非洲猪瘟H240R表位肽、单克隆抗体及其应用

非洲猪瘟h240r表位肽、单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子免疫学技术领域，特别是涉及非洲猪瘟h240r表位肽、单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)是非洲猪瘟病毒(asfarviridae)家族中唯一的成员，也是唯一已知的dna虫媒病毒(用于指任何通过节肢动物传播的病毒)。尽管asfv与其他ncldvs具有相同的结构、基因组和复制特性，但asfv的不同之处在于它具有多层结构和二十面体形态。细胞内asfv有一个包含基因组的类核(第一层)，被厚厚的蛋白质层(第二层)所包围，称为核壳(第二层)，核壳被内脂膜(第三层)和二十面体蛋白衣壳(第四层)所包裹；这四层包含超过50种蛋白质。当asfv从质膜中出芽时，它获得了一层外膜(第五层)。关于感染性病毒粒子的组成、位置和结构，以及能够诱导猪保护性免疫反应的病毒蛋白的鉴定方面的知识存在很大的空白，因此阻碍了疫苗的开发。
3.根据蛋白质组学分析、asfv粒子中的蛋白质丰度水平、低温电子显微镜图与靶蛋白预测结构特征(包括蛋白质序列、蛋白质二级结构和蛋白质拓扑)的相似性，鉴定出了五邻体蛋白(h240r)和三种次级衣壳蛋白(p17、p49、p17、p49、h240r)。外衣壳的每个二十面体非对称单元包含46个伪六面体衣壳，其中6个在五聚体中(a,b,c,d,e,f)和40个在三聚体中(a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t,u,v,w,x,y,z,a
′
,b
′
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′
,和n
′
)。h240r蛋白和次级衣壳蛋白(p17、p49和m1249l)在紧接外衣壳的下方形成一个复杂的网络，稳定整个衣壳。
4.对所有asfv病毒株用五邻体(penton)蛋白序列的开放阅读框架进行blast比对，鉴定出了序列相似性为37.7％的同源物h240r，这是一个未确定特征但非常重要的病毒粒子蛋白。h240r在长度上有240个残基，富含β链，具有一个卷曲折叠和一个约70个氨基酸的n端延伸，这进一步支持了asfv中五邻体(penton)的鉴别功能。在五邻体下面，观察到低密度的灯笼样的结构，该结构可以连接五邻体、内膜以及相关的五个相邻的衣壳体，此前推测h240r蛋白在结构上有顶点组装的作用。目前，有关asfv h240r蛋白的研究甚少，有必要对h240r蛋白进行重组表达，并制备其特异性的单克隆抗体，进而利用生物信息学技术和扫描多肽技术对h240r蛋白进行筛选和鉴定。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供非洲猪瘟h240r表位肽、单克隆抗体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明鉴定得到了非洲猪瘟h240r表位肽，并制备得到了与非洲猪瘟h240r蛋白特异性结合的单克隆抗体，为制备非洲猪瘟多肽疫苗和检测试剂盒奠定了基础。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种非洲猪瘟h240r表位肽，氨基酸序列如seq id no.19或seq id no.20所示。
8.本发明还提供一种上述的非洲猪瘟h240r表位肽的编码基因。
9.本发明还提供一种包含上述的编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组表达载体或重组微生物菌株。
10.本发明还提供上述的非洲猪瘟h240r表位肽、编码基因或生物材料在制备非洲猪瘟多肽疫苗中的应用。
11.本发明还提供一种非洲猪瘟多肽疫苗，包括上述的非洲猪瘟h240r表位肽。
12.本发明还提供一种非洲猪瘟h240r同源二聚体蛋白，所述非洲猪瘟h240r同源二聚体蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
13.本发明还提供一种上述的非洲猪瘟h240r同源二聚体蛋白在制备非洲猪瘟h240r单克隆抗体中的应用。
14.本发明还提供一种抗非洲猪瘟h240r单克隆抗体，所述非洲猪瘟h240r单克隆抗体为单克隆抗体11c1a6或单克隆抗体38a3b2；
15.所述单克隆抗体11c1a6的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.10所示；
