SNPs分子标记g.42993C＞T在湖羊分子标记辅助育种中的应用的制作方法

snps分子标记g.42993c＞t在湖羊分子标记辅助育种中的应用
技术领域
1.本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体涉及snps分子标记g.42993c＞t在湖羊分子标记辅助育种中的应用。


背景技术：

2.湖羊是我国珍稀的绵羊品种，原产于太湖流，所产羔皮花纹美观而著称，是我国特有的羔皮用绵羊品种，也是目前世界上少有的白色羔皮品种，在国际市场上享有很高的声誉，有“软宝石”之称。湖羊肉质鲜美湖羊体型大产肉量高，且肉质鲜美，营养丰富。湖羊肉与其他肉类相比,具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇的优点,多汁、膻味小。但湖羊产在肉性能方面与杜泊羊、德国美利奴羊等国外肉用绵羊品种还存在较大差异。因此，非常有必要对湖羊生长性能进行选育，提高湖羊的产肉性能。
3.本技术人已有授权中国发明专利(公开号：cn109251986a、cn109182553a、cn109251987a、cn109251985a、cn109182554a和cn109055579a)公开了利用gwas技术筛选的湖羊体尺性状候选功能基因及snps，并通过snps的群体验证，获得了可用于分子标记辅助育种的snps，可用于湖羊肉用性状分子标记辅助育种和湖羊肉用系核心群个体的早期选育。
4.前期，本技术人还申请了中国发明专利申请(cn114381531a、cn114438232a、cn114574596a、cn114480676a)公开了在arhgap24基因内含子1部分区内有15个snps,其中与湖羊体重、体尺性状显著相关的snps位点有4个：1.g.43756g＞a与湖羊体长显著相关，aa型个体的体长显著高于ga型个体(p＜0.05)，gg型个体与ga，aa型个体相比差异不显著(p＞0.05)。2.g.43815g＞a与湖羊体高显著相关，aa型个体的体高显著高于gg型个体(p＜0.05)，ga型个体与gg，aa型个体相比差异不显著(p＞0.05)。3.g.43851g＞a与湖羊体长显著相关，aa型个体的体长显著高于ga型个体(p＜0.05)，gg型个体与ga，aa型个体相比差异不显著(p＞0.05)。4.g.43917a＞g与湖羊体长和日增重显著相关，aa与gg型个体的体长显著高于ag型个体(p＜0.05)，aa与gg相比差异不显著(p＞0.05)，gg型个体断奶到六月龄日增重显著高于aa型个体，ag型个体与aa，gg相比差异不显著。
5.钙蛋白酶(calpain,capn)，是一类存在于脊椎动物细胞质中的钙依赖性半胱氨酸中性蛋白水解酶，与钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,cast)和钙蛋白酶激活蛋白(calpain activator)构成依赖于钙离子的蛋白水解酶系统，对动物宰后肌肉成熟嫩化过程有重要作用。capn3(calpain3)也称为p94，是钙蛋白酶基因家族的成员之一，骨骼肌中特异性表达的钙蛋白酶。capn3的结构与capn1和capn2的大亚基相似，有四个结构域；i、ii、iii和iv，三个capn3的特殊序列，分别是ns、is1和is2，位于n端、dii蛋白酶结构域和diii与div ca2-d之间、diii和div位于结合域之间。在人体中capn3基因缺陷可引起人的2a型肢带型肌营养不良。
6.在家畜中已经发现了多个snps，并且与肌肉的生长发育有关。文献(zhou h,
hickford jg,fang q.single nucleotide polymorphisms of the ovine calpain 3(capn3)gene.mol cell probes 2007；21:78-79.)公开了在美利奴羊，考力代羊、罗姆尼羊、无角陶赛特羊的capn3基因的外显子10上发现了3个snps。文献“zhang zr,liu yp,yao yg et al.identification and association of the single nucleotide polymorphisms in calpain3(capn3)gene with carcass traits in chickens.bmc genet 2009；10:10.”公开了cnp3的11818t》a与鸡的活重、全净膛率、胸肌率、腿肌率显著相关，12814t》g与鸡的活重、胴体重、胸肌重、腿肌重与半净膛率显著相关。文献“chung h,choi b,jang g et al.effect of variants in the ovine skeletal-muscle-specific calpain gene on body weight.j appl genet 2007；48:61-68.”公开了capn3基因的1112位与绵羊的初生重显著相关。文献“fel
í
cio am,boschiero c,balieiro jc et al.identification and association of polymorphisms in capn1 and capn3 candidate genes related to performance and meat quality traits in chickens.genet mol res 2013；12:472-482.”公开了capn3基因的g.15486c》a t与鸡的腿肌重，水分损失以及剪切力显著相关。文献“royer am,shivers c,riley dg et al.single nucleotide polymorphisms associated with carcass traits in a population of brahman and brahman-influenced steers.genet mol res 2016；15.”公开了capn3基因的rs109050259位点与婆罗门牛的胴体质量评分显著相关。


