一种含噬菌蛭弧菌的饲料及其制备方法与流程

1.本发明涉及饲料加工技术领域，尤其涉及一种含噬菌蛭弧菌的饲料及其制备方法。


背景技术：

2.随着人们生活水平的提高，人们对于食品的营养价值要求越来越高，水产品含有高含量蛋白、dha等的优点，收到广大消费者的喜爱。随着水产业的快速发展，进而也促进了饲料业的快速发展。水产饲料的质量、性质、营养含量对水产业、水污染发展有着至关重要的作用。
3.蛭弧菌是一种从菜豆叶烧病假单胞菌中发现的一类微小的寄生型细菌，依靠裂解宿主菌来完成自身的生长和繁殖，有类似于四军体的作用。蛭弧菌具有一般细菌的特性，革兰氏染色呈阴性，为短杆或弧状，蛭弧菌运动活跃，呈现跳跃式运动。蛭弧菌具有增强机体免疫力，提高防病能力、分解有机污染物，消除有毒物质，净化水质的作用，而并广泛应用于水产业中改善水质和提高产量。
4.随着水产业的快速发展，进而也促进了饲料业的快速发展。水产饲料的质量、性质、营养含量对水产业、水污染发展有着至关重要的作用。水产动物在水中摄食，饲料在水中须在一定时间内不分散，以便水产动物摄食，防止饲料中营养物质流失造成水污染，进而影响水产动物的健康和生长，因此对饲料的要求越来越高。


技术实现要素：

5.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种含噬菌蛭弧菌的饲料，将噬菌蛭弧菌引入饲料中，制备含噬菌蛭弧菌的饲料，蛭弧菌的存在能显著改善鱼类体质，增强免疫力。同时采用椰子油作为包裹材料，进而改善含噬菌蛭弧菌的饲料的耐水性、稳定性。
6.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按1-2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养12-18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
8.(2)膨化玉米：将10-50重量份玉米加入200-500重量份2-5wt％的碳酸氢钠溶液浸泡10-20min，再用微波处理进行膨化5-30min，其中微波功率为200-500w，得到膨化玉米；
9.(3)制备发酵培养物：将2-5重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80-120重量份步骤(2)得到的膨化玉米、1-3重量份甜味剂、1-3重量份磷酸二氢钙加入100-200重量份水中，于25-32℃发酵培养16-20h，得到发酵培养物；
10.(4)将100-200重量份上述步骤(3)得到的发酵培养物、5-15重量份大豆肽、5-20重量份羧甲基纤维素钠、3-9重量份维生素、1-3重量份微胶囊噬菌蛭弧菌菌液、10-25重量份螺旋藻粉加入30-60重量份水中，搅拌均匀，加热至30-40℃反应1-2h，得到混合物；
11.(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
12.(6)将步骤(5)得到的粉料与植物油充分混合，静置10-30min，离心、干燥，得到含
噬菌蛭弧菌的饲料，其中，粉料与植物油按质量比1：(1-3)混合。
13.所述微胶囊噬菌蛭弧菌的制备方法，包括以下步骤：将1-2ml浓度为10
6-108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液与2-4ml的2-4wt％的无菌阿拉伯胶溶液混合均匀，喷雾干干燥，得到微胶囊噬菌蛭弧菌。
14.所述的噬菌蛭弧菌菌液，由以下方法制备而成：宿主菌接入dnb液体培养基中33-37℃培养16-18h，得到浓度为10
10-10
15
cfu/ml的宿主菌悬浮液；将100-120μl宿主菌悬浮液(浓度为10
10-10
15
cfu/ml)与100-120μl噬菌蛭弧菌(浓度为103～105pfu/ml)混合加入30-50ml的dnb液体培养基中，置于转速为50-200r/min、温度为25-31℃条件下发酵培养48-72h，得到dnb发酵培养液；将上述得到的dnb发酵培养液在转速为5000-10000r/min，4℃离心10-20min，得到沉淀a和上清液a；弃去上清液a，将沉淀a加入磷酸盐缓冲液中，得到浓度为10
6-108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液；
15.所述甜味剂为葡萄糖、果糖、乳糖、低聚木糖、水苏糖中的一种或两种或两种以上混合物。
16.所述维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素e、叶酸、泛酸、生物素中的一种或两种或两种以上混合物。
17.所述宿主菌为创伤弧菌、哈维氏弧菌中的一种。
18.所述植物油为葵花籽油、玉米油、核桃油、椰子油中的一种或两种或两种以上混合物。
19.优选的，所述植物油为椰子油。