16.所述单克隆抗体38a3b2的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.11所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.12所示。
17.本发明还提供上述的抗非洲猪瘟h240r单克隆抗体在制备非洲猪瘟检测试剂盒中的应用。
18.本发明还提供一种非洲猪瘟检测试剂盒，包括上述的抗非洲猪瘟h240r单克隆抗体。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明通过初步筛选和截短鉴定，得出
150
lsgpld
155
和
170
hiqlp
175
为h240r的b细胞表位区域，这为制备非洲猪瘟多肽疫苗奠定了基础。
21.本发明对h240r同源二聚体蛋白的核酸序列进行优化，使其在昆虫杆状病毒表达系统中更好地表达，制备得到重组asfv h240二聚体蛋白的病毒样颗粒，将其免疫小鼠，制备得到了与h240r特异性结合的单克隆抗体。本发明为制备非洲猪瘟检测试剂盒提供了新的单克隆抗体来源。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为h240r蛋白的跨膜区域预测；
24.图2为asfv h240r同源二聚体蛋白的氨基酸序列；
25.图3为真核表达的h240r蛋白的密码子优化；其中，a为密码子偏爱性分析；b为优化后的密码子适应指数(cai)分析；c为gc含量分析；
26.图4为asfv h240r同源二聚体目的基因的获得；
27.图5为重组质粒pfastbaci-h240r菌液pcr结果；
28.图6为蓝白斑筛选的白色单克隆菌进行菌液pcr的结果；
29.图7为western blot鉴定真核h240r蛋白表达的结果；其中，a为第三代病毒p3表达h240r蛋白的western blot鉴定；b为sf21细胞表达h240r蛋白的western blot鉴定；c为重组h240r蛋白与康复猪的阳性血清的反应情况分析；
30.图8为ifa鉴定真核h240r蛋白的表达的结果；
31.图9为真核h240r蛋白的纯化鉴定结果；其中，a为h240r进行镍亲和层析初步纯化的结构；b为sp阳离子交换层析纯化获得的h240r蛋白的sds-page鉴定；c为sp阳离子交换层析纯化后各组分洗脱液的western blot鉴定；
32.图10为纯化的真核h240r二聚体重组蛋白与阳性血清的反应情况；
33.图11为h240r的病毒样颗粒；
34.图12为sp2/0骨髓瘤细胞在光学显微镜下的形态；
35.图13为asfv h240r单克隆抗体腹水效价的测定结果；
36.图14为western blot和ifa检测单克隆抗体与真核表达的重组h240r蛋白的反应情况；其中，a为western blot鉴定单克隆抗体11c1a6与重组h240r蛋白的反应情况；b为western blot鉴定阳性血清与重组h240r蛋白的反应情况；c为western blot鉴定单克隆抗体38a3b2与重组h240r蛋白的反应情况；d为ifa鉴定单克隆抗体11c1a6与sf21细胞表达的h240r蛋白的反应情况；e为ifa鉴定阳性血清与sf21细胞表达的h240r蛋白的反应情况；f为ifa鉴定单克隆抗体38a3b2与sf21细胞表达的h240r蛋白的反应情况；
37.图15为h240r单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区扩增结果；
38.图16为间接elisa初步筛选h240r的b细胞表位；其中，a为与单克隆抗体11c1反应；b为与单克隆抗体38a3反应；
39.图17为dot-elisa初步筛选h240r蛋白的b细胞表位；其中，a为与单克隆抗体11c1反应；b为与单克隆抗体38a3反应；
40.图18为h240r蛋白b细胞表位的截短鉴定结果；其中，a为间接elisa鉴定六段短肽与抗h240r单抗11c1a6的反应性；b为间接elisa鉴定六段短肽与抗h240r单抗38a3b2的反应性；c为dot-elisa鉴定六段短肽与抗h240r单抗11c1a6的反应性；d为dot-elisa鉴定六段短肽与抗h240r单抗38a3b2的反应性；
41.图19为非洲猪瘟h240r表位肽的空间结构。
具体实施方式
42.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
43.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
44.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
