含有莪术油和冰片的药物组合物的用途的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及含有莪术油和冰片的药物组合物的用途。
技术背景
2.冠状病毒在系统分类上属冠状病毒属(coronavirus)，冠状病毒是具有包膜的正链rna病毒。2003年严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,sars)和2012年中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome,mers)的爆发，冠状病毒逐渐成为病毒学领域的一个研究热点。新型冠状病毒肺炎(corona virus disease2019)为新发急性呼吸道传染病，由sars-cov-2(又称2019-ncov)引发。2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ictv)宣布，2019新型冠状病毒(2019-ncov)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，sars-cov-2)。同日，世界卫生组织(who)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为covid-19。2020年和2021年时，sars-cov-2感染的症状主要以肺炎为主，依据病情的轻重程度可分为单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合症、脓毒症、脓毒症休克等。
3.新冠状病毒感染可给予一般治疗、抗病毒治疗、免疫治疗等。1、一般治疗：如果新型冠状病毒感染的患者属于无症状感染或者轻症感染，通常不采取特殊的治疗，可以选择居家隔离，而且还要多饮水，多注意休息，饮食上要多摄入蛋白质以及维生素含量较丰富的食物，能够增强机体的抗病能力，有助于疾病恢复。2、抗病毒治疗：如果新型冠状病毒感染后出现了咽痛或者是流鼻涕的症状，就要在医生的指导下给予抗病毒的药物，比如利巴韦林片、利托那韦片、阿兹夫定片等。3、免疫治疗：如果是重症或者是危重症的患者，同时还要配合免疫治疗，比如托珠单抗注射液、静注covid-19人免疫球蛋白等。此外，还可给予止咳治疗、止吐治疗等。新型冠状病毒感染的患者治疗期间，需要多做核酸检测，主要是了解病毒的转阴情况。
4.保妇康栓是由原料莪术油和冰片制备的外用制剂，临床上用于湿热瘀滞所致的带下病，症见带下量多、色黄、时有阴部瘙痒；霉菌性阴道炎、老年性阴道炎、宫颈糜烂见上述证候者。近年来，经过研究证明保妇康栓对于hpv感染也具有一定的作用。
5.无论是从经济效益来说还是从保护民众安全的角度来说，研制新的、安全的、具有广谱性、高稳定性抗新冠病毒药物有着极为重要的作用。
6.通过检索，尚未发现莪术油与冰片。


技术实现要素：

7.基于上述原因，申请人在研究过程中，意外发现莪术油和冰片组成的药物组合物，具有抗新型冠状病毒的作用，继而能够对于新冠病毒感染的系统疾病具有治疗作用。经过研究表明：作用48小时保妇康栓对于非洲绿猴肾细胞系(vero-e6)未见明显的抑制作用，其cc
50
值为254.7μg/ml。保妇康栓在160μg/ml及80μg/ml时，对于新冠病毒的抑制率大于50％；
在第三次实验中，保妇康栓160μg/ml对于新冠病毒的抑制率为81％，提示保妇康栓对新冠病毒有一定的抑制作用。
8.本发明通过下述技术方案实现的。
9.含有莪术油和冰片的药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用。
10.含有莪术油和冰片的药物组合物在制备治疗新型冠状病毒感染导致的人体器官产生疾病的药物中应用。
11.其中莪术油和冰片为原料制备成药物制剂。
12.其中所述的药物制剂包括口服制剂和外用制剂。
13.其中所述的药物制剂包括呼吸道给药制剂。
14.其中所述的药物制剂包括：喷雾剂、气雾剂、漱口剂、含漱液或鼻喷剂。
15.其中所述的药物制剂包括：片剂、胶囊剂、栓剂或凝胶剂。
16.其中莪术油和冰片的重量份为：莪术油20-1200重量份、冰片为1-920重量份。
17.其中莪术油与冰片的重量份为：莪术油82重量份，冰片75重量份。
18.本发明所述的莪术油：莪术油(zedoaryturmericoil)是从莪术干燥根茎中提取的挥发油，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗菌等作用。莪术油中含有吉马酮、莪术二酮、新莪术二酮、莪术醇、莪术烯等二十多种成分。目前国内己批准上市的莪术油产品有注射剂、滴眼剂、栓剂、软胶囊、喷雾剂等，其中莪术油葡萄糖注射液临床应用最为广泛，主要用于呼吸系统疾病、消化系统疾病、癌症、心脑血管疾病、生殖系统和皮肤病。