20.葵花籽油、玉米油、核桃油作为包膜剂对饲料颗粒进行处理，改善饲料的耐水性，但是本发明人发现葵花籽油、玉米油、核桃油中含有50-70％的亚油酸且亚油酸很难被鱼类消化、分解掉，进而影响鱼类的生长。而椰子油中亚油酸含量仅为2.3％易被鱼类消化吸收。
21.在上述基础上，本发明人发现游离油脂含量的存在，也会影响饲料的耐水性。本发明人进一步对椰子油进行处理，将司盘20引入椰子油中，司盘20的疏水段形成胶束内核将椰子油包裹在内，亲水端指向胶束外，与植物提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂反应，制备得到改性椰子油，包裹在含噬菌蛭弧菌的饲料颗粒之外，改善其耐水性。其可能的原因是：椰子油、司盘20、淡竹叶提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂对椰子油进行交联、共混改性，有效改善椰子油的功能和应用范围，植物提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂的存在形成独特的网状结构，具有良好的相容性，有效改善含噬菌蛭弧菌的饲料耐水性、漂浮性、稳定性，降低含噬菌蛭弧菌的饲料中有活性物质的释放速度、增加营养物质的稳定性。
22.优选的，一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
23.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按1-2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养12-18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
24.(2)膨化玉米：将10-50重量份玉米加入200-500重量份2-5wt％的碳酸氢钠溶液浸泡10-20min，再用微波处理进行膨化5-30min，其中微波功率为200-500w，得到膨化玉米；
25.(3)制备发酵培养物：将2-5重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80-120重量份步骤(2)得到的膨化玉米、1-3重量份甜味剂、1-3重量份磷酸二氢钙加入100-200重量份水中，于25-32℃发酵培养16-20h，得到发酵培养物；
26.(4)将100-200重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5-15重量份大豆肽、5-20重量份
羧甲基纤维素钠、3-9重量份维生素、1-3重量份微胶囊噬菌蛭弧菌菌液、10-25重量份螺旋藻粉加入30-60重量份水中，搅拌均匀，加热至30-40℃反应1-2h，得到混合物；
27.(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
28.(6)将步骤(5)得到的粉料、改性椰子油充分混合，静置10-30min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中，粉料与改性椰子油按质量比1：(1-3)混合。
29.优选的，所述改性椰子油的制备方法，包括以下步骤：将1-5重量份表面活性剂加入80-100重量份水中混合均匀，得到表面活性剂水溶液；将20-50重量份椰子油加入上述表面活性剂水溶液中混合均匀进行超声处理，其中超声频率为800-1000w，超声时间为2-8min，得到乳化液；将0-2重量份柠檬酸、1-3重量份植物提取物、2.5-5重量份魔芋葡甘聚糖、0-2重量份改性剂加入上述乳化液中，加热至58-80℃搅拌反应20-30min，喷雾干燥，得到改性椰子油。
30.所述改性剂为聚谷氨酸、聚精氨酸、聚亮氨酸中的一种或两种或两种混合物。
31.所述表面活性剂为司盘20。
32.优选的，所述改性剂为聚谷氨酸、聚精氨酸按质量比(1-3)：(1-3)混合。
33.所述植物提取物为淡竹叶提取物；所述的淡竹叶提取物的制备方法，包括以下步骤：将淡竹叶烘干，粉碎，得到淡竹叶粉末；将淡竹叶粉末与水按质量比1:(5-25)混合均匀进行微波处理，其中微波功率为800-1000w，时间1-2min，减压浓缩，浓缩至相对密度为1-1.05g/ml，得到淡竹叶浓缩液；将0.2-1重量份纤维素酶加入50-100重量份淡竹叶浓缩液，于50-60℃反应1-2h，冷冻干燥，得到淡竹叶提取物。
34.本发明的有益效果：本发明将噬菌蛭弧菌引入饲料中，制备含噬菌蛭弧菌的饲料，蛭弧菌的存在能显著改善鱼类体质，增强免疫力。同时以膨化玉米为原料，采用发酵乳杆菌菌液对膨化玉米进行发酵，得到发酵培养物。同时将发酵培养物、大豆肽、螺旋藻粉配合制备得到营养丰富、适口性好的含噬菌蛭弧菌的饲料。同时采用椰子油作为包裹材料，进而改善含噬菌蛭弧菌的饲料的耐水性、稳定性同时易被鱼类消化吸收。
