用于检测玉米转化事件“浙瑞8”的核酸序列及其检测方法与流程

用于检测玉米转化事件“浙瑞8”的核酸序列及其检测方法
(一)技术领域
1.本发明涉及转基因玉米事件“浙瑞8”的核酸序列及其检测方法，具体的说，涉及一种抗虫耐除草剂转基因玉米事件“浙瑞8”和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件“浙瑞8”的核酸序列及其检测方法。
(二)

背景技术：

2.玉米是一种重要的粮食作物，是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物。但是在玉米种植过程中，害虫危害常常严重降低玉米产量和品质，增加玉米种植成本，严重影响玉米生产。防治玉米田间杂草也是玉米生产中一个重要的措施，利用除草剂控制杂草可以减少杂草对玉米生长的影响，稳定和提高玉米产量。通过基因工程方法将抗虫和耐除草剂性状导入到玉米中，获得抗虫耐除草剂的转基因玉米可以提高玉米生产效率，降低生产成本，减少杀虫剂的使用量。
3.转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。在遗传转化时，因为外源基因随机整合到植物染色体中，因此获得的转基因群体包含大量的独立转化事件，不同的独立转化事件外源基因插入的染色体位置不同，外源基因侧翼序列也不同，每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平、表达空间和时间模式上也存在明显的差异。外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达，从而对植物的农艺性状造成影响。因此，研发过程中需要筛选大量事件，并从中筛选出目标基因表达水平和表达模式能够满足生产应用需要的转化事件。筛选得到的理想转化事件可以通过杂交的常规育种方法，将转基因导入到商业种植的品种中。通过杂交方式产生的后代保持有原始转化事件的转基因特征。
4.对转化事件的特异性检测在转化事件的生产应用和法律法规监管上都有价值。常规的多核苷酸和蛋白检测的方法可以有效检测是否为转基因，但并不能区别不同的转化事件，特别是使用相同基因或相同转化载体产生的转化事件。只有针对插入基因和侧翼序列的检测才能够准确判断是否存在目标转基因事件。
(一)

技术实现要素：

5.本发明提供一种用于检测转基因玉米事件“浙瑞8”的核酸序列及其特异性检测方法，转基因玉米事件“浙瑞8”对玉米害虫具有良好的抗性，对草甘膦除草剂具有较好的耐受性，本发明所述核酸序列能够快速准确地鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件“浙瑞8”的dna分子。
6.本发明采用的技术方案：
7.本发明提供一种用于检测转基因玉米事件“浙瑞8”的核酸序列，所述核酸序列包括seq id no.1或其互补序列、和/或seq id no.2或其互补序列，所述核酸序列来自于转基因玉米事件“浙瑞8”，所述转基因玉米事件“浙瑞8”以种子形式保藏于中国典型培养物保藏
中心，保藏编号：cctcc no:p202202，保藏日期2022年1月11日，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。
8.seq id no.1
9.gaaaccggtccatgcttagacaac。
10.seq id no.2
11.aagttgtctaagcgtcaatttgtt。
12.进一步，优选所述核酸序列为seq id no.3或其互补序列、和/或seq id no.4或其互补序列。
13.seq id no.3
[0014][0015]
seq id no.4
[0016][0017]
更进一步，优选所述核酸序列为seq id no.5或其互补序列。
[0018]
所述seq id no.1或其互补序列为转基因玉米事件“浙瑞8”中在插入序列的5’末端位于插入接合部位的一个长度为24个核苷酸序列，所述seq id no.1或其互补序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组序列和插入序列5’端的dna序列，包含所述seq id no.1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件“浙瑞8”的存在。
[0019]
所述seq id no.2或其互补序列为转基因玉米事件“浙瑞8”中在插入序列的3’末端位于插入接合部位的一个长度为24个核苷酸序列，所述seq id no.2或其互补序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组序列和插入序列3’端的dna序列，包含所述seq id no.2或其
互补序列即可鉴定为转基因玉米事件“浙瑞8”的存在。
[0020]
所述seq id no.3或其互补序列为转基因玉米事件“浙瑞8”中在插入序列的5’末端位于插入接合区的一个长度为1300个核苷酸序列，1-877bp为插入位点侧翼玉米基因组dna序列，878-1300bp为插入核苷酸序列，包含所述seq id no.3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件“浙瑞8”的存在。
[0021]