45.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
46.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
47.实施例1asfv h240r蛋白氨基酸序列分析、优化及基因合成
48.根据asfv china/2018/anhuixcgq分离株(genebank登录号：mk128995.1)的序列，对第155365-156090bp编码asfv h240r蛋白(protein id：ayw34090.1)的基因h240r的序列进行生物信息学分析。利用tmhmm server v.2.0，根据氨基酸序列分析h240r蛋白的跨膜区域。如图1所示，h240r蛋白的1-241aa均位于细胞膜外，因此需要对h240r全长序列进行表达。对h240r蛋白的氨基酸序列进行改造，使其以同源二聚体的形式表达，以增强其免疫原性和免疫反应性。如图2所示，h240r蛋白同源二聚体的氨基酸序列构成为gp67-h240r-linker-h240r-6
×
his(氨基酸序列见seq id no.1)，在h240r同源二聚体蛋白的序列的5’端加上gp67信号肽，使蛋白可以分泌性表达，有利于蛋白的折叠和糖基化、磷酸化等的加工，也有利于得到高纯度的目的蛋白。同时，在h240r同源二聚体蛋白的序列的3’端加上6
×
his标签，有利于蛋白的亲和纯化。
49.如图3所示，利用上海生工生物工程有限公司的密码子优化软件对h240r同源二聚体蛋白的核酸序列进行优化，使其在昆虫杆状病毒表达系统中更好地表达。优化后的cai为0.98(图3中b)。平均gc含量调整到54.33％(图3中c)。优化后的asfv h240r同源二聚体蛋白的核酸序列如seq id no.2所示，全长1626bp。用protparam软件生物信息学分析软件，分析其理化性质可知asfv h240r同源二聚体蛋白的等电点pi为9.45，分子量为625kda。
50.将优化后的序列在上海生工生物工程有限公司连接入puc57载体，合成目的基因puc57-h240r。
51.seq id no.1：
52.mllvnqshqgfnkehtskmvsaivlyvllaaaahsafaefmaaniiatravpkmaskkehqyclldsqekrhghypfsfelkpygqtganiigvqgslthvikmtvfpfmipfplqkthiddfiggriylffkeldmqavsdvngmqyhfefkvvpvspnqvellpvnnkykftyaipvvqyltpifydlsgpldfpldtlsvhvdilsnhiqlpiqnhnlttgdrvfisgykhlqtielcknnkifiknipplssekiklyilknririplyfkslktskggggsggggsggggsmaaniiatravpkmaskkehqyclldsqekrhghypfsfelkpygqtganiigvqgslthvikmtvfpfmipfplqkthiddfiggriylffkeldmqavsdvngmqyhfefkvvpvspnqvellpvnnkykftyaipvvqyltpifydlsgpldfpldtlsvhvdilsnhiqlpiqnhnlttgdrvfisgykhlqtielcknnkifiknipplssekiklyilknririplyfkslktskhhhhhh。
53.seq id no.2：
54.atgctgctcgttaaccagtcccaccagggattcaacaaggagcacaccagcaagatggtttctgctatcgttctgtacgtgctgctggccgctgccgctcactccgctttcgccatggccgctaacatcatcgctactcgcgccgtgccaaagatggccagcaagaaggaacaccagtactgcctcttggactcccaggaaaagcgccacggtcactacc