35.本发明人进一步对椰子油进行处理，将司盘20引入椰子油中，司盘20的疏水段形成胶束内核将椰子油包裹在内，亲水端指向胶束外，与植物提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂反应，制备得到改性椰子油，包裹在含噬菌蛭弧菌的饲料颗粒之外，改善其耐水性。其可能的原因是：椰子油、司盘20、植物提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂对椰子油进行交联、共混改性，有效改善椰子油的功能和应用范围，淡竹叶提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂的存在形成独特的网状结构，具有良好的相容性，有效改善含噬菌蛭弧菌的饲料耐水性、漂浮性、稳定性，降低含噬菌蛭弧菌的饲料中有活性物质的释放速度、增加营养物质的稳定性。
36.本发明通过加入纤维素酶分散淡竹叶提取物中的果胶、纤维素等，进而有利于有效成分的提取。
具体实施方式
37.下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
38.磷酸盐缓冲液：量取0.2mol/l的磷酸二氢钠(3.12g二水合磷酸二氢钠定容至100ml)28ml和0.2mol/l磷酸氢二钠(5.36g七水合磷酸氢二钠定容至100ml)72ml混合均匀，
用水定容至200ml，即为0.1mol/l的pbs溶液，ph为7.2。
39.dnb液体培养基是将0.8重量份营养肉汤、0.5重量份酪蛋白酸水解物、0.1重量份酵母精提物溶于1000ml水中，调节ph为7.2；灭菌条件：121℃，15min。
40.mrs液体培养基为：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，吐温80 1.0g，k2hpo
4 2.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，mnso4·
h2o 0.05g，caco
3 20.0g，琼脂15.0g，水1.0l，ph6.8，灭菌条件：121℃，15min。
41.淡竹叶，为禾本科，淡竹叶属多年生草本植物，根状茎。
42.发酵乳杆菌：lactobacillus fermentum，编号cgmcc1.15608；创伤弧菌：vibrio vulnificus，编号atcc33147；噬菌蛭弧菌：bdellovibrio bacteriovorus，编号atcc 15364；来源均是购买。
43.大豆肽，分子量500-700，食品级，大豆肽有效物质含量为99％，购买自南京松冠生物科技有限公司。
44.螺旋藻粉，cas号：724424-92-4，食品级，螺旋藻粉有效含量为99％，购买自陕西晨明生物科技有限公司。
45.魔芋葡甘聚糖，cas号：37220-17-0，纯度：95％，购买自武汉远成共创科技有限公司。
46.聚谷氨酸，分子量为100kda-10000kda，cas号：25513-46-6，食品级，纯度：99％，购买自西安拉维亚生物科技有限公司。
47.聚精氨酸，mw为35500，购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
48.实施例1
49.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
50.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
51.(2)膨化玉米：将10重量份玉米加入200重量份2wt％的碳酸氢钠溶液浸泡20min，再用微波处理进行膨化30min，其中微波功率为300w，得到膨化玉米；
52.(3)制备发酵培养物：将2重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80重量份步骤(2)得到的膨化玉米、2重量份甜味剂、1重量份磷酸二氢钙加入100重量份水中，于32℃发酵培养20h，得到发酵培养物；
53.(4)将100重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5重量份大豆肽、5重量份羧甲基纤维素钠、3重量份维生素、1重量份微胶囊噬菌蛭弧菌、10重量份螺旋藻粉加入50重量份水中，搅拌均匀，加热至38℃反应2h，得到混合物；
54.(5)将步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
55.(6)将步骤(5)得到的粉料与植物油充分混合，静置20min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中粉料与植物油按质量比1：1.5混合。
56.所述微胶囊噬菌蛭弧菌的制备方法，包括以下步骤：将浓度为106pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液与2wt％的无菌阿拉伯胶溶液混合均匀，喷雾干干燥，得到微胶囊噬菌蛭弧菌。