所述seq id no.4或其互补序列为转基因玉米事件“浙瑞8”中在插入序列的3’末端位于插入接合区的一个长度为803bp的核苷酸序列，所述seq id no.4第1-300bp为插入基因核苷酸序列，301-803bp为玉米侧翼基因组核苷酸序列，包含所述seq id no.4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件“浙瑞8”的存在。
[0022]
所述seq id no.5或其互补序列为是转基因玉米事件“浙瑞8”特有的长度为12701个核苷酸的序列，具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述seq id no.5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件“浙瑞8”的存在。
[0023]
表1.seq id no.5包含的基因组和遗传元件
[0024]
元件/基因组长度(bp)位于seq id no.5上的位置5’基因组8771-877rb504878-1381actin启动子14211382-2803cry2ab19022804-470535s终止子2374706-4942pzmubi-120174943-6959cry1ab19506970-8919pepc终止子1978920-911635s改良启动子13099117-10425g10evo-epsps151810426-1194335s终止子19011944-12133lb6712132-121983’玉米基因组50312199-12701
[0025]
本发明提供了一种检测样品中转基因玉米事件“浙瑞8”的dna存在的方法，包括：(1)将待检测样品与引物对在核酸扩增反应液中接触；(2)进行核酸扩增反应；(3)检测扩增产物的存在；所述扩增产物包括seq id no.1或其互补序列、seq id no.2或其互补序列。
[0026]
优选的，所述扩增产物包括seq id no.3或其互补序列中至少12个连续的核苷酸、seq id no.4或其互补序列中至少12个连续的核苷酸。
[0027]
进一步地，扩增产物包括seq id no.6或其互补序列、和/或seq id no.7或其互补序列，即可鉴定为转基因玉米事件“浙瑞8”的存在。
[0028]
进一步地，所述引物对包含第一引物和第二引物，其中第一引物由seq id no.3的第1-877位核苷酸的序列或其互补序列的至少12个连续核苷酸组成，或者由seq id no.4的第1-300位核苷酸的序列或其互补序列的至少12个连续核苷酸组成，具体所述第一引物为seq id no.8所示或者seq id no.10所示；所述第二引物由seq id no.3的第878-1300位核苷酸的序列或其互补序列的至少12个连续核苷酸所组成，或者由seq id no.4的第301-803
位核苷酸的序列或其互补序列的至少12个连续核苷酸组成，具体地，所述第二引物为seq id no.9所示或seq id no.11所示。
[0029]
本发明还提供了一种保护玉米不受昆虫危害的方法，所述方法包括提供一种转基因玉米植物，取食所述转基因玉米的靶标昆虫被抑制进一步取食所述转基因玉米植物；所述转基因玉米植物基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含有seq id no.1、seq id no.5第2804-4705、seq id no.5第6970-8919位核酸序列、seq id no.2；所述靶昆虫包括对cry1ab和cry1ah产生抗性的玉米螟。其中seq id no.1还可以是seq id no.3，seq id no.2还可以是seq id no.4。
[0030]
本发明提供了一种提高玉米耐受草甘膦的方法，所述方法包含将含有有效剂量草甘膦除草剂施加到种植转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物对草甘膦具有耐受性；所述转基因玉米植物基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5中第10426-11943位核酸序列和seq id no.2；或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。其中，seq id no.1还可以是seq id no.3，seq id no.2还可以是seq id no.4。
[0031]
本发明提供了一种控制玉米田间杂草的方法，所述方法包括将草甘膦除草剂施加到种植转基因玉米的大田中，所述转基因玉米对草甘膦具有耐受性，玉米田间杂草被草甘膦杀灭；所述转基因玉米在其基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。
[0032]
本发明还提供了一种培育对昆虫具有抗性的玉米植物的方法，所述方法包括：种植玉米种子，所述玉米种子的基因组中包括特定区域的核酸序列；在玉米植株上接靶标昆虫，收获与其他不含有特定区域核酸序列的植株相比具有更好抗虫效果的植株；所述玉米种子的基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705、seq id no.5第6970-8919位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列为seq id no.5；取食所述转基因玉米植物的靶标昆虫被抑制进一步取食所述玉米植物。
