一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光PCR引物和探针组合以及试剂盒的制作方法

一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合以及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合以及试剂盒。


背景技术：

2.蓝点马鲛(scomberomorus niphoius)隶属于鲈形目、鲅科、马鲛属，又称为燕鲅鱼，是黄海、渤海产量最高的经济鱼类。蓝点马鲛肉多刺少，肉质坚实紧密，味道鲜美，营养丰富，含丰富蛋白质、维生素a、钙等营养元素，且氨基酸含量很高，种类多大几十种，可提高人体免疫力，蓝点马鲛鱼肉中胆固醇含量很低，适合各种人群食用，除此之外，蓝点马鲛还有补气、平咳作用，对体弱咳喘有一定疗效。与其他普通鱼肉相比，蓝点马鲛的营养价值更高，是我国重要的食用鱼类之一，是罐头、咸干品等鱼肉制品的主要原料。
3.但是，蓝点马鲛体内含有丰富的游离组氨酸，并存在产组胺的微生物，在适宜条件下极易产生组胺，属于高组胺鱼类。食用高组胺鱼肉后，敏感人群会表现出皮疹、荨麻疹、呕吐、头痛等不适症状，也即出现组胺中毒问题。因此，建立一种准确定量检测鱼肉制品中蓝点马鲛成分的方法，对于防止敏感人群食入蓝点马鲛鱼肉制品后导致过敏现象的发生具有重要意义。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提供一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合以及试剂盒，利用该检测蓝点马鲛的引物和探针可快速准确地检测出鱼肉制品中是否含有蓝点马鲛成分，且特异性好，灵敏度高，具有较高的实用价值。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合，所述引物对的序列如下：
7.上游引物-f：5
′‑
aacaacgagggcttacatttcg-3
′
(seq id no:1)，
8.下游引物-r：5
′‑
cgtctgcgatgagggttca-3
′
(seq id no:2)；
9.所述探针p的序列为：5
′‑
caatctcccagttctt-3
′
(seq id no:3)。
10.本发明以蓝点马鲛线粒体细胞色素b(cytb)基因序列为基础设计引物对和探针，提供的引物和探针组合可以特异性地扩增出蓝点马鲛的dna，准确检测出蓝点马鲛成分；用所述引物和探针对蓝点马鲛以及蓝点马鲛的16种亲缘近似种和生态近似种(鳕鱼、秋刀鱼、日本鲭、蓝圆鰺、沙丁鱼、青干金枪鱼、低眼巨鲶、虹鳟、鲤鱼、鲶鱼、鲅鱼、罗非鱼、河豚鱼(红鳍)、鲣鱼、竹筴鱼、巴沙鱼)的基因组dna进行实时荧光pcr扩增检测，该实时荧光pcr检测用引物和探针只能，在含有以蓝点马鲛的基因组dna为模板的体系中得到扩增产物，其他亲缘近似种和生态近似种都无法得到扩增产物，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，对蓝点马鲛dna的最低检测限为10pg/μl，能够实现蓝点马鲛的快速检测，同时，检测的准确度
高，用时短，填补了蓝点马鲛检测的空白，对于保障大众的饮食健康具有重要的意义，在鱼肉制品的快速检测领域具有良好的应用前景。
11.优选的，所述探针的5
′
端标记有荧光素，3
′
端标记有荧光猝灭基团。
12.进一步地，所述荧光素为fam，所述荧光猝灭基团为mgb-nfq。
13.进一步地，所述探针p为：5
′‑
fam-caatctcccagttctt-mgb-nfq-3
′
。
14.第二方面，本发明还提供了上述任一项所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中蓝点马鲛中的应用。
15.第三方面，本发明还提供了一种用于检测蓝点马鲛的试剂盒，包含上述任一项所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合。
16.优选的，所述试剂盒还包括perfectstart ii probe qpcr supermix和ddh2o。
17.通过本发明设计的用于检测蓝点马鲛的试剂盒能够快速准确的从众多蓝点马鲛亲缘近似种和生态近似种中检测出蓝点马鲛，检测方法简单快捷，检测结果准确高，对蓝点马鲛的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。