19.本发明所述冰片：冰片，又名片脑、桔片、艾片、龙脑香、梅花冰片、羯布罗香、梅花脑、冰片脑、梅冰等，是由菊科艾纳香茎叶或樟科植物龙脑樟枝叶经水蒸汽蒸馏并重结晶而得。化学成分为2-茨醇，化学式是c
10h18
o。
20.本发明所述的新型冠状病毒：2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ictv)宣布，2019新型冠状病毒(2019-ncov)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，sars-cov-2)。
21.本发明所述的口服制剂包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂等。
22.本发明所述的口服制剂包括但不限于缓释制剂：缓释片剂、缓释胶囊剂、缓释颗粒剂等等。
23.本发明所述的呼吸道给药制剂包括但不限于：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。
24.本发明所述的药物制剂还包括但不限于：漱口剂、含漱液或鼻喷剂。
25.本发明所述的药物制剂还包括但不限于：皮肤给药剂型：如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等。
26.本发明所述的药物制剂包括但不限于：粘膜给药剂型：如滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、眼用凝胶剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂等。
27.本发明所述的药物制剂包括但不限于：腔道给药剂型：如栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂等，用于直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等。
28.本发明所述的新型冠状病毒感染导致的人体器官产生疾病包括但不限于：呼吸道感染、肺炎、血栓类疾病、腹泻等等。
29.本发明有益的技术效果：
30.1、提供了一种新的抗新型冠状病毒的药物，即以莪术油和冰片为原料的药物组合物，该药物组合物是现有技术保妇康栓的活性原料。
31.2、本发明通过试验验证了保妇康栓活性原料莪术油和冰片，具有抗新冠病毒的作用，继而有治疗新冠病毒导致的系统疾病。
32.3、新型冠状病毒是一种新型病毒，到目前为止，该病毒感染人类，还需要人类通过调节身体免疫力去抵抗病毒或病毒感染，本发明为临床提供了一种新的治疗药物。
33.4、通过抗新冠病毒试验研究，以莪术油和冰片为活性成分药物制剂，对细胞几乎没有损伤，对于新冠病毒具有很好的抑制作用。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
35.项目名称：保妇康栓体外抗病毒研究(sars-cov-2实验结果)
36.原始资料保存地：武汉大学absl-iii实验室
37.本实验严格遵照美国国家临床实验室标准化委员会(clinical and laboratory standards institute clsi,即原nccls)和中华人民共和国国家药品监督管理局药品审评中心发布的新型冠状病毒中和抗体类药物非临床研究技术指导原则(试行)的规定执行，本报告真实、准确地反映了实验结果。
38.实验目的：在体外进行抗病毒实验研究，探讨保妇康栓对新型冠状病毒(sars-cov-2)的抑制作用，为后期保妇康栓的药效研究提供参考。
39.实验方法：
40.细胞毒检测
41.将96孔板中过夜贴壁的非洲绿猴肾细胞(vero-e6)进行培养，用dmem配置不同浓度的保妇康栓，在37℃co2培养箱中培养48h后，每孔加入100μl cck8，继续培养1h，用酶标仪在450nm处测吸光值。计算6个复孔的od平均值及标准误差，计算保妇康栓对于非洲绿猴肾细胞的cc
50
值。
42.sars-cov-2抗病毒实验
43.将96孔板中过夜贴壁的非洲绿猴肾细胞进行培养，将保妇康栓溶液用dmem培养基稀释成实验所需浓度，加入弃上清液的培养板中，每孔180μl，每个浓度重复4孔，置于细胞培养箱中37℃，5％ co2预处理2h；预处理结束后，用基础dmem稀释的病毒加入弃去培养基的细胞培养孔中，孵育1h后弃病毒液，细胞用pbs洗涤2遍后；再用保妇康栓溶液按之前稀释浓度加入培养孔中，每孔250μl，每个浓度重复4孔，置于细胞培养箱中37℃，5％ co2培养48h；同时设立抗病毒阳性药物对照细胞孔(加病毒，加对照药物瑞德西韦1μm，加2％dmem)，病毒对照孔(不加药，加病毒，加2％dmem)和空白对照孔(不加病毒不加保妇康栓溶液，只加2％dmem)，每组有4个复孔；48h后取100μl培养上清液加入装有400μl trizol ls的旋盖样品管中混匀，然后取200μl混合液用病毒dna/rna提取试剂盒提取rna；将病毒rna先反转录为cdna，然后用荧光定量pcr反应检测样品中的病毒含量，按pcr半定量方法计算抑制率，再