[0033]
本发明还提供了一种培育对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物的方法，所述方法包括：种植转基因玉米，使所述玉米长成玉米植株，用草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，不受草甘膦损伤的植株；所述玉米种子的基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。
[0034]
本发明还提供了一种培育抗虫且耐草甘膦除草剂玉米植物的方法，所述方法包括：种植转基因玉米，喷施草甘膦除草剂，收获与其他不具有特定区域核酸序列的植株相比，具有更好耐草甘膦和抗虫效果的植株；所述转基因玉米种子的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列；所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705、第6970-8919位、第10426-11943位核酸序列和seq id no.2；或者所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.5。；具体所述方法包括：以抗虫耐草甘膦转基因玉米事件“浙瑞8”为第一亲本与缺少抗虫和耐草甘膦性状的第二亲本杂交，
产生杂交后代；对杂交后代喷施草甘膦；选择抗虫和耐草甘膦植株。
[0035]
本发明提供了一种产生对昆虫具有抗性的玉米植株的方法，所述方法包括：将转基因玉米植株，与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；选择与其他不具有特定区域核酸序列的植株相比，具有更好抗虫效果的植株；所述转基因玉米植株的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705、第6970-8919位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。
[0036]
本发明提供一种产生对草甘膦具有耐受性的玉米植株的方法，所述方法包括将转基因玉米植株，与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，不受草甘膦损伤的植株；所述转基因玉米植株的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。
[0037]
本发明提供一种产生对昆虫具有抗性且耐受草甘膦除草剂的玉米植株的方法，所述方法包括：将转基因玉米与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，抗虫且不受草甘膦损伤的植株；所述转基因玉米植株的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705位核酸序列、seq id no.5第6970-8919位核酸序列、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。
[0038]
本发明还提供了一种产生自转基因玉米事件“浙瑞8”的组合物，所述组合物为玉米粉、玉米面、玉米油、玉米穗、玉米淀粉；所述转基因玉米事件“浙瑞8”以种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心保藏编号：cctcc no:p202202。
[0039]
本发明还提供一种产生自转基因玉米事件“浙瑞8”的农产品或商品，所述农产品或商品包括玉米淀粉、玉米油、玉米穗丝、玉米面。
[0040]
本发明所述玉米是指玉蜀黍(zea mays)，包括与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。
[0041]
所述包含是指“包括但不限于”。所述植物包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。所述转基因植物源自本发明dna分子转化的并因此至少部分由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。
[0042]
本发明所述玉米转基因事件“浙瑞8”即为玉米植物“浙瑞8”，包括玉米转基因事件的植物和种子及植物细胞或其可再生部分，所述植物部分包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花絮、耳穗、叶和来自玉米植物“浙瑞8”的产物，如玉米粉、玉米面、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。
[0043]
本发明玉米转基因事件“浙瑞8”包含了一个dna构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件“浙瑞8”获得对昆虫的抗性和对草甘膦除草剂的耐受性。所述t-dna构建体包含三个串联的表达盒，第一个表达盒包含用于在植物中表达的合适启动子和