18.第四方面，本发明还提供利用上述试剂盒检测鱼肉制品中蓝点马鲛的方法，具体操作为：提取待测物的基因组dna为模板，用所述试剂盒进行实时荧光pcr扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
19.上述检测鱼肉制品中蓝点马鲛的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，能够快速准确的从众多鱼肉中检测出蓝点马鲛，实用价值较高。
20.优选的，所述实时荧光pcr扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，探针1μl，dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，所述探针的浓度为10μmol/l，所述dna模板的浓度为100ng/μl。
21.优选的，所述实时荧光pcr扩增的条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环。
22.上述优选的反应条件可进一步提高蓝点马鲛的检测效率。
23.本发明提供的用于蓝点马鲛检测的引物和探针组合，具有特异性强、灵敏度高的优点，可以快速鉴别出鱼肉制品中是否含有蓝点马鲛，对于防止敏感人群食入含蓝点马鲛鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义，并且能够从含有多种鱼源性成分的鱼肉制品中特异性扩增出蓝点马鲛的dna，为鉴定蓝点马鲛制品真伪提供了有效手段，填补了蓝点马鲛检测的空白，在鱼肉制品检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
24.图1是本发明实施例2中以cytb基因设计的引物(f1/r1)和探针(p1)的特异性检测结果，其中，1：蓝点马鲛；2：蓝圆鰺；3：鲅鱼；4：青干金枪鱼；5：鳕鱼；6：沙丁鱼；7：日本鲭；8：低眼巨鲶；9：虹鳟；10：鲤鱼；11：鲶鱼；12：秋刀鱼；13：罗非鱼；14：河豚鱼(红鳍)；15：鲣鱼；16：竹筴鱼；17：巴沙鱼；
25.图2是本发明实施例2中以cytb基因设计的引物(f2/r2)和探针(p2)的特异性检测结果，其中，1：蓝点马鲛；2：蓝圆鰺；3：鲅鱼；4：青干金枪鱼；5：鳕鱼；6：沙丁鱼；7：日本鲭；8：低眼巨鲶；9：虹鳟；10：鲤鱼；11：鲶鱼；12：秋刀鱼；13：罗非鱼；14：河豚鱼(红鳍)；15：鲣鱼；
16：竹筴鱼；17：巴沙鱼；
26.图3是本发明实施例3中实时荧光pcr方法的灵敏度试验结果图；其中，1的模板浓度为1.0
×
105pg/μl，2的模板浓度为1.0
×
104pg/μl，3的模板浓度为1.0
×
103pg/μl，4的模板浓度为1.0
×
102pg/μl，5的模板浓度为1.0
×
101pg/μl，6的模板浓度为1.0
×
10-1
pg/μl，7的模板浓度为1.0
×
10-2
pg/μl。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.实施例1
29.1.材料与方法
30.1.1材料
31.蓝点马鲛、鳕鱼、秋刀鱼、日本鲭、蓝圆鰺、沙丁鱼、青干金枪鱼、低眼巨鲶、虹鳟、鲤鱼、鲶鱼、鲅鱼、罗非鱼、河豚鱼(红鳍)、鲣鱼、竹筴鱼、巴沙鱼，均由本实验室保存。
32.dna提取试剂盒wizard genomic dna purification kit和2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix，购于北京全式金生物技术股份有限公司；引物和探针由上海捷瑞生物科技有限公司合成。
33.混合型球磨仪mm400，购于德国莱驰公司；nanodrop 2000c超微量分光光度计，购于美国thermo scientific公司；abi 7500实时荧光pcr仪，购于美国abi公司。
34.1.2方法
35.1.2.1引物和探针的设计
36.蓝点马鲛与其他同属物种的基因序列同源性较高，根据线粒体设计引物探针较为困难，设计得到的多组引物和探针的扩增结果都不理想，同属物种间的扩增特异性较差，无法准确的检测出蓝点马鲛。
37.在蓝点马鲛线粒体细胞色素b(cytb)基因序列的基础上，选择其中的特区域设计引物和探针，如表1所示。
38.表1引物和探针
[0039][0040][0041]
其中，75bp的cytb基因扩增片段的碱基序列如下：
[0042]
catcgaatccgccttcaactcagttgcccacatctgccgggatgttaacttcggatgactcatccgaaacctcca(seq id no:7)。