57.所述的噬菌蛭弧菌菌液，由以下方法制备而成：宿主菌接入dnb液体培养基中37℃培养16h，得到浓度为10
10
cfu/ml的宿主菌悬浮液；将100μl宿主菌悬浮液(浓度为10
10
cfu/ml)与100μl噬菌蛭弧菌(浓度为103pfu/ml)混合加入30ml的dnb液体培养基中，置于转速为
200r/min、温度为31℃条件下发酵培养72h，得到dnb发酵培养液；将上述得到的dnb发酵培养液在转速为10000r/min，4℃离心10min，得到沉淀a和上清液a；弃去上清液a，将沉淀a加入磷酸盐缓冲液中，得到浓度为108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液；
58.所述甜味剂为果糖。
59.所述维生素为维生素c。
60.所述宿主菌为创伤弧菌。
61.所述植物油为椰子油。
62.实施例2
63.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
64.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
65.(2)膨化玉米：将10重量份玉米加入200重量份2wt％的碳酸氢钠溶液浸泡20min，再用微波处理进行膨化30min，其中微波功率为300w，得到膨化玉米；
66.(3)制备发酵培养物：将2重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80重量份步骤(2)得到的膨化玉米、2重量份甜味剂、1重量份磷酸二氢钙加入100重量份水中，于32℃发酵培养20h，得到发酵培养物；
67.(4)将100重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5重量份大豆肽、5重量份羧甲基纤维素钠、3重量份维生素、1重量份微胶囊噬菌蛭弧菌、10重量份螺旋藻粉加入50重量份水中，搅拌均匀，加热至38℃反应2h，得到混合物；
68.(5)将步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
69.(6)将步骤(5)得到的粉料、改性椰子油充分混合，静置20min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中粉料与改性椰子油按质量比1：1.5混合。
70.所述微胶囊噬菌蛭弧菌的制备方法，包括以下步骤：将1ml浓度为106pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液与2ml的2wt％的无菌阿拉伯胶溶液混合均匀，喷雾干燥，得到微胶囊噬菌蛭弧菌。
71.所述的噬菌蛭弧菌菌液由以下方法制备而成：宿主菌接入dnb液体培养基中37℃培养16h，得到浓度为10
10
cfu/ml的宿主菌悬浮液；将100μl宿主菌悬浮液(浓度为10
10
cfu/ml)与100μl噬菌蛭弧菌(浓度为103pfu/ml)混合加入30ml的dnb液体培养基中，置于转速为200r/min、温度为31℃条件下发酵培养72h，得到dnb发酵培养液；将上述得到的dnb发酵培养液在转速为10000r/min，4℃离心10min，得到沉淀a和上清液a；弃去上清液a，将沉淀a加入磷酸盐缓冲液中，得到浓度为108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液；
72.所述甜味剂为果糖。
73.所述维生素为维生素c。
74.所述宿主菌为创伤弧菌。
75.所述改性椰子油的制备方法，包括以下步骤：将2重量份表面活性剂加入80重量份水中混合均匀，得到表面活性剂水溶液；将60重量份椰子油加入上述表面活性剂水溶液中混合均匀进行超声处理，其中超声频率为800w，超声时间为2min，得到乳化液；将1.5重量份柠檬酸、2重量份植物提取物、3重量份魔芋葡甘聚糖、1重量份改性剂加入上述乳化液中，加热至65℃搅拌反应20min，喷雾干燥，得到改性椰子油。
76.所述表面活性剂为司盘20。
77.所述改性剂为聚谷氨酸、聚精氨酸按质量比1：2混合。
78.所述植物提取物为淡竹叶提取物；所述的淡竹叶提取物的制备方法，包括以下步骤：将淡竹叶烘干，粉碎，得到淡竹叶粉末；将淡竹叶粉末与水按质量比1:20混合均匀进行微波处理，其中微波功率为1000w，时间1min，减压浓缩，浓缩至相对密度为1.05g/ml，得到淡竹叶浓缩液；将0.2重量份纤维素酶加入50重量份淡竹叶浓缩液，于60℃反应2h，冷冻干燥，得到淡竹叶提取物。
79.实施例3
80.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
81.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
82.(2)膨化玉米：将10重量份玉米加入200重量份2wt％的碳酸氢钠溶液浸泡20min，再用微波处理进行膨化30min，其中微波功率为300w，得到膨化玉米；
