。其中病毒液和菌液均采用样品稀释液配制，病毒液的载毒量均为1
×
103tcid
50
/ml，菌液的浓度为1
×
103tcid
50
/ml。结果详见图5。
163.图5-a中由左至右依次示出了sers-免疫层析试纸对上述病毒或细菌稀释液的定性检测结果。从图中可以看出，除最右端检测猪流行性腹泻病毒液的试纸外，其他试纸的t线均未显色。
164.图5-b中由下至上依次示出了sers-免疫层析试纸对上述病毒或细菌稀释液的定量检测结果。从图中可以看出，除12号曲线外，其余样品的检测图谱中均未出现4-mba的特征峰。
165.图5-c中示出了各样品拉曼光谱中在1586cm-1
位移处的信号强度。从图中可以看出，除12号样品外，阴性对照和其他样品均未显示出假阳性的情况。
166.(三)重复性检测
167.(1)批内重复性
168.从同一批次试纸中随机抽取12条，将其分为两组，实验组和对照组各选取6条。采用实施例1中试验(二)中的方法，分别对载毒量为1
×
104tcid
50
/ml的pedv阳性样品液(实验组)和未添加pedv的样品稀释液(对照组)进行检测。结果详见图6。
169.图6-a至6-c为实验组检测结果。其中，图6-a示出了实验组6条试纸的t线显色情况，从图中可以看出，其显色较为一致。图6-b示出了实验组每条试纸重复检测三次的拉曼图谱(y轴上的编号1-3对应实验组中的t-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，不论是同一试纸的重复检测图谱，还是不同试纸的检测图谱，其拉曼图谱中的峰位置和信号强度均显示出较高的一致性。图6-c示出了实验组每条试纸上五个检测点的拉曼检测图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度(x轴上的编号1-5对应实验组中的t-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，其标准偏差仅为3.34％，而且每个试纸的不同检测点获得的信号强度也较为一致。
170.图6-d至6-f为对照组检测结果。其中图6-d为对照组6条试纸的t线显色情况，从图中可以看出，对照组试纸的t线均未显色。图6-e为对照组每条试纸重复检测三次的拉曼图谱(y轴上的编号1-3对应对照组中的d-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，对照组试纸的拉曼检测图谱均未显示出4-mba的特征峰。图6-f为对照组每条试纸上五个检测点的拉曼检测图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度(x轴上的编号1-5对应对照组中的d-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，每个试纸的不同检测点在1586cm-1
位移处均未显示出明显的
信号。
171.以上结果说明，本发明提供的sers-免疫层析试纸的批内重复性较好。
172.(2)批间重复性
173.从三个批次试纸中各随机抽取4条试纸，将其分为四组，每组中分别为三条来自不同批次的试纸。采用实施例1中试验(二)中的方法，分别对载毒量为1
×
104tcid
50
/ml的pedv阳性样品液(实验组i)、载毒量为1
×
102tcid
50
/ml的pedv阳性样品液(实验组ii)和未添加pedv的样品稀释液(对照组i和对照组ii)进行检测。结果详见图7和图8。
174.图7-a至7-c为实验组检测结果。其中，图7-a示出了实验组i中3条试纸的t线显色情况，从图中可以看出，其显色较为一致。图7-b示出了实验组i中每条试纸重复检测五次的拉曼图谱(y轴上的编号1-5对应实验组i中的t-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，不论是同一试纸的重复检测图谱，还是不同试纸的检测图谱，其拉曼图谱中的峰位置和信号强度均显示出较高的一致性。图7-c示出了实验组i中每条试纸上五个检测点的拉曼检测图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度(x轴上的编号1-5对应实验组i中的t-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，其标准偏差仅为6.39％，而且每个试纸的不同检测点获得的信号强度也较为一致。