cattctccttcgaactcaagccatacggacagaccggagctaatatcatcggagttcagggtagcctgacccacgttatcaagatgaccgtgttccctttcatgatccctttccctctccagaagactcacatcgacgacttcatcggtggccgtatctacctcttcttcaaggaactcgacatgcaggccgtcagcgacgtgaacggtatgcaataccacttcgaatttaaggtcgtgcctgtgtctcccaaccaggtggaattgctcccagtgaacaacaagtacaagttcacctacgctatccccgtggtgcagtacctgacaccaatcttctacgacctgtccggacccctggacttccctttggacacattgtccgttcacgtggacatcctgtccaaccacatccagctgcctatccagaaccacaacctcactactggtgaccgtgtgttcatcagcggctacaagcacctgcagactatcgaactctgtaagaacaacaagatcttcatcaagaacatccctcctctgagctccgagaagatcaagctctacatcctgaagaacaggattcgcatccccctctacttcaagagcctcaagacatcaaagggaggtggcggctcaggcggtggtggctccggcggcggaggcagcatggccgccaacatcatcgccacacgtgccgtgcccaagatggcttcaaagaaggagcaccagtactgcctgctcgacagccaggagaagagacacggccactaccctttctctttcgagctcaagccttacggccaaaccggtgctaacatcatcggcgtgcagggttccctgacacacgttatcaagatgaccgtcttcccattcatgatccctttcccactccagaagacccacatcgacgacttcatcggtggtcgtatctacctgttcttcaaggagctggacatgcaggctgtctctgacgtgaacggtatgcaataccacttcgagttcaaggttgtgcccgtgtctcccaaccaggtggaactgctgcccgtgaacaacaagtacaagttcacttacgctatcccagtggtgcagtacctgacaccaatcttctacgacttgagcggtcctctggacttccccctcgacaccctgagcgtgcacgtggacatcctgagcaaccacatccagctgcccatccaaaaccacaacctgaccactggtgaccgtgtgttcatctccggttacaagcacctgcaaactatcgaactctgcaagaacaacaagatcttcatcaagaacatccctccactgagcagcgaaaagatcaagctctacatcctgaagaaccgcatccgcatccctctgtacttcaagtctctgaagactagcaagcaccaccaccaccaccattaa。
55.实施例2pfastbaci-h240r蛋白重组载体的构建
56.根据h240r的同源二聚体蛋白的核苷酸序列设计扩增目的基因的上下游引物，并引入bamhi/xbai两个酶切位点，所设计的上下游引物如表1所示。如图4所示，1％的琼脂糖凝胶电泳结果显示，从合成的puc57-h240r中扩增得到长为1626bp的h240r同源二聚体基因。双酶切实验，dna连接实验和将连接产物转化dh5α感受态细胞实验后(实验中载体选用pfastbaci，由河南省农业科学院动物免疫实验室提供)，利用m13通用引物做菌液pcr反应，琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，阳性克隆的大小为目的基因长度加上约2300bp，则h240r蛋白阳性克隆pfastbaci-h240r大小为3926bp。随机选择两个大小正确的阳性克隆pfastbaci-h240r-9和pfastbaci-h240r-15进行菌液测序，测序结果利用meglin进行序列比对，显示pfastbaci-h240r-9和pfastbaci-h240r-15均与h240r同源二聚体序列一致。随机选取pfastbaci-h240r-9重组质粒制备重组黏粒。
57.表1扩增h240r的同源二聚体目的基因的引物
[0058][0059]
注：斜体表示酶切位点。
[0060]
实施例3pfastbaci-h240r重组粘粒的制备
[0061]
将实施例2中构建的重组菌株pfastbaci-h240r 50μl，加入5ml含有amp
+
的lb培养