83.(3)制备发酵培养物：将2重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80重量份步骤(2)得到的膨化玉米、2重量份甜味剂、1重量份磷酸二氢钙加入100重量份水中，于32℃发酵培养20h，得到发酵培养物；
84.(4)将100重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5重量份大豆肽、5重量份羧甲基纤维素钠、3重量份维生素、1重量份微胶囊噬菌蛭弧菌、10重量份螺旋藻粉加入50重量份水中，搅拌均匀，加热至38℃反应2h，得到混合物；
85.(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
86.(6)将步骤(5)得到的粉料、改性椰子油充分混合，静置20min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中粉料与改性椰子油按质量比1：1.5混合。
87.所述微胶囊噬菌蛭弧菌的制备方法，包括以下步骤：将1ml浓度为106pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液与2ml的2wt％的无菌阿拉伯胶溶液混合均匀，喷雾干燥，得到微胶囊噬菌蛭弧菌。
88.所述的噬菌蛭弧菌菌液，由以下方法制备而成：宿主菌接入dnb液体培养基中37℃培养16h，得到浓度为10
10
cfu/ml的宿主菌悬浮液；将100μl宿主菌悬浮液(浓度为10
10
cfu/ml)与100μl噬菌蛭弧菌(浓度为103pfu/ml)混合加入30ml的dnb液体培养基中，置于转速为200r/min、温度为31℃条件下发酵培养72h，得到dnb发酵培养液；将上述得到的dnb发酵培养液在转速为10000r/min，4℃离心10min，得到沉淀a和上清液a；弃去上清液a，将沉淀a加入磷酸盐缓冲液中，得到浓度为108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液；
89.所述甜味剂为果糖。
90.所述维生素为维生素c。
91.所述宿主菌为创伤弧菌。
92.所述改性椰子油的制备方法，包括以下步骤：将2重量份表面活性剂加入80重量份水中混合均匀，得到表面活性剂水溶液；将60重量份椰子油加入所述的表面活性剂水溶液中混合均匀进行超声处理，其中超声频率为800w，超声时间为2min，得到乳化液；将1.5重量份柠檬酸、2重量份植物提取物、3重量份魔芋葡甘聚糖、1重量份改性剂加入上述乳化液中，加热至65℃搅拌反应20min，喷雾干燥，得到改性椰子油。
93.所述表面活性剂为司盘20。
94.所述改性剂为聚谷氨酸。
95.所述植物提取物为淡竹叶提取物；所述的淡竹叶提取物的制备方法，包括以下步骤：将淡竹叶烘干，粉碎，得到淡竹叶粉末；将淡竹叶粉末与水按质量比1:20混合均匀进行微波处理，其中微波功率为1000w，时间1min，减压浓缩，浓缩至相对密度为1.05g/ml，得到淡竹叶浓缩液；将0.2重量份纤维素酶加入50重量份淡竹叶浓缩液，于60℃反应2h，冷冻干燥，得到淡竹叶提取物。
96.实施例4
97.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
98.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
99.(2)膨化玉米：将10重量份玉米加入200重量份2wt％的碳酸氢钠溶液浸泡20min，再用微波处理进行膨化30min，其中微波功率为300w，得到膨化玉米；
100.(3)制备发酵培养物：将2重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80重量份步骤(2)得到的膨化玉米、2重量份甜味剂、1重量份磷酸二氢钙加入100重量份水中，于32℃发酵培养20h，得到发酵培养物；
101.(4)将100重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5重量份大豆肽、5重量份羧甲基纤维素钠、3重量份维生素、1重量份微胶囊噬菌蛭弧菌、10重量份螺旋藻粉加入50重量份水中，搅拌均匀，加热至38℃反应2h，得到混合物；
102.(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
103.(6)将步骤(5)得到的粉料、改性椰子油充分混合，静置20min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中粉料与改性椰子油按质量比1：1.5混合。
104.所述微胶囊噬菌蛭弧菌的制备方法，包括以下步骤：将1ml浓度为106pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液与2ml的2wt％的无菌阿拉伯胶溶液混合均匀，喷雾干干燥，得到微胶囊噬菌蛭弧菌。