[0043]
63bp的cytb基因扩增片段的碱基序列如下：
[0044]
aacaacgagggcttacatttcggccaatctcccagttcttattctgaaccctcatcgcagacg(seq id no:8)。
[0045]
1.2.2.样品处理和基因组dna的提取
[0046]
取鱼肉放于料理机中制成肉泥，于65℃烘箱中放置16h烘干，然后放于球磨仪中研磨成粉末，过60目筛，于4℃密封保存，不同样品的制备过程中应该避免交叉污染。
[0047]
称取蓝点马鲛、鳕鱼、秋刀鱼、日本鲭、蓝圆鰺、沙丁鱼、青干金枪鱼、低眼巨鲶、虹鳟、鲤鱼、鲶鱼、鲅鱼、罗非鱼、河豚鱼(红鳍)、鲣鱼、竹筴鱼、巴沙鱼肉粉样本，每份样本总量为50mg，参照美国promega公司wizard genomic dna purification kit试剂盒操作说明，进行肉粉样品基因组dna的提取，使用nanodrop 2000c超微量分光光度计测定dna浓度，-20℃保存备用。
[0048]
1.2.3实时荧光pcr方法的建立
[0049]
上述试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、perfectstart ii probe qpcrsupermix和ddh2o。
[0050]
以提取的蓝点马鲛基因组dna为模板，配制25μl反应体系：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物(10μmol/l)1μl，下游引物(10μmol/l)1μl，探针(10μmol/l)1μl，模板dna(100ng/μl)1μl，ddh2o补足至25μl。
[0051]
采用实时荧光pcr对上述反应体系进行扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。
[0052]
实施例2
[0053]
引物特异性检测：
[0054]
以提取的蓝点马鲛、鳕鱼、秋刀鱼、日本鲭、蓝圆鰺、沙丁鱼、青干金枪鱼、低眼巨鲶、虹鳟、鲤鱼、鲶鱼、鲅鱼、罗非鱼、河豚鱼(红鳍)、鲣鱼、竹筴鱼、巴沙鱼基因组dna为模板，ddh2o为空白对照，分别以实施例1中设计的两组引物和探针组合，按照实施例1中1.2.3部分的条件进行实时荧光pcr检测，根据典型扩增曲线和反应体系循环阀(ct)值的不同确定最佳的引物探针组合。结果如图1-图2所示。
[0055]
结果显示，空白对照未出现扩增，说明反应体系未受到污染。图1中可以看出，以cytb基因设计的引物(f1/r1)和探针(p1)，蓝圆鰺、鲅鱼和青干金枪鱼均有扩增，说明该引物和探针对蓝点马鲛不具有特异性。而图2中，以cytb基因设计的引物(f2/r2)和探针(p2)特异性好，只有蓝点马鲛基因组dna出现典型的“s”型扩增曲线，而鳕鱼、秋刀鱼、日本鲭、蓝圆鰺、沙丁鱼、青干金枪鱼、低眼巨鲶、虹鳟、鲤鱼、鲶鱼、鲅鱼、罗非鱼、河豚鱼(红鳍)、鲣鱼、竹筴鱼、巴沙鱼等其它物种均无扩增曲线，表明所建立的实时荧光pcr方法具有良好的特异性。综上所述，本发明选择以cytb基因设计的引物(f2/r2)和探针(p2)。
[0056]
实施例3
[0057]
灵敏度试验：
[0058]
将提取的蓝点马鲛基因组dna浓度稀释至1.0
×
105pg/μl，进行10倍倍比稀释至1.0
×
10-2
pg/μl，以1μl不同浓度的基因组dna作为模板，采用实施例1中1.2.3部分的试剂盒进行实时荧光pcr检测，每次试验设3个平行，检测结果如图3所示。
[0059]
结果显示，当反应体系中模板量为10pg时，出现典型扩增曲线，ct值为34.68；当反应体系中模板量低于10pg时，均没有出现扩增曲线，表明本发明所建立的蓝点马鲛实时荧光pcr方法的灵敏度为10pg/μl。
[0060]
以蓝点马鲛基因组dna浓度(pg/μl)的对数值为横坐标，以ct值为纵坐标，建立二者的线性关系，得到的线性回归方程为：y＝-4.15x+42.08，r2＝0.998，扩增效率为1.05。由此可知，本技术提供的引物和探针组合、试剂盒对检测鱼肉制品中的蓝点马鲛检测具有较高的灵敏度。
[0061]
实施例4
[0062]
市售鱼肉制品的检测：
[0063]
从不同超市和集贸市场购买不同品牌的烤鱼片、鱼肉肠、鱼罐头、鲜烤马鲛等鱼肉制品，共计52份，根据实施例1中1.2.2中公开的样品处理和基因组dna的提取方法进行提取，然后采用实施例1中1.2.3中所述的试剂盒进行实时荧光pcr荧光检测。
[0064]