技术实现要素：

7.为了解决分子标记育种中现有技术的欠缺和现实需要求，本发明的目的是提供一种与湖羊六月龄到周岁日增重和周岁重显著相关的snps分子标记及其检测引物对和试剂盒，并提供所述分子标记的筛选方法和在湖羊分子标记育种中的应用。
8.为了实现上述的发明目的，本技术采用了以下的技术方案：
9.一种与湖羊六月龄到周岁日增重和周岁重显著相关的snps分子标记，该分子标记定位为g.42993c＞t；其中：ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体，cc，tt的周岁重显著高于ct个体。
10.进一步，本技术提供了一种用于检测所述snps分子标记的引物对。
11.进一步，本技术提供了所述的引物对扩增获得的扩增产物，该扩增产物的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
12.进一步，本技术提供了一种用于扩增所述的扩增产物的引物对。
13.作为优选，扩增如seq id no:1序列的产物，引物对的序列如seq id no:3和seq id no:4所示；
14.扩增如seq id no:2序列的产物，引物对的序列如seq id no:5和seq id no:6所示。
15.进一步，本技术提供了一种包含所述引物对的试剂盒。
16.进一步，本技术提供了所述的snps分子标记、引物对和试剂盒在筛选六月龄到周岁日增重和周岁重性状和湖羊分子标记育种中的应用；其中：ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体，cc，tt的周岁重显著高于ct个体。
17.进一步，本技术还提供了一种筛选湖羊六月龄到周岁日增重和周岁重性状的方
法，该方法包括以下步骤：提取湖羊外周血基因组dna，采用所述的引物对进行pcr扩增，对扩增产物中所述的snps分子标记进行检测，从而筛选出湖羊的六月龄到周岁日增重和周岁重性状；其中：ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体，cc，tt的周岁重显著高于ct个体。
18.作为优选，pcr反应体系为25μl，kod onetm pcr master mix12.5μl，全血模板1μl，上下游引物各0.2μl，ddh2o 11.1μl；反应程序为：98℃变性10s，退火30s，68℃延伸30s，扩增34个循环，pcr结束后4℃保存。
19.进一步本发明还公开了所述的方法在湖羊分子标记育种中的应用。
20.本发明以湖羊为研究对象，以capn3基因为候选基因，采用pcr扩增，产物直接测序以及序列分析技术，探讨试验湖羊群体的遗传结构，遗传多样性，并将snps与湖羊的生长性状进行关联分析，以期筛选出显著影响湖羊生长性状的snps,，并与其生长性状进行关联分析，以期为湖羊的选育提供有效的分子标记，为今后绵羊育种提供理论依据。其中：g.42993c＞t与六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体(p＜0.05)，cc，tt的周岁重显著高于ct个体(p＜0.05)。该分子标记能在湖羊分子标记育种中的应用。
附图说明
21.图1：pcr扩增结果电泳图(m:marker dl5000)；注：泳道1-4为1f+1r扩增结果，泳道5-8为2f+2r扩增结果。
具体实施方式
22.下面通过实施例对本发明做进一步说明。
23.1材料与方法
24.1.1试验材料
25.试验湖羊320只，均来自来自杭州庞大农业，饲养标准与环境一致，逐个测量记录体重与体尺数据，进行颈静脉采血10ml，置于edta抗凝管，-20℃保存。
26.1.2引物的设计及pcr扩增
27.引物的设计根据ensembl公布的绵羊capn3基因序列(acc:hgnc:1480)，利用dnaman8.0设计引物，引物的序列如表1
28.表1湖羊capn3基因pcr扩增引物
[0029][0030]
1.4pcr扩增
[0031]
pcr反应体系为25μl，kod onetm pcr master mix(toyobo,日本)12.5μl，模板1μl(全血)，上下游引物各0.2μl，ddh2o 11.1μl。反应程序为：98℃变性10s，退火30s，68℃延伸30s，扩增34个循环，pcr结束后4℃保存。
[0032]
1.5pcr产物测序及序列分析
[0033]
每个样品均按照表1列出的引物分别进行扩增，扩增产物交由安徽通用生物测序。使用mutation surveyor 5.02(softgenetics，美国)软件分析每个个体的正、反向测序峰图，以ensembl公布的绵羊capn3基因序列(acc:hgnc:1480)为参照序列，确定每个个体突变位置和突变方式。
[0034]