105.所述的噬菌蛭弧菌菌液，由以下方法制备而成：宿主菌接入dnb液体培养基中37℃培养16h，得到浓度为10
10
cfu/ml的宿主菌悬浮液；将100μl宿主菌悬浮液(浓度为10
10
cfu/ml)与100μl噬菌蛭弧菌(浓度为103pfu/ml)混合加入30ml的dnb液体培养基中，置于转速为200r/min、温度为31℃条件下发酵培养72h，得到dnb发酵培养液；将上述得到的dnb发酵培养液在转速为10000r/min，4℃离心10min，得到沉淀a和上清液a；弃去上清液a，将沉淀a加入磷酸盐缓冲液中，得到浓度为108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液；
106.所述甜味剂为果糖。
107.所述维生素为维生素c。
108.所述宿主菌为创伤弧菌。
109.所述改性椰子油的制备方法，包括以下步骤：将2重量份表面活性剂加入80重量份水中混合均匀，得到表面活性剂水溶液；将60重量份椰子油加入所述的表面活性剂溶液中混合均匀进行超声处理，其中超声频率为800w，超声时间为2min，得到乳化液；将1.5重量份柠檬酸、2重量份植物提取物、3重量份魔芋葡甘聚糖、1重量份改性剂加入上述乳化液中，加热至65℃搅拌反应20min，喷雾干燥，得到改性椰子油。
110.所述表面活性剂为司盘20。
111.所述改性剂为聚精氨酸。
112.所述植物提取物为淡竹叶提取物；所述的淡竹叶提取物的制备方法，包括以下步骤：将淡竹叶烘干，粉碎，得到淡竹叶粉末；将淡竹叶与水按质量比1:20混合均匀进行微波处理，其中微波功率为1000w，时间1min，减压浓缩，浓缩至相对密度为1.05g/ml，得到淡竹叶浓缩液；将0.2重量份纤维素酶加入50重量份淡竹叶浓缩液，于60℃反应2h，冷冻干燥，得到淡竹叶提取物。
113.对比例1
114.与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述植物油为葵花籽油。
115.对比例2
116.与实施例2基本相同，区别仅仅在于：所述的淡竹叶提取物的制备方法，包括以下步骤：将淡竹叶烘干，粉碎，得到淡竹叶粉末；将淡竹叶与水按质量比1:20混合均匀进行微波处理，其中微波功率为1000w，时间1min，减压浓缩，浓缩至相对密度为1.05g/ml，得到淡竹叶浓缩液；冷冻干燥，得到淡竹叶提取物。
117.对比例3
118.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：
119.(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；
120.(2)膨化玉米：将10重量份玉米加入200重量份2wt％的碳酸氢钠溶液浸泡20min，再用微波处理进行膨化30min，其中微波功率为300w，得到膨化玉米；
121.(3)制备发酵培养物：将2重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80重量份步骤(2)得到的膨化玉米、2重量份甜味剂、1重量份磷酸二氢钙加入100重量份水中，于32℃发酵培养20h，得到发酵培养物；
122.(4)将100重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5重量份大豆肽、5重量份羧甲基纤维素钠、3重量份维生素、10重量份螺旋藻粉加入50重量份水中，搅拌均匀，加热至38℃反应2h，得到混合物；
123.(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；
124.(6)将步骤(5)得到的粉料与植物油充分混合，静置20min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中粉料与植物油按质量比1：1.5混合。
125.所述甜味剂为果糖。
126.所述维生素为维生素c。
127.所述植物油为椰子油。
128.对比例4
129.与实施例2基本相同，区别仅仅在于：所述改性椰子油的制备方法，包括以下步骤：将2重量份表面活性剂加入80重量份水中混合均匀，得到表面活性剂水溶液；将60重量份椰子油加入所述的表面活性剂溶液中混合均匀进行超声处理，其中超声频率为800w，超声时间为2min，得到乳化液；将1.5重量份柠檬酸、3重量份魔芋葡甘聚糖、1重量份改性剂加入上述乳化液中，加热至65℃搅拌反应20min，喷雾干燥，得到改性椰子油。
130.所述表面活性剂为司盘20。
131.所述改性剂为聚谷氨酸、聚精氨酸按质量比1：2混合。
132.测试例1
133.饲养效果测试：挑选来源于同一苗种场、大小均匀、健康的规格草鱼苗810尾，初体重73
±
2克，将草鱼苗随机分为9组，设置一个对照组和八个实验组，每组设置三个平行，每组平行养殖30尾鱼苗；分别饲养于池塘网箱中，网箱规格为2m
×