合适的终止子，所述启动子可操作地连接cry1ab和cry2ab两个杀虫蛋白的核苷酸序列，所述cry1ab蛋白主要对鳞翅目害虫具有抗性，所述cry2ab蛋白主要对玉米螟、桃蛀螟、黏虫和棉铃虫等玉米常见鳞翅目害虫具有抗性。第二个表达盒包含用于在植物中表达的合适的启动子和合适的终止子，所述启动子可操作地连接编码5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)的基因，所述epsps蛋白对草甘膦除草剂具有耐受性。所述启动子包括改良后的camv 35s启动子。所述终止子包括camv 35s终止子。
[0044]
所述dna构建体采用转化方法引入植物中，包括农杆菌介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。对应玉米转基因事件“浙瑞8”以种子(玉蜀黍属玉米zea mays l.)形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:p202202，保藏日期2022年1月11日，武汉大学保藏中心，邮编430072。
[0045]
seq id no.1转基因玉米事件“浙瑞8”中5’端转基因插入位点和侧翼玉米基因组每侧各12个核苷酸；seq id no.2转基因玉米事件“浙瑞8”中3’端转基因插入位点和侧翼玉米基因组每侧各12个核苷酸；seq id no.3转基因玉米事件“浙瑞8”中5’端转基因插入位点接合区附近1197个核苷酸序列；seq id no.4转基因玉米事件“浙瑞8”中3’端转基因插入位点接合区803个核苷酸序列；seq id no.5转基因玉米事件“浙瑞8”插入t-dna序列及其5’端和3’端的玉米基因组序列；seq id no.6位于seq id no:3内部的序列，跨越“浙瑞8”插入位点接合区；seq id no.7位于seq id no.4内部的序列，跨越“浙瑞8”插入位点接合区；seq id no.8检测seq id no.3的第一引物；seq id no.9检测seq id no.3的第二引物；seq id no.10检测seq id no.4的第一引物；seq id no.11检测seq id no.4的第二引物。
[0046]
本发明玉米转基因事件“浙瑞8”表达了cry1ab和cry2ab两个杀虫蛋白，能够提高杀虫效率、扩大杀虫谱、特别是能够有效控制对cry1ab杀虫蛋白产生抗性的玉米害虫，能够高抗玉米鳞翅目害虫，并且耐受草甘膦除草剂。“浙瑞8”同时对草甘膦除草剂具有高耐受性，在杂交育种过程中可以应用草甘膦进行转基因筛选，在玉米种植过程中可以应用草甘膦进行杂草防治。
[0047]
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0048]
本发明提供了一种用于检测玉米转基因事件“浙瑞8”的核苷酸序列及其特异性检测方法。本发明提供的转基因事件“浙瑞8”以种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:p202202。“浙瑞8”能够高抗玉米鳞翅目害虫，并且耐受草甘膦除草剂，应用“浙瑞8”可以降低抗虫转基因玉米种植过程中庇护所的使用面积，提高玉米生产效率，降低玉米生产成本。“浙瑞8”同时对草甘膦除草剂具有高耐受性，在杂交育种过程中可以应用草甘膦进行转基因筛选，在玉米种植过程中可以应用草甘膦进行杂草防治。本发明检测方法中提供的seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4是“浙瑞8”特有序列，可以针对本发明提供的核苷酸序列设计特异性检测引物对，应用核酸扩增方法准确、稳定鉴定出“浙瑞8”转基因事件的存在，能够实现对“浙瑞8”的研究、生产加工和应用进行溯源和全流程监管。
(四)附图说明：
[0049]
图1为外源插入基因与玉米基因组结构示意图。
[0050]
图2为转化载体图谱。
[0051]
图3为浙瑞8和郑单958心叶抗玉米螟图片。
[0052]
图4为浙瑞8和对照心叶抗东方黏虫图片。
[0053]
图5为浙瑞8和对照高抗玉米螟图片。
[0054]
图6为浙瑞8和对照对草甘膦耐受性图片。
[0055]
图7玉米基因组特异性检测电泳图(m：marker；1：浙瑞8；2：瑞丰125；3：mon810；4：bt11；5：mon89034；6：常规玉米；7：常规大豆；8：常规水稻)。
[0056]
图8浙瑞8 5’端特异性检测电泳图(1：浙瑞8；2：瑞丰125；3：mon810；4：bt11；5：mon89034；6：常规玉米；7：常规大豆；8：常规水稻)。
[0057]
图9浙瑞8 3’端特异性检测电泳图(1：浙瑞8；2：瑞丰125；3：mon810；4：bt11；5：mon89034；6：常规玉米；7：常规大豆；8：常规水稻)。
(五)具体实施方式
[0058]
实施例1：含有外源基因的质粒载体的获得
[0059]
本发明用于玉米转化的载体图谱如图2所示，转化质粒载体以pcambia1300(genbank:af234296.1)为植物转化载体框架，在其多克隆位点区域加入包含完整抗草甘膦表达框和抗虫表达框的t-dna，具体由如下部分组成，抗草甘膦表达框：经优化后的camv的35s启动子连有一段编码ahas基因叶绿体信号肽的抗草甘膦基因g10evo-epsps，终止子是camv的35s基因终止子；抗虫表达框：cry1ab和cry2ab，驱动cry1ab的启动子为来源于玉米polyubiquitin-1基因启动子(pzmubi-1)，终止子为来源于玉米的pep carboxylase基因(pepc)终止子，驱动目的基因cry2ab的启动子为actin启动子，终止子为camv的35s基因终止子，t-dna序列为seq id no:5中878-12198位核苷酸。