175.图7-d至7-f为对照组i检测结果。其中图7-d为对照组i中3条试纸的t线显色情况，从图中可以看出，对照组i的试纸t线均未显色。图7-e为对照组i每条试纸重复检测五次的拉曼图谱(y轴上的编号1-5对应对照组i中的d-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，对照组i试纸的拉曼检测图谱均未显示出4-mba的特征峰。图7-f为对照组i每条试纸上五个检测点的拉曼检测图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度(x轴上的编号1-5对应对照组i中的d-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，每个试纸的不同检测点在1586cm-1
位移处均未显示出明显的信号。
176.图8-a至8-c为实验组ii检测结果。其中，图8-a示出了实验组ii中3条试纸的t线显色情况，从图中可以看出，其显色较为一致。图8-b示出了实验组ii中每条试纸重复检测五次的拉曼图谱(y轴上的编号1-5对应实验组ii中的t-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，不论是同一试纸的重复检测图谱，还是不同试纸的检测图谱，其拉曼图谱中的峰位置和信号强度均显示出较高的一致性。图8-c示出了实验组ii中每条试纸上五个检测点的拉曼检测图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度(x轴上的编号1-5对应实验组ii中的t-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，其标准偏差仅为5.27％，而且每个试纸的不同检测点获得的信号强度也较为一致。
177.图8-d至8-f为对照组i检测结果。其中图8-d为对照组ii中3条试纸的t线显色情况，从图中可以看出，对照组ii的试纸t线均未显色。图8-e为对照组ii每条试纸重复检测五次的拉曼图谱(y轴上的编号1-5对应对照组ii中的d-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，对照组ii试纸的拉曼检测图谱均未显示出4-mba的特征峰。图8-f为对照组ii每条试纸上五个检测点的拉曼检测图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度(x轴上的编号1-5对应对照组ii中的d-1号试纸，依次类推)，从图中可以看出，每个试纸的不同检测点在1586cm-1
位移处均未显示出明显的信号。
178.以上结果说明，本发明提供的sers-免疫层析试纸的批内重复性较好。
179.(四)稳定性
180.取同批试纸12条，置于4℃下保存，分别于保存第1个月(30天)、第2个月(60天)、第3个月(90天)、第4个月(120天)、第5个月(150天)和第6个月(180天)各取出2条，其中1条用于检测载毒量为1
×
105tcid
50
/ml的pedv阳性样品液(实验组)，1条用于检测样品稀释液(对照组)。按照实施例1，试验(二)中的方法进行定性和定量检测。结果详见图9。
181.图9-a中从左至右依次示出了保存1-6个月后的实验组试纸t线显色情况，从图中可以看出各试纸的t线显色情况较为一致。图9-b为保存1-6个月后的实验组试纸定量检测的拉曼图谱，从图中可以看出，各试纸均显示出4-mba的特征峰，且信号强度较为一致。图9-c为实验组各试纸拉曼图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度，从图中可以看出，不同保存时间试纸的检测信号强度标准偏差仅为1.18％，说明随着保存时间的延长，拉曼信号强度并未出现明显变化。
182.图9-d中从左至右依次示出了保存1-6个月后的对照组试纸t线显色情况，从图中可以看出各试纸的t线均未显色。图9-e为保存1-6个月后的对照组试纸定量检测的拉曼图谱，从图中可以看出，各试纸均未显示出4-mba的特征峰。图9-f为对照组各试纸拉曼图谱中1586cm-1
位移处的拉曼信号强度，从图中可以看出，不同保存时间试纸均未出现假阳性结果，说明随着保存时间的延长，试纸的阴性检测结果较好，并未出现明显变化。
183.以上结果说明了本发明提供的sers-免疫层析试纸具有极高灵敏度，且定量检测的灵敏度高于定性检测，该试纸还具有较好的特异性，无论批内还是批间，该试纸都显示出优秀的重复性。另外，该试纸还具有极高的稳定性，在4℃下保存6个月其t线显色情况和拉曼检测信号强度仍能保持原有水平。