2m
×
2.5m。对照组投喂市售的饲料，八个实验组分别投喂实施例1-4、对比例1-4制备的含噬菌蛭弧菌的饲料，每天的投喂量为草鱼鱼苗体重的1.5％，每天分别于8：00和18：00各投喂一次。每2周称重一次，以调整投喂量。实验持续8周。
134.各指标计算公式如下：
135.增重率(％)＝100
×
[末均重(g)－初均重(g)]/初均重(g)
[0136]
成活率(％)＝100
×
终末尾数/初始尾数
[0137]
表1含噬菌蛭弧菌的饲料的饲养效果测试
[0138][0139][0140]
通过实施例1和对比例1进行对比发现，葵花籽油作为包膜剂对饲料颗粒进行处理，改善饲料的耐水性，但是本发明人发现植物油中含有50-70％的亚油酸且亚油酸很难被鱼类消化、分解掉，进而影响鱼类的生长。而椰子油中亚油酸含量仅为2.3％易被鱼类消化吸收。
[0141]
通过实施例1和对比例3进行对比发现，本发明将噬菌蛭弧菌引入饲料中，制备含噬菌蛭弧菌的饲料，蛭弧菌的存在能显著改善鱼类体质，增强免疫力。
[0142]
测试例2
[0143]
水中稳定性测试：对实施例1-4和对比例1-4中的含噬菌蛭弧菌的饲料参照gb/t 36205-2018《草鱼配合饲料》和sc/t1077-2004《渔用配合饲料通用技术要求》附录a中a.2颗粒饲料水中溶失率的测定进行水中稳定性(溶失率)测试。
[0144]
表2含噬菌蛭弧菌的饲料的水中稳定性测试
[0145] 水中稳定性(溶失率)/％
实施例17.2实施例25.4实施例35.9实施例46.3对比例17.4对比例25.7对比例37.6对比例46.8
[0146]
通过实施例1-2进行对比，本发明人进一步对椰子油进行处理，将司盘20引入椰子油中，司盘20的疏水段形成胶束内核将椰子油包裹在内，亲水端指向胶束外，与植物提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂反应，制备得到改性椰子油，包裹在含噬菌蛭弧菌的饲料颗粒之外，改善其耐水性。其可能的原因是：椰子油、司盘20、淡竹叶提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂对椰子油进行交联、共混改性，有效改善椰子油的功能和应用范围，淡竹叶提取物、魔芋葡甘聚糖、改性剂的存在形成独特的网状结构，具有良好的相容性，有效改善含噬菌蛭弧菌的饲料耐水性、漂浮性、稳定性，降低含噬菌蛭弧菌的饲料中有活性物质的释放速度、增加营养物质的稳定性。
[0147]
通过实施例2-4进行对比，采用聚谷氨酸、聚精氨酸改性椰子油，椰子油、司盘20、淡竹叶提取物、魔芋葡甘聚糖、聚谷氨酸、聚精氨酸对椰子油进行交联、共混改性，有效改善椰子油的功能和应用范围，淡竹叶提取物、魔芋葡甘聚糖、聚谷氨酸、聚精氨酸的存在形成独特的网状结构，同时聚谷氨酸、聚精氨酸协同作用，有效改善含噬菌蛭弧菌的饲料耐水性、漂浮性、稳定性。
[0148]
通过实施例2与对比例2进行对比，本发明通过加入纤维素酶分散淡竹叶提取物中的果胶、纤维素等，进而有利于有效成分的提取，从而具有良好的相容性，有效改善含噬菌蛭弧菌的饲料耐水性、漂浮性、稳定性。

技术特征：
1.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按1-2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养12-18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；(2)膨化玉米：将10-50重量份玉米加入200-500重量份2-5wt％的碳酸氢钠溶液浸泡10-20min，再用微波处理进行膨化5-30min，其中微波功率为200-500w，得到膨化玉米；(3)制备发酵培养物：将2-5重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80-120重量份步骤(2)得到的膨化玉米、1-3重量份甜味剂、1-3重量份磷酸二氢钙加入100-200重量份水中，于25-32℃发酵培养16-20h，得到发酵培养物；(4)将100-200重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5-15重量份大豆肽、5-20重量份羧甲基纤维素钠、3-9重量份维生素、1-3重量份微胶囊噬菌蛭弧菌菌液、10-25重量份螺旋藻粉加入30-60重量份水中，搅拌均匀，加热至30-40℃反应1-2h，得到混合物；(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；(6)将步骤(5)得到的粉料与植物油充分混合，静置10-30min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中，粉料与植物油按质量比1：(1-3)混合。2.