[0060]
利用电击法(2500v)将获得的转化质粒导入农杆菌lba4404中，获得含有转化载体的农杆菌。
[0061]
实施例2：转化体获得
[0062]
采用农杆菌介导进行玉米遗传转化，具体是根据frame等(plant physiol,2002,129:13-22)报道的方法和培养基配方进行转化，使用草甘膦为筛选试剂，步骤如下：取授粉后8～10天的玉米穗，收集大小为1.0-1.5mm未成熟胚。将含有转化载体的农杆菌与未成熟胚在22℃共培养2-3天。将培养后的未成熟胚转移到含有终浓度200mg/l特美汀抗生素(葛兰素史克，美国)的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-14天杀灭农杆菌。诱导培养后的所有愈伤组织转到含有终浓度2mm草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。诱导培养后将所有的愈伤组织转到新鲜的含有(2mm)草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。将成活的胚性组织转到再生培养基上，28℃暗培养10-14天后转移到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。挑取发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中生长繁种，用于筛选分析。
[0063]
一共产生350个独立转基因单株。通过对cry1ab，cry2ab，g10evo蛋白含量、插入片段拷贝数、遗传稳定性、抗虫效果、草甘膦耐受性和对玉米农艺性状的影响，选定了具有良好的抗虫和耐草甘膦性能、外源基因单拷贝插入，农艺性状表现优秀，抗虫和耐草甘膦性状稳定遗传的转化事件“浙瑞8”。
[0064]
实施例3：玉米转基因事件“浙瑞8”检测
[0065]
1、侧翼dna序列的分析
[0066]
使用liu等报道的tail-pcr(thermal asymmetric interlaced pcr)方法(liu，plant journal 1995，8(3):457-463)对实施例2筛选的优良转化事件“浙瑞8”外源转基因dna插入点两侧的区域序列进行测定。该方法通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的pcr扩增，利用不同退火温度选择性地扩增目标片段。分别根据t-dna左右边界区域设计三个巢式特异性pcr引物lb-sp1、lb-sp2和lb-sp3；rb-sp1、rb-sp2和rb-sp3依次与简并引物ad4l组进行pcr扩增，引物序列见表2，pcr反应条件见表3。
[0067]
表2.tail-pcr引物序列
[0068]
引物序列lb-sp1tttctccataataatgtgtgagtagttccclb-sp2ctcatgtgttgagcatataagaaacccttaglb-sp3ctaaaaccaaaatccagtactaaaatccrb-sp1cttggcactggccgtcgtttrb-sp2gactgggaaaaccctggcgttrb-sp3agctggcgtaatagcgaagaggad4laggttatgctantcagstwtsgwgwt
[0069]
表3.tail-pcr反应条件
[0070][0071]
表4、pcr反应体系：
[0072]
[0073][0074]
第一轮反应：以lb-sp1+rb-sp1与ad4l为引物，“浙瑞8”基因组为模板；
[0075]
第二轮反应：以lb-sp2+rb-sp2与ad4l为引物，第一轮产物为模板；
[0076]
第三轮反应：以lb-sp3+rb-sp3与ad4l为引物，第二轮产物为模板。
[0077]
采用axygen公司的pcr产物回收试剂盒回收第3轮pcr扩增产物，连接到pmd20-t克隆载体上(takara,code:d107a)，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆经上海博尚测序公司进行测序。获得的序列信息与玉米网上数据库(http://www.maizegdb.org)进行比对分析，检索相似的玉米基因组序列。
[0078]
2、t-dna右侧翼区
[0079]
对通过tail-pcr方法获得的鉴定为包含5’侧翼区的片段进行测序，测序结果为seq id no.3，第1-877bp的序列对应于玉米基因组dna，第878-1300bp的序列对应于外源dna。
[0080]
3、t-dna左侧翼区
[0081]
鉴定为包含3’侧翼区的片段进行测序，测序结果为seq id no.4，第1-300bp为插入基因核苷酸序列，第301-803bp为玉米侧翼基因组核苷酸序列。
[0082]
4、“浙瑞8”整合入基因组序列信息
[0083]
上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列、外源抗虫基因表达框和抗除草剂基因表达框序列拼接形成本发明所述的转化事件，核苷酸序列为seq id no.5。对应玉米转基因事件“浙瑞8”以种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:p202202。