基中，置于37℃细胞培养摇床中220rpm培养过夜；次日，12000rpm离心1min收集菌体，利用omega质粒小提试剂盒提取重组质粒pfastbaci-h240r，测定重组质粒的浓度；重组质粒pfastbaci-h240r，转化到dh10bac感受态细胞中，挑取大而圆的白色单菌落至1ml的含有终浓度为50μg/ml kana、50μg/ml tet和7μg/ml gen的三种抗生素的lb培养基，置于细菌培养摇床中37℃200rpm的条件下震荡培养过夜。待菌液浑浊后，取菌液进行pcr鉴定和测序鉴定。然后将鉴定的序列正确的重组质粒按照1:100的比例接种至含有三抗(kana、gen和tet)的lb培养基，37℃200rpm培养12h以上；用omega endo-free plasmid mini extraction kits试剂盒提取重组粘粒(bacmid)，用微滴式紫外分光光度计测定bacmid的浓度，并按照10μl/管分装至无菌的1.5ml离心管中，置于-20℃保存，以备后续实验。注意由于bacmid较大不稳定，容易发生断裂，因此要避免bacmid的反复冻融。
[0062]
结果如图6所示，pfastbaci-h240r(dh10bac10)的7个克隆菌除了4号是阴性，其余的均为阳性，其中7为强阳性克隆菌。7号克隆菌的菌液测序结果用meglin比对得与原始合成序列完全一致，可提取黏粒用于下一步转染操作。
[0063]
实施例4asfv h240r二聚体蛋白在真核杆状病毒表达系统的表达
[0064]
按照bac-to-bac操作系统中的杆状病毒表达系统的标准操作步骤，收获asfv h240r蛋白的第三代病毒(p3)后，大量扩增病毒并收获重组h240r蛋白。取细胞培养上清液进行western blot检测，结果如图7所示。图7中a是h240r的第三代病毒p3进行的western blot鉴定，且用鼠源的hrp标记的his单抗作为抗体，图中可以看到在约63kda的位置有单一的特异性条带，大小为预测的h240r二聚体蛋白大小一致。进一步对收获的大量扩增的300ml h240r蛋白的进行western blot鉴定，结果显示，说明asfv h240r二聚体蛋白在sf21细胞中成功表达(图7中b)，并用asfv康复猪的阳性血清作为一抗，羊抗猪igg作为二抗鉴定h240r与阳性血清的反应性，如图7中c结果所示，h240r二聚体蛋白可以与康复猪的阳性血清发生很好的反应。ifa实验结果显示，h240r二聚体蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中有很好的表达，如图8所示。
[0065]
实施例5重组asfv h240二聚体蛋白的纯化
[0066]
利用真核asfv h240r蛋白所带有的6
×
his融合标签与镍亲和层析纯化柱子结合且在咪唑的作用下解离的原理，对h240r进行初步纯化，洗涤杂蛋白的溶液中咪唑浓度为10mm，洗脱目的蛋白的溶液所含咪唑浓度为50mm，进一步采用sp阳离子纯化柱子对亲和层析纯化得到的产物进行纯化，得到纯度达90％的h240r蛋白，如图9中a所示，镍亲和层析纯化的sds-page结果，目的蛋白在约63kda处目的条带，但仍存在较多的目的条带。进一步用sp阳离子交换层析纯化ni亲和层析得到的目的蛋白。如图9中b所示，收集的sp纯化后的流穿液，并用10kda的超滤管浓缩得到63kda处单一的目的条带。如图9中c所示，用his单抗做western blot的一抗对sp纯化各阶段收集的蛋白进行鉴定，结果表明，h240r蛋白存在于流穿液中。如图10所示，纯化后的h240r二聚体蛋白与康复猪的阳性血清有特异性反应，且特异性反应条带位于约63kda。用bca蛋白浓度测定试剂盒测定的h240r二聚体蛋白浓度为1.47mg/ml。利用jem-1400(80kv)透射电镜观察纯化后的h240r蛋白溶液，如图11所示，h240r蛋白颗粒聚集成9nm左右的病毒样颗粒(vlps)。
[0067]
实施例6重组asfv h240二聚体蛋白的动物免疫及超免
[0068]
采用常规免疫方案，如表2所示，分别于第0天、第14天和第21天对三只balb/c小鼠
进行基础免疫，第35天对效价第21天效价最高的小鼠进行加强免疫。初次免疫每只小鼠25μg真核杆状病毒表达的asfv h240r和弗氏完全佐剂混合乳化，注射于小鼠的颈背部皮下多点，第二次和第三次基础免疫取25μg的asfv h240r蛋白和弗氏不完全佐剂混合乳化，在细胞融合前3天进行加强免疫，取25μg的asfv h240r蛋白不加佐剂腹腔注射。
[0069]
表2小鼠免疫方案
[0070][0071]
实施例7骨髓瘤细胞的培养及细胞融合
[0072]
通过骨髓瘤细胞的细胞复苏和传代培养，将细胞培养至长满4瓶t75细胞培养瓶，细胞状态良好，如图12所示，细胞贴于瓶底，排列整齐，呈半致密分布，滚圆透亮，大小均一，边缘清晰。将实施例6免疫后提取的小鼠脾细胞与sp2/0杂交瘤细胞用peg法进行融合。分散悬浮细胞到10块96孔细胞培养板中，每孔加250μl细胞悬液。培养4-5天可以在显微镜下观察到小细胞团，9-12天对杂交瘤细胞上清进行检测。用间接elisa法筛选到与h240r蛋白有良好反应的单克隆细胞株5株，分别命名为11c1和38a3。