1.6数据统计与分析
[0035]
根据测序结果使用popgen 32软件计算各snps的位点杂合度、shannon信息含量、基因频率、基因型频率，hardy-weinberg平衡。使用little programe计算pic值，spss21.0软件中的单因素方差分析(anova)进行多重比较，分析多态性位点与湖羊的生长性状的相关性。
[0036]
关联分析
[0037]
使用一般线性模型(general linear model，glm；spss 20)挖掘与湖羊肉用新类群核心群体重、体尺性状关联的snps。
[0038]
由于分析的所有个体均为来自同一饲养场，相同饲养环境和管理条件的雌性羊只，因此数据建模时不包括场效应和性别效应。
[0039]
具体模型为：y＝xβ+e
[0040]
其中，y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状、体重性状表型值向量；
[0041]
β：表型均值、snp等固定效应向量；
[0042]
e：残差效应向量；
[0043]
x为β的关联矩阵。
[0044]
当y为湖羊肉用新类群核心群初生重表型值向量时，按照模型y＝xβ+sα+e分析。
[0045]
其中y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状表型值向量；
[0046]
α：同胞数的固定效应向量；
[0047]
β：snp效应向量；
[0048]
e：残差效应向量；
[0049]
x、s分别为β、α的关联矩阵。
[0050]
2试验结果
[0051]
2.1pcr扩增结果
[0052]
pcr扩增结果经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带与预期品片段大小一致(分别为786bp、630bp)且没有非特异条带，可用于后期的试验。图1为pcr扩增结果电泳图(m:marker dl5000)；注：泳道1-4为1f+1r扩增结果，泳道5-8为2f+2r扩增结果。
[0053]
2.2capn3基因多态位点的遗传学分析
[0054]
通过测序分析发共发现11个snps。
[0055]
表2capn3基因snps位点的遗传参数
[0056]
[0057][0058]
多态信息含量(pic)是用来判定和分析一个遗传标识所表达的信息含量，pic》0.5是高度多态位点，0.25《pic《0.5是中度多态位点，pic《0.25是低度多态位点。
[0059]
pic值越大说明有效等位基因数与杂合度越大，该群体在此snp位点的变异性也越高，g.42944t＞g，g.43091c＞t，g.43217c＞t为低度多态，g.42772t＞g，g.42875c＞t，g.42993c＞t，g.43236t＞c，g.43289c＞g，g.55904g＞a，g.55993t＞c，g.55993t＞c，g.56067g＞a为低度多态
[0060]
表3capn3基因snps位点的hardy-weinberg平衡检验
[0061]
[0062][0063]
2.3关联分析结果
[0064]
分析结果如表4。
[0065]
表4capn3基因snps位点关联分析结果
[0066][0067]
续表4
[0068][0069]
注：同一位点同列不同小写字母上标的平均值间差异显著(p＜0.05),相同字母差异不显著(p＞0.05)。
[0070]
分析结表明：
[0071]
1、g.42772t＞g与湖羊的六月龄到周岁日增重和周岁重显著相关，tt基因型个体的断奶到六月龄重日增重显著高于显著高于tg与gg基因型个体(p＜0.05)，tg差异不显著
gg基因型(p＞0.05)，tt基因型的六月龄到周岁日增重显著高于gg基因型(p＜0.05)，tg与tt，gg相比差异不显著(p＞0.05)。
[0072]
2、g.42875c＞t与初生重，断奶到六月龄重日增重显著相关以及六月龄到周岁日增重显著相关，cc基因型的初生重显著高于ct基因型(p＜0.05)，与ct基因型相比差异不显著，ct与tt基因型相比差异不显著(p＞0.05)，cc基因型的断奶到六月龄重日增重显著高于tt，与ct比差异不显著(p＞0.05)，cc与ct比差异不显著(p＞0.05)，cc与ct基因型的六月龄到周岁日增重显著高于tt(p＜0.05)，cc与ct差异不显著(p＜0.05)。
[0073]
3、g.42993c＞t与六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体(p＜0.05)，cc，tt的周岁重显著高于ct个体(p＜0.05)。
[0074]