[0084]
实施例3：“浙瑞8”抗虫性能测定
[0085]
采用室内生测的方法对玉米转化事件“浙瑞8”和常规玉米植株(郑单958、先玉335)分别对亚洲玉米螟、亚洲玉米螟cry1ab抗性品系、亚洲玉米螟cry1ah抗性品系、东方黏虫、棉铃虫进行生物测定，测试昆虫由中国农业科学院植物保护所提供。
[0086]
1、玉米螟
[0087]
分别取未展开的幼嫩心叶，用消毒剪刀剪成2-3cm大小，放入培养皿内，接入10头初孵幼虫(玉米螟、亚洲玉米螟cry1ab抗性品系、亚洲玉米螟cry1ah抗性品系)，每个培养皿为一个重复，重复6次。放置在温度28
±
1℃、光周期16h:8h(l:d)、相对湿度70％-80％的人工气候培养箱中培养。分别根据24h、48h和72h各处理的幼虫死亡数计算幼虫死亡率，判定转基因玉米“浙瑞8”对玉米螟的抗性。
[0088]
室内抗虫性鉴定时，对照组幼虫死亡率大于20％放弃试验结果，对照组幼虫死亡率小于20％计算校正死亡率。校正死亡率(％)＝(处理组幼虫死亡率-对照组幼虫死亡率)/(1-对照组幼虫平均死亡率)
×
100。本试验中，对照组幼虫死亡率为非转基因玉米郑单958幼虫死亡率的平均值。
[0089]
统计结果显示，与对照相比，取食“浙瑞8”的玉米螟72h后全部死亡，而对照郑单958上的玉米螟大多长至2龄期，说明“浙瑞8”具有良好的抗虫性能(图3)，“浙瑞8”对玉米螟抗cry1ab品系和cry1ah品系也具有良好抗性，接虫72h后死亡率达到100％(表5)。
[0090]
表5转基因玉米“浙瑞8”对靶标害虫玉米螟的室内生物测定结果
[0091][0092][0093]
注：表中数据为平均值
±
标准差，“*”表示与对照相比检验差异显著。
[0094]
2、棉铃虫
[0095]
同玉米螟检测方法，棉铃虫生测结果显示，接虫24h后，转基因抗虫玉米“浙瑞8”的幼虫死亡率为69.8％。72h后，“浙瑞8”的幼虫死亡率达到100％，死亡率显著高于非转基因对照处理，“浙瑞8”高抗棉铃虫，如表6所示。
[0096]
表6棉铃虫室内生测抗性鉴定结果(死亡率％)
[0097][0098]
数据为平均值
±
标准误差，数据后字母表示两处理之间在5％水平上的差异显著性。校正死亡率(％)＝(处理组幼虫死亡率-对照组幼虫死亡率)/(1-对照组幼虫平均死亡率)
×
100，对照组幼虫死亡率为非转基因玉米郑单958和先玉335幼虫死亡率的平均值。下同。
[0099]
3、东方黏虫
[0100]
同玉米螟检测方法，以普通玉米为对照，东方黏虫生测结果显示，接虫24h后，转基因抗虫玉米“浙瑞8”的幼虫死亡率为53.6％。72h后，“浙瑞8”的幼虫死亡率达到100％。“浙瑞8”饲喂的黏虫幼虫死亡率显著高于普通玉米(郑单958和先玉335)处理，“浙瑞8”高抗东方黏虫(表7，图4)。
[0101]
表7黏虫心叶期室内生测抗性鉴定结果(死亡率％)
[0102][0103]
实施例4：“浙瑞8”对鳞翅目害虫的田间抗性鉴定
[0104]
共对3种鳞翅目害虫亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫进行田间抗性鉴定。接虫时期及方法如下：
[0105]
亚洲玉米螟：在玉米心叶期(6～8叶期)和吐丝期进行人工接初孵幼虫，每小区(小区面积25m2(5m
×
5m))人工接虫40株“浙瑞8”，每株接虫40头。每期接虫两次，间隔3d。最后一次接虫14d后调查接虫株被害情况。调查方法按ny/t 1248.5的规定执行。玉米心叶期抗虫性评价按照ny/t 1248.5的规定执行，穗期根据雌穗被害情况、蛀孔数量、隧道长度及存
活幼虫龄期数量等，计算各小区穗期玉米螟对雌穗的抗性被害级别平均值。分级标准及抗性评价标准按农业部953号公告-10.1-2007的规定执行。以普通玉米(郑单958和先玉335)为对照。
[0106]
黏虫：4～6叶期接虫，每小区(小区面积25m2(5m
×
5m))人工接40株“浙瑞8”，每株接初孵幼虫40头。接虫两次，间隔3d。最后一次接虫14d后调查接虫株被害情况。分级标准及抗性级别判定标准按照农业部953号公告-10.1-2007的规定执行。以普通玉米(郑单958和先玉335)为对照。
[0107]
棉铃虫：在吐丝期，每小区(小区面积25m2(5m
×
5m))人工接40株“浙瑞8”，每株接初孵幼虫20～30头，接于玉米花丝上，3d后再次按同样方法接虫，之后14d调查，按照雌穗被害率、幼虫存活数，雌穗危害长度进行分级和抗性判定。分级标准及抗性级别判定标准按照农业部953号公告-10.1-2007的规定执行。以普通玉米(郑单958)为对照。
[0108]
田间抗虫试验结果表明，“浙瑞8”在心叶、花丝、茎秆和雌穗高抗亚洲玉米螟(图5)，“浙瑞8”对黏虫和棉铃虫也达到高抗水平(表8)。
[0109]
表8.“浙瑞8”田间抗性鉴定结果
[0110][0111]
数据为平均值
±
标准误差，数据后字母表示各处理之间在5％水平上的差异显著性。
[0112]
实施例5：“浙瑞8”草甘膦耐受性测试
[0113]
采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，每个小区面积4m
×