一种含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，包括以下步骤：(1)制备发酵乳杆菌菌液：将发酵乳杆菌按1-2vol％接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养12-18h进行活化，得到发酵乳杆菌菌液；(2)膨化玉米：将10-50重量份玉米加入200-500重量份2-5wt％的碳酸氢钠溶液浸泡10-20min，再用微波处理进行膨化5-30min，其中微波功率为200-500w，得到膨化玉米；(3)制备发酵培养物：将2-5重量份步骤(1)得到的发酵乳杆菌菌液、80-120重量份步骤(2)得到的膨化玉米、1-3重量份甜味剂、1-3重量份磷酸二氢钙加入100-200重量份水中，于25-32℃发酵培养16-20h，得到发酵培养物；(4)将100-200重量份步骤(3)得到的发酵培养物、5-15重量份大豆肽、5-20重量份羧甲基纤维素钠、3-9重量份维生素、1-3重量份微胶囊噬菌蛭弧菌菌液、10-25重量份螺旋藻粉加入30-60重量份水中，搅拌均匀，加热至30-40℃反应1-2h，得到混合物；(5)将上述步骤(4)得到的混合物造粒、烘干，得到粉料；(6)将步骤(5)得到的粉料、改性椰子油充分混合，静置10-30min，离心、干燥，得到含噬菌蛭弧菌的饲料，其中，粉料、改性椰子油按质量比1：(1-3)混合。3.如权利要求1或2所述的含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，所述的噬菌蛭弧菌菌液，包括以下步骤：宿主菌接入dnb液体培养基中33-37℃培养16-18h，得到浓度为10
10-10
15
cfu/ml的宿主菌悬浮液；将100-120μl宿主菌悬浮液(浓度为10
10-10
15
cfu/ml)与100-120μl噬菌蛭弧菌(浓度为103～105pfu/ml)混合加入30-50ml的dnb液体培养基中，置于转速为50-200r/min、温度为25-31℃条件下发酵培养48-72h，得到dnb发酵培养液；将上述得到的dnb发酵培养液在转速为5000-10000r/min，4℃离心10-20min，得到沉淀a和上清液a，弃去上清液a，将沉淀a加入磷酸盐缓冲液中，得到浓度为10
6-108pfu/ml的噬菌蛭弧菌菌液。4.如权利要求1或2所述的含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，所述宿主菌为创伤弧菌、哈维氏弧菌中的一种。5.如权利要求1所述的含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，所述植物油为葵
花籽油、玉米油、核桃油、椰子油中的一种或两种或两种以上混合物。6.如权利要求1所述的含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，所述植物油为椰子油。7.如权利要求2所述的含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，所述改性椰子油的制备方法，包括以下步骤：将1-5重量份表面活性剂加入80-100重量份水中混合均匀，得到表面活性剂水溶液；将20-50重量份椰子油加入上述表面活性剂水溶液中混合均匀进行超声处理，其中超声频率为800-1000w，超声时间为2-8min，得到乳化液；将0-2重量份柠檬酸、1-3重量份植物提取物、2.5-5重量份魔芋葡甘聚糖、0-2重量份改性剂加入上述乳化液中，加热至58-80℃搅拌反应20-30min，喷雾干燥，得到改性椰子油。8.如权利要求7所述的含噬菌蛭弧菌的饲料的制备方法，其特征在于，所述的淡竹叶提取物的制备方法，包括以下步骤：将淡竹叶烘干，粉碎，得到淡竹叶粉末；将淡竹叶粉末与水按质量比1:(5-25)混合均匀进行微波处理，其中微波功率为800-1000w，时间1-2min，减压浓缩，浓缩至相对密度为1-1.05g/ml，得到淡竹叶浓缩液；将0.2-1重量份纤维素酶加入50-100重量份淡竹叶浓缩液，于50-60℃反应1-2h，冷冻干燥，得到淡竹叶提取物。9.一种含噬菌蛭弧菌的饲料，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述方法制作而成。

技术总结
本发明公开了一种含噬菌蛭弧菌的饲料及制备方法。本发明将噬菌蛭弧菌引入饲料中，制备含噬菌蛭弧菌的饲料，蛭弧菌的存在能显著改善鱼类体质，增强免疫力。同时以膨化玉米为原料，采用发酵乳杆菌菌液对膨化玉米进行发酵，得到发酵培养物。同时将发酵培养物、大豆肽、螺旋藻粉配合制备得到营养丰富、适口性好的含噬菌蛭弧菌的饲料。同时采用椰子油作为包裹材料，进而改善含噬菌蛭弧菌的饲料的耐水性、稳定性同时易被鱼类消化吸收。定性同时易被鱼类消化吸收。


技术研发人员：林江一
受保护的技术使用者：上海乾界生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/27