184.实施例3
185.本实施例用于说明本发明提供的sers-免疫层析试纸在实际样品检测中的效果。
186.本实施例中使用的试纸为采用浓度为4
×
10-4
m的4-mba溶液，按照制备例1的方法制备的拉曼免疫探针，然后按照制备例2的方法制成sers-免疫层析试纸，其中包被t线所使用的ab2溶液的浓度为0.5mg/ml。
187.取七个试管，分别加入1g新鲜健康猪粪便，以log[tcid
50
/ml]为单位计算pedv病毒的添加量，依次在试管中加入0(阴性对照，仅加入样品稀释液)、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5个单位的pedv后混匀，作为模拟阳性样品用sers-免疫层析试纸条进行定量检测，检测方法同实施例1中的试验(二)。具体pedv阳性样品液添加量以及检测结果详见表1。
[0188]
表1模拟阳性样品中pedv添加量以及检测结果
[0189][0190]
从表1中的数据可以看出，本发明提供的sers-免疫层析试纸对实际样品进行检测时具有极高的准确性，能够满足pedv现场检测快速、准确获得检测结果的需要。
[0191]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种拉曼免疫探针，其特征在于，所述拉曼免疫探针包括金纳米二聚体，以及修饰在所述金纳米二聚体上的信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1。2.根据权利要求1所述的拉曼免疫探针，其中，所述金纳米二聚体由两个粒径不超过30nm的纳米金颗粒组装形成，间距不超过1nm；优选地，所述金纳米二聚体由两个粒径20-25nm的纳米金颗粒组装形成；和/或，所述信号标记分子选自4-硝基苯硫醇、4-巯基吡啶、4-巯基苯甲腈和4-巯基苯甲酸中的任意一种；和/或，所述拉曼免疫探针还包括和封闭剂。3.权利要求1或2所述的拉曼免疫探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括：(1)金纳米二聚体的组装；(2)信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体ab1的修饰。4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(1)中，采用ag
+
焊接法进行金纳米二聚体的组装；优选地，步骤(1)包括：将鱼精dna、ag
+
溶液在缓冲体系中与胶体金溶液混合，进行诱导组装反应；更优选地，所述缓冲体系包括tbe缓冲液，优选浓度为0.3
×‑1×
；更优选地，所述鱼精dna的用量使得其在反应体系中的终浓度为1-5μg/μl；更优选地，所述ag
+
溶液的用量使得ag
+
在反应体系中的终浓度为10-20mm；更优选地，所述胶体金溶液的用量使得纳米金颗粒在反应体系中的终浓度不低于30nm，优选为30-50nm；更优选地，所述胶体金溶液中，粒径不超过30nm的纳米金颗粒占纳米金颗粒总量的90％以上，优选粒径20-25nm的纳米金颗粒占纳米金颗粒总量的80％以上；更优选地，所述诱导组装反应的方式包括：将混匀后的反应体系于20-30℃下静置40-80min；优选地，步骤(1)中还包括对诱导组装反应的产物中的金纳米二聚体进行纯化的操作，优选所述纯化包括采用凝胶电泳法筛选均一的金纳米二聚体，并对所述均一的金纳米二聚体进行回收。5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(2)包括先将信号标记分子与金纳米二聚体进行第一接触，获得金纳米二聚体-信号标记分子，再将特异性结合目标检测物的抗体ab1与金纳米二聚体-信号标记分子进行第二接触，获得金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物；优选地，第一接触的反应体系中，信号标记分子的终浓度为5-15μm；优选地，第一接触的反应体系中，金纳米二聚体的终浓度为1-5nm，优选信号标记分子与金纳米二聚体的终浓度比为3000:1-5000:1；优选地，所述第一接触的条件包括：温度20-30℃，时间1-5h，优选在1000-1500rpm的振荡条件下进行第一接触；优选地，第二接触的反应体系中，特异性结合目标检测物的抗体ab1的终浓度为1-10μg/ml；优选地，第二接触的反应体系中，金纳米二聚体-信号标记分子的终浓度为1-5nm，优选