6m，双粒播种，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，在5-7叶期喷施草甘膦，处理如下：1)不喷施；2)喷施中剂量草甘膦，有效剂量80克/亩；3)中剂量2倍量草甘膦，有效剂量160克/亩；4)中剂量4倍量草甘膦，有效剂量320克/亩。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按gb/t 17980.42-2000执行。除草剂受害率(x-受害率，单位为％，n-同级受害株数；s-级别数；t-总株数；m-最高级别)。用方差分析方法比较不同处理的转基因抗除草剂玉米、非转基因玉米在出苗率、成苗率和受害率方面的差异。判别转基因抗除草剂玉米对除草剂的耐受水平。以普通玉米(郑单958)为对照。
[0114]
草甘膦田间测试结果先手转基因玉米“浙瑞8”对草甘膦具有高度耐受性(表9，图6)。
[0115]
表9“浙瑞8”对草甘膦耐受性调查表
[0116][0117]
实施例6：“浙瑞8”异性检测
[0118]
转化事件“浙瑞8”的5’及3’侧翼序列分别如seq id no:5的第1-796位核苷酸及第12118-12620位核苷酸所示，针对玉米转化事件“浙瑞8”的5’端及3’端插入位点序列分别设计引物，进行pcr反应，反应条件及反应体系下表10、表11所示。
[0119]
表10、引物信息
[0120][0121]
表11、pcr反应体系为：
[0122]
试剂体积基因组dna2μl正向引物(10μm)1μl反向引物(10μm)1μl2
×
primestar gc buffer(mg2
+
plus)25μldntp mixture4μlprimestar hs dna polymerase0.5μlddh2o16.5μl总体积50μl
[0123]
pcr条件是：30个循环，每个循环是98℃，10秒；58℃，30秒；72℃，40秒。
[0124]
pcr反应条件：94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。
[0125]
选取转基因玉米浙瑞8以及产业化应用的转基因玉米瑞丰125、mon810、bt11、mon89034和常规玉米、常规大豆、常规水稻的籽粒粉末提取基因组dna，进行核酸特异性检测，分别采用检测引物对gf(seq id no:10)与zg-r(seq id no:11)，zg-f(seq id no:8)与
gr(seq id no:9)和内参照引物(zssiib-1f和zssiib-1r)进行扩增。扩增产物琼脂糖电泳结果显示，含玉米基因组的样品(浙瑞8、瑞丰125、mon810、bt11、mon89034和常规玉米)能够检测到大约150bp左右的条带(图7)，与预期条带大小一致，说明用来测试的玉米基因组质量符合要求。常规水稻和常规大豆的基因组样品扩增产物检测不到条带。应用引物对gf和zg-r扩增产物电泳结果显示，仅有“浙瑞8”样品能够检测到越500bp大小的条带，条带大小与预期一致，不含“浙瑞8”基因组的其他转化事件、常规玉米、大豆和水稻基因组的样品检测不到特异性条带，本发明提供的引物对能够特异性检测出“浙瑞8”的存在(图8)。
[0126]
应用引物对zg-f和gr进行pcr扩增，扩增产物电泳结果显示，仅有“浙瑞8”样品能够检测到越550bp大小的条带，条带大小与预期一致(图9)，不含“浙瑞8”基因组的其他玉米转化事件、常规玉米、大豆和水稻基因组的样品没有条带检出，本发明提供的引物对能够特异性检测出“浙瑞8”的存在。因此，本发明提供的测试引物对能够特异性检测到含有“浙瑞8”样品的存在。

技术特征：
1.一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括seq id no.1或其互补序列、和/或seq id no.2或其互补序列，所述核酸序列来自于转基因玉米事件“浙瑞8”，所述转基因玉米事件“浙瑞8”以种子形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:p202202，保藏日期2022年1月11日，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括seq id no.3或其互补序列、和/或seq id no.4或其互补序列。3.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于所述核酸序列包括seq id no.5或其互补序列。4.一种检测样品中转基因玉米事件“浙瑞8”的dna存在的方法，其特征在于，所述方法包括：将待检测样品与引物对在核酸扩增溶液中接触，进行核酸扩增反应，检测扩增产物；扩增产物包括seq id no.1或其互补序列、和/或seq id no.2或其互补序列。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增产物包括seq id no.6或其互补序列、和/或seq id no.7或其互补序列。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物为seq id no.8或seq id no.10；所述第二引物为seq id no.9或seq id no.11。7.