4、g.43236t＞c与体高，断奶到六月龄日增重，六月龄到周岁日增重以及周岁重显著相关，tt基因型的体高显著高于tc，cc个体，tc显著高于cc(p＞0.05)，tt与tc的断奶到六月龄日增重，六月龄到周岁日增重显著高于cc个体(p＜0.05)，cc基因型的周岁重显著高于tc，tt(p＜0.05)。
[0075]
5、g.43289c＞g与体高，断奶到六月龄日增重，六月龄到周岁日增重以及周岁重显著相关，cc，cg的体高，断奶到六月龄日增重，六月龄到周岁日增重显著高于gg基因型个体(p＜0.05)，gg型个体的周岁重显著高于cc与cg(p＜0.05)。
[0076]
6、g.55904g＞a与胸围，初生重显著相关，aa个体的胸围显著高于ga，gg个体(p＜0.05)，gg个体的初生重显著高于aa与ga个体(p＜0.05)。
[0077]
7、g.55993t＞c与胸围显著相关，cc基因型显著高于tt个体(p＜0.05)，与tc相比差异不显著，tt与tc相比差异不显著(p＞0.05)。
[0078]
8、g.56067g＞a与胸围，初生重显著相关，aa基因型的胸围显著高于ga与gg个体(p＜0.05)，gg与ga相比差异不显著(p＞0.05),gg个体的初生重显著高于ga，aa(p＜0.05)个体，ga与aa相比差异不显著(p＞0.05)。
[0079]
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种与湖羊六月龄到周岁日增重和周岁重显著相关的snps分子标记，其特征在于，该分子标记定位为g.42993c＞t；其中：ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体，cc，tt的周岁重显著高于ct个体。2.一种用于检测权利要求1中所述snps分子标记的引物对。3.权利要求2所述的引物对扩增获得的扩增产物，该扩增产物的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。4.一种用于扩增权利要求3所述的扩增产物的引物对。5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，扩增如seq id no:1序列的产物，引物对的序列如seq id no:3 和seq id no:4所示；扩增如seq id no:2序列的产物，引物对的序列如seq id no:5和seq id no:6所示。6.一种包含权利要求2或4或5所述引物对的试剂盒。7.权利要求1所述的snps分子标记、权利要求2或4或5所述的引物对和权利要求6所述的试剂盒在筛选六月龄到周岁日增重和周岁重性状和湖羊分子标记育种中的应用；其中：ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体，cc，tt的周岁重显著高于ct个体。8.一种筛选湖羊六月龄到周岁日增重和周岁重性状的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：提取湖羊外周血基因组dna，采用权利要求2或4或5所述的引物对进行pcr扩增，对扩增产物中权利要求1所述的snps分子标记进行检测，从而筛选出湖羊的六月龄到周岁日增重和周岁重性状；其中：ct，tt个体的六月龄到周岁日增重显著高于cc个体，cc，tt的周岁重显著高于ct个体。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，pcr 反应体系为25 μl，kod onetm pcr master mix12.5 μl，全血模板1μl，上下游引物各0.2 μl，ddh2o 11.1 μl；反应程序为：98 ℃变性10 s， 退火30 s，68 ℃延伸30 s，扩增 34 个循环，pcr 结束后4 ℃保存。10.权利要求8或9所述的方法在湖羊分子标记育种中的应用。

技术总结
本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体涉及SNPs分子标记g.42993C＞T在湖羊分子标记辅助育种中的应用。g.42993C＞T与六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关。本发明以CAPN3基因为候选基因，采用PCR扩增，产物直接测序以及序列分析技术，探讨试验湖羊群体的遗传结构，遗传多样性，并将SNPs与湖羊的生长性状进行关联分析，以期筛选出显著影响湖羊生长性状的SNPs，并与其生长性状进行关联分析，以期为湖羊的选育提供有效的分子标记，为今后绵羊育种提供理论依据。羊育种提供理论依据。羊育种提供理论依据。


技术研发人员：郭良勇 姜俊芳 褚玲娜
受保护的技术使用者：湖州市农业科技发展中心
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/7/27