实时荧光pcr的反应体系为：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物(10μmol/l)1μl，下游引物(10μmol/l)1μl，探针(10μmol/l)1μl，模板dna(100ng/μl)1μl，ddh2o补足至25μl。采用实时荧光pcr对上述反应体系进行扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。每次试验设2个平行。
[0065]
表2鱼肉制品中蓝点马鲛检测结果
[0066][0067][0068]
结果显示：其中3份样品出现典型的“s”型扩增曲线，表明其含有蓝点马鲛，样品的c
t
值在20.35-25.46之间，如表2所示。其余样品未检出蓝点马鲛。
[0069]
综上所述，本发明通过设计的引物和探针组合，建立了一种针对蓝点马鲛的实时荧光pcr检测方法，该方法的特异性强、灵敏度高、最低检测限可达10pg/μl，准确度好，能够快速准确的从所有亲缘近似种和生态近似种中检测出蓝点马鲛，对蓝点马鲛的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：上游引物-f：5
′‑
aacaacgagggcttacatttcg-3
′
,下游引物-r：5
′‑
cgtctgcgatgagggttca-3
′
；所述探针p的序列为：5
′‑
caatctcccagttctt-3
′
。2.如权利要求1所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5
′
端标记有荧光素，3
′
端标记有荧光猝灭基团。3.如权利要求2所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合，其特征在于，所述荧光素为fam，所述荧光猝灭基团为mgb-nfq。4.如权利要求3所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合，其特征在于，所述探针p为：5
′‑
fam-caatctcccagttctt-mgb-nfq-3
′
。5.权利要求1-4任一项所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中蓝点马鲛中的应用。6.一种用于检测蓝点马鲛的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的用于检测蓝点马鲛的实时荧光pcr引物和探针组合。7.如权利要求6所述的用于检测蓝点马鲛的试剂盒，其特征在于，还包括perfectstart ii probe qpcr supermix和ddh2o。8.利用权利要求6或7所述的试剂盒检测鱼肉制品中蓝点马鲛的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组dna为模板，用所述试剂盒进行实时荧光pcr扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。9.如权利要求8所述的检测鱼肉制品中蓝点马鲛的方法，其特征在于：所述实时荧光pcr扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，探针1μl，dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，所述探针的浓度为10μmol/l，所述dna模板的浓度为100ng/μl。10.如权利要求8所述的检测鱼肉制品中蓝点马鲛的方法，其特征在于：所述实时荧光pcr扩增的条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，具体公开一种用于检测蓝点马鲛的实时荧光PCR引物和探针组合以及试剂盒。所述检测蓝点马鲛的引物和探针中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明通过设计的引物和探针组合，建立了一种针对蓝点马鲛的实时荧光PCR检测方法，该方法的特异性强，能够快速准确的从所有亲缘近似种和生态近似种中检测出蓝点马鲛，且灵敏度高、最低检测限可达10pg/μL，准确度好，对蓝点马鲛的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。全保障具有重要的意义。全保障具有重要的意义。


技术研发人员：王建昌 刘立兵 项佳林 王金凤 艾连峰 孙晓霞
受保护的技术使用者：石家庄海关技术中心
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/7/27