[0073]
实施例8单克隆抗体的鉴定
[0074]
对实施例7获得的抗asfv h240r蛋白的2株阳性单克隆细胞系，即11c1和38a3，的腹水效价进行测定。如图13所示，单克隆抗体11c1a6和38a3b2的滴度分别为1:108和1:109。利用亚型鉴定试剂盒对2株抗asfv h240r单克隆抗体进行亚型测定得到，11c1a6和38a3b2的重链均为igg1，轻链均为kappa型。利用western blot和ifa检测抗h240r的单克隆抗体腹水与重组h240r蛋白的反应。结果如图14所示。2个抗h240r的单克隆抗体都与h240r蛋白反应，特异性条带在63kda左右。图14中a为单克隆抗体11c1a6与h240r反应，图14中c为单克隆抗体38a3b2与h240r反应，图14中e为阳性血清与h240r的反应。图14中b、d和f分别为单克隆抗体11c1a6、38a3b2和阳性血清均与sf21细胞表达的h240r蛋白反应。
[0075]
提取h240r单克隆抗体的rna，利用传统pcr方法扩增出h240r单克隆抗体的重链可变区(vh)以及轻链可变区(vl)。如图15所示，前五个泳道为asfv h240r蛋白的单克隆抗体细胞11c1a6的重链可变区基因和四对不同引物扩增的轻链可变区基因，后五个泳道为asfv h240r蛋白的单克隆抗体细胞38a3b2的重链可变区基因和四对不同引物扩增的轻链可变区基因，最后一个泳道为5000bp的核酸marker。由图可知重链可变区与轻链可变区的目的基因大小均约为300bp左右。
[0076]
asfv h240r蛋白的单克隆抗体
[0077]
11c1a6重链可变区核酸序列(seq id no.5)为：353bp(5
’‑3’
)
[0078]
ttttgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagtaagcaaacgggtgggccgtacagtaataaatgccagtgtcttcagcttttaagctgttcatttgcaggtagacactacttttggaatcatctcttgagatggtgaacctccctttcacagactcagcatagtatgttgcatgattattagctttgcttctaatttcagcaacccactcaagccccttctctggagactggcggacccagtccatccaggcgtcactaaaagtgaatccagaggcagcacaagagagtttcatggatcctccaggttgcaccaagcctcctccagactcctgcagctgcacctcaa。
[0079]
11c1a6轻链可变区核酸序列(seq id no.6)为：220bp(5
’‑3’
)
[0080]
tccgtttcagctccagcttggtcccccctccgaacgtgtacggaacatgtgaaccttgaaagcagtaataaactcccagatcctcagcctccactctgctgatcttgagtgtgaaatctgtccctgatccactgccactgaacctgtctgggaccccagaaaatcggttggaaactttgtagatcaggagctttggagactgggtgagctcaatgtcaaa。
[0081]
38a3b2重链可变区核酸序列(seq id no.7)为：360bp(5
’‑3’
)
[0082]
ttgaggtgcagctgcaggagtcaggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgactctctcctgtgtagcctcaggattcgatttaagtagatactggatgagttgggctcggcaggctccagggaaagggcaggaatggattggagaaattaatccaggaagcagtacgataaactatgcgccgtctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacgctgtacctgcaaatgagcaaagtgagatctgaggacacagccctttattactgtgcaagactgggcctttacggctggtttgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaaaaa。
[0083]
38a3b2轻链可变区核酸序列(seq id no.8)为：327bp(5
’‑3’
)
[0084]