一种保护玉米不受昆虫危害的方法，其特征在于，所述方法是提供一种转基因玉米植物，取食所述转基因玉米植物的靶标昆虫被抑制进一步取食所述转基因玉米植物；所述转基因玉米植物基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705位核酸、seq id no.5第6970-8919位核酸和seq id no.2。8.一种提高玉米耐受草甘膦的方法，其特征在于，所述方法包括将草甘膦除草剂喷施到种植转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物对草甘膦具有耐受性；所述转基因玉米植物基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。9.一种控制玉米田间杂草的方法，其特征在于，所述方法包括将草甘膦除草剂喷施到种植转基因玉米的大田中，所述转基因玉米对草甘膦具有耐受性，玉米田间杂草被草甘膦杀灭；所述转基因玉米基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。10.一种培育对昆虫具有抗性的玉米植物的方法，其特征在于，所述方法包括：种植玉米种子，在玉米植株上接靶标昆虫，收获与其他不含有特定区域核酸序列的植株相比具有更好抗虫效果的植株；所述玉米种子的基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705位核酸、seq id no.5第6970-8919位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。11.一种培育对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物的方法，其特征在于，所述方法包括：种植玉米种子，使所述玉米长成玉米植株，用草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与
其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，不受草甘膦损伤的植株；所述玉米种子的基因组中包含来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。12.一种产生对昆虫具有抗性的玉米植株的方法，其特征在于，所述方法包括：将转基因玉米植株，与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；选择与其他不具有特定区域核酸序列的植株相比，具有更好抗虫效果的植株；所述转基因玉米植株的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705位核酸序列、第6970-8919位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。13.一种产生对草甘膦具有耐受性的玉米植株的方法，其特征在于，所述方法包括将转基因玉米植株，与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，不受草甘膦损伤的植株；所述转基因玉米植株的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。14.一种产生对昆虫具有抗性且耐受草甘膦除草剂的玉米植株的方法，其特征在于，所述方法包括：将转基因玉米植株与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，抗虫且不受草甘膦损伤的植株；所述转基因玉米植株的基因组中包括来自转基因玉米事件“浙瑞8”的特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含seq id no.1、seq id no.5第2804-4705位核酸序列、seq id no.5第6970-8919位核酸序列、seq id no.5第10426-11943位核酸序列和seq id no.2，或者所述特定区域的核酸序列包含seq id no.5。15.一种产生自转基因玉米事件“浙瑞8”的组合物，其特征在于，所述组合物为玉米粉、玉米面、玉米油、玉米淀粉或玉米穗；所述转基因玉米事件“浙瑞8”以种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心保藏编号：cctcc no:p202202。

技术总结
本发明公开了一种用于检测转基因玉米事件“浙瑞8”的核酸序列及其检测方法，所述核酸序列包括SEQ ID NO.1或其互补序列、和/或SEQ ID NO.2或其互补序列，所述核酸序列来自于转基因玉米事件“浙瑞8”，所述转基因玉米事件“浙瑞8”以种子形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:P202202。“浙瑞8”能够抵抗玉米常见鳞翅目害虫的危害，并对草甘膦具有较好的耐受性。本发明提供的核苷酸序列设计特异性检测引物对，应用核酸扩增方法准确、稳定鉴定出“浙瑞8”转基因事件的存在，能够实现对“浙瑞8”的研究、生产加工和应用进行溯源和全流程监管。全流程监管。


技术研发人员：沈志成 林朝阳 王鹏飞 郑挺 许超
受保护的技术使用者：杭州瑞丰生物科技有限公司
技术研发日：2022.01.14
技术公布日：2023/7/26