相对于1nm的金纳米二聚体-信号标记分子，特异性结合目标检测物的抗体ab1的用量为200-2000μg/ml；优选地，所述第二接触的条件包括：温度20-30℃，时间1-5h，优选在1000-1500rpm的振荡条件下进行第二接触；优选地，步骤(2)中，在将特异性结合目标检测物的抗体ab1与金纳米二聚体-信号标记分子进行第二接触之前，先采用edc和nhs对金纳米二聚体-信号标记分子进行免疫偶联活化，获得活化的金纳米二聚体-信号标记分子，然后再将活化的金纳米二聚体-信号标记分子与特异性结合目标检测物的抗体ab1进行所述第二接触；更优选地，所述免疫偶联活化的反应体系中，edc的终浓度为20-30μm，nhs的终浓度为20-30μm，优选edc和nhs的终浓度比为1:0.8-1:1.2；更优选地，免疫偶联活化的反应体系中，金纳米二聚体-信号标记分子的终浓度为0.5-3nm，优选相对于1nm的金纳米二聚体-信号标记分子，edc的用量为20-30μm。6.根据权利要求3-5中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括步骤(3)拉曼探针封闭；优选地，步骤(3)包括将金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物与封闭剂进行第三接触；优选地，第三接触的反应体系中，封闭剂的终浓度为0.5-1.5重量％；优选地，第三接触的反应体系中，金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物的终浓度为0.5-2nm；优选地，相对于1nm的金纳米二聚体-信号标记分子-抗体ab1结合物，封闭剂的用量为0.5-1.5重量％。7.一种表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸，所述试纸包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区，其中，所述结合物区包括结合垫，其特征在于，所述结合垫包含拉曼免疫探针，所述拉曼免疫探针为权利要求1或2所述的拉曼免疫探针或根据权利要求3-7中任意一项所述的方法制备获得的拉曼免疫探针。8.根据权利要求7所述的表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸，其中，所述结合垫采用硝酸纤维素膜制成；和/或，所述加样区包括样品垫，优选所述样品垫采用玻璃纤维膜和/或聚酯纤维膜制成；和/或，所述观测区包括层析膜，所述层析膜上固定有检测线和控制线，其中，检测线包被有特异性结合目标检测物的抗体ab1，控制线包被有特异性结合抗体ab1的抗体ab2，优选所述层析膜采用硝酸纤维素膜制成；和/或，所述吸水区包括吸水纸，优选所述吸水纸克重90-150g/m2，厚度0.35-0.60mm，水爬速3-5cm/s，蓄水量400-600g/m2；优选地，所述表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析试纸还包括外壳，所述外壳在加样区位置设置有加样孔，在观测区位置设置有观测窗，观测窗的尺寸使得检测线和控制线能够通过该观测窗被完整地观测到。9.权利要求1或2所述的拉曼免疫探针，或者根据权利要求3-6中任意一项所述的方法制备获得的拉曼免疫探针，或者权利要求7或8所述的表面增强拉曼光谱-胶体金免疫层析
试纸在样品中的病原体检测中的应用，尤其是在样品中的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

技术总结
本发明涉及表面增强拉曼散射和免疫层析检测技术领域，公开了一种拉曼免疫探针和SERS-胶体金免疫层析试纸以及它们的应用。本发明提供的拉曼免疫探针具有极高的稳定性和灵敏度，基于该拉曼免疫探针制备的SERS-免疫层析试纸具有制备和使用方法简单，易于操作，能够实现对样品的高精准度和高准确性的现场定量检测，同时对于大型检测仪器、实验场地和人员的专业要求较低，适合在基层推广应用。适合在基层推广应用。适合在基层推广应用。


技术研发人员：王悦靓 严昊 郭隆华 陈海兰 姚媛媛 陈丽芬 林丙永
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2022.10.27
技术公布日：2023/7/26