ttgacattgagctcacccagtctccagccatcacagctgcatctctggggcaaaaggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagttacatacactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaccatggatttatgaaatatccaaactggcttctggagtcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccatttattactgccagcagtggagttatcctcttatcacattcggtgctgggaccaagctggagctgaaacggacaa。
[0085]
利用ncbi中的orf finder在线预测软件分析得到，h240r单克隆抗体氨基酸序列：
[0086]
11c1a6重链可变区氨基酸序列(seq id no.9)为：
[0087]
mevqlqesggglvqpggsmklscaasgftfsdawmdwvrqspekglewvaeirska nnhatyyaesvkgrftisrddskssvylqmnslkaedtgiyyctahpfaywgqgttvtvss k。
[0088]
11c1a6轻链可变区氨基酸序列(seq id no.10)为：
[0089]
mfdieltqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgsh vpytfgggtklelkr。
[0090]
38a3b2重链可变区氨基酸序列(seq id no.11)为：
[0091]
mevqlqesggglvqpggsltlscvasgfdlsrywmswarqapgkgqewigeinpgss tinyapslkdkfiisrdnakntlylqmskvrsedtalyycarlglygwfaywgqgttvtvs sk。
[0092]
38a3b2轻链可变区氨基酸序列(seq id no.12)为：
[0093]
mdieltqspaitaaslgqkvtitcsasssvsyihwyqqksgtspkpwiyeisklasgvpa rfsgsgsgtsysltissmeaedaaiyycqqwsyplitfgagtklelkrt。
[0094]
将各单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列用柔性linker按照vh-linker-vl连在一起构成单链抗体。
[0095]
实施例9初步筛选h240r蛋白的b细胞表位
[0096]
抗h240r蛋白的单抗与24个短肽的间接elisa反应结果如图16所示。15号短肽(
141
qyltpifydlsgpld
155
)，其平均od
450
值1.353，16号短肽(
151
sgpldfpldtlsvhv
165
)，其平均od
450
值0.697，17号短肽(
161
lsvhvdilsnhiqlp
175
)，平均od
450
值0.802，与11c1(如图16中a)发生反应。15号短肽(
141
qyltpifydlsgpld
155
)与38a3(图16中b)反应，其平均od
450
值为1.455，16号短肽(
151
sgpldfpldtlsvhv
165
)与38a3(图16中b)反应，其平均od
450
值0.736，17号短肽(
161
lsvhvdilsnhiqlp
175
)与38a3(图16中b)反应，平均od
450
值0.818。因此，15号短肽，16号短肽和17号短肽均与单抗有较强烈反应，推断15号，16号和17号肽为h240r蛋白可能的b细胞表位区域。
[0097]
采用dot-elisa方法验证初步筛选出h240r蛋白b细胞表位，如图17所示。nc膜上点加1-24号短肽分别用2株单抗孵育。结果表明，15号短肽(
141
qyltpifydlsgpld
155
)，16号短肽(
151
sgpldfpldtlsvhv
165
)，17号短肽(
161
lsvhvdilsnhiqlp
175
)与11c1(图17中a)和38a3(图17中b)单抗均有较强的反应，此结果和间接elisa的结果一致。
[0098]
实施例10h240r蛋白b细胞表位的截短鉴定
[0099]
将h240r蛋白的初步筛选出来的短肽15号短肽、16号短肽和17号短肽合并一起，即
141
qyltpifydlsgpldtlsvhvdilsnhiqlp
175
。利用重叠多肽法将141-175位氨基酸残基分成6段，如表3所示，为了能够将短肽偶联至载体蛋白bsa上，在所合成的6个截短短肽n端加入半胱氨酸(cysteine，cys c)。经smcc法偶联短肽和bsa后，利用间接elisa鉴定这六段短肽与两株抗h240r单抗的反应性，如图18中a和b可知只有truncation-2(
146
ifydlsgpld
155
)和truncation-6(
166
dilsnhiqlp
175
)与抗h240r的两株单抗有反应，od
450
值为0.964。如图18中c和d所示，dot-elisa结果与间接elisa结果一致。用dnastar软件中的protean板块分析合并后的序列的二级结构性质，其中只有
150
lsgpld
155
(seq id no.19)残基的抗原指数为正值，与间接elisa和dot-elisa结果一致，其余肽段虽然存在折叠、螺旋以及转角结构，但是其抗原性均为负值，且表面可及性也为负值，而
166
dilsnhiqlp
175
存在β折叠结构。因此，综合实验结果和预测结果得出，
150
lsgpld
155
和
170
hiqlp
175
(seq id no.20)为h240r的b细胞表位区域。非洲猪瘟h240r表位肽的空间结构如图19所示。
[0100]
表3h240r初步筛选出的肽段的截短
[0101][0102][0103]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种非洲猪瘟h240r表位肽，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.19或seq id no.20所示。2.一种如权利要求1所述的非洲猪瘟h240r表位肽的编码基因。3.一种包含权利要求2所述的编码基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组表达载体或重组微生物菌株。4.一种如权利要求1所述的非洲猪瘟h240r表位肽、权利要求2所述的编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备非洲猪瘟多肽疫苗中的应用。5.一种非洲猪瘟多肽疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的非洲猪瘟h240r表位肽。6.一种非洲猪瘟h240r同源二聚体蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟h240r同源二聚体蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。7.一种如权利要求6所述的非洲猪瘟h240r同源二聚体蛋白在制备非洲猪瘟h240r单克隆抗体中的应用。8.一种抗非洲猪瘟h240r单克隆抗体，其特征在于，所述非洲猪瘟h240r单克隆抗体为单克隆抗体11c1a6或单克隆抗体38a3b2；所述单克隆抗体11c1a6的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.10所示；所述单克隆抗体38a3b2的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.11所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.12所示。9.一种如权利要求8所述的抗非洲猪瘟h240r单克隆抗体在制备非洲猪瘟检测试剂盒中的应用。10.一种非洲猪瘟检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的抗非洲猪瘟h240r单克隆抗体。

技术总结
本发明公开了非洲猪瘟H240R表位肽、单克隆抗体及其应用，涉及分子免疫学技术领域。所述非洲猪瘟H240R表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示。所述单克隆抗体为单克隆抗体11C1A6或单克隆抗体38A3B2；所述单克隆抗体11C1A6的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9-10所示；所述单克隆抗体38A3B2的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11-12所示。本发明鉴定得到了非洲猪瘟H240R表位肽，并制备得到了与非洲猪瘟H240R蛋白特异性结合的单克隆抗体，为制备非洲猪瘟多肽疫苗和检测试剂盒奠定了基础。定了基础。定了基础。


技术研发人员：王爱萍 张改平 贾蕊 周景明 陈玉梅 蒋大伟 杜永坤 王海丽 梁超 朱习芳 刘恩平
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/7/27