用统计学方法计算ic50值。
44.实验结果：作用48小时保妇康栓对于非洲绿猴肾细胞系(vero-e6)未见明显的抑制作用，其cc
50
值为254.7μg/ml。保妇康栓在160μg/ml及80μg/ml时，对于新冠病毒的抑制率大于50％；在第三次实验中，保妇康栓160μg/ml对于新冠病毒的抑制率为81％，提示保妇康栓对新冠病毒有一定的抑制作用。
45.实验结论：按照试验结果计算，保妇康栓在48h对非洲绿猴肾细胞的细胞毒性浓度cc
50
为254.7μg/ml；在160μg/ml及80μg/ml时，对于新冠病毒的抑制率大于50％；结果表明保妇康栓对于新冠病毒有一定的抑制作用。
46.材料和方法
47.受试物
48.名称：保妇康栓
49.规格：1.74g/粒
50.批号：20210319
51.生产日期：2021/03/25
52.有效期至：2023/03/24
53.包装形式：铝箔包装，8粒/盒
54.保存条件：密闭，避光，在30℃以下保存
55.提供单位：海南碧凯药业有限公司
56.样品配置：将一颗保妇康栓剂溶于44ml基础dmem培养基中使其终浓度为39.5mg/ml，完全溶解后混匀，用0.22μm滤网过滤，4℃保存。
57.防护措施：常规(口罩、手套、工作服)
58.样品配制：用pbs配制成所需浓度的溶液。
59.名称：瑞德西韦(remdesivir)
60.规格：5mg/瓶
61.批号：146400
62.性状：白色粉末
63.保存条件：-20℃保存
64.来源：medchemexpress
65.样品配置：用dmso溶解后，制备成10mm母液。无菌分装，-80℃保存，使用时用相应溶液稀释。
66.防护措施：常规(口罩、手套、工作服)。
67.样品配制：用pbs配制成所需浓度的溶液。
68.主要实验试剂
69.主要实验试剂如下表：
70.表1主要实验试剂
[0071][0072]
实验细胞系：非洲绿猴肾细胞系(vero,vero-e6)，武汉大学病毒学国家重点实验室保存。
[0073]
新型冠状病毒sars-cov-2
[0074]
实验用sars-cov-2omicron ba.2变种病毒毒株编号ba2-hb0000513，病毒批号：2021.12.02，武汉大学病毒学国家重点实验室保存。
[0075]
qpcr引物
[0076]
表2qpcr引物
[0077][0078]
实验仪器
[0079]
表3试验仪器
[0080][0081]
实验方法
[0082]
细胞毒检测
[0083]
将实验所用细胞复苏培养至10cm培养皿长满，用0.25％胰酶消化，计数后铺入96孔板中，待第二天使用。
[0084]
细胞贴壁过夜后，细胞单层覆盖长至70％，将保妇康栓溶液(39.5mg/ml)用含2％血清的dmem培养基稀释至640μg/ml作为初始浓度，再对倍稀释，共8组浓度梯度，每组6平行对照孔，另设置空白不加药组以及空白实验组(不加药，没有细胞)同样每组6平行对照孔。
[0085]
将稀释好的保妇康栓溶液每孔100μl换液加入96孔板中，空白不加药组和空白实验组则加入同体积的含2％血清的dmem培养基，将换好液的培养板转入37℃，5％co2培养箱中培养。
[0086]
培养48小时后，弃去上清液，每孔加入100μlcck8溶液37℃，5％co2培养箱中孵育1小时。
[0087]
孵育1h后，选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围，并计算药物的cc50值。
[0088]
sars-cov2抗病毒实验
[0089]
经24-48h培养的细胞(vero-e6)基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至48孔无菌细胞培养板中，每孔200μl(0.4
×
105cell/ml)，置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层；
[0090]
将保妇康栓溶液用2％ dmem培养基逐倍稀释成实验所需的六个浓度梯度(160，80，40，20，10，5μg/ml)，加入弃上清液的培养板中，每孔180μl，每个浓度重复4孔，置于细胞培养箱中37℃，5％ co2预处理2h；
[0091]
预处理结束后将用基础dmem稀释的病毒加入弃去培养基的细胞培养孔中，孵育1h后弃病毒液，细胞用pbs洗涤2遍后；
[0092]
再用保妇康栓溶液按之前浓度(160，80，40，20，10，5μg/ml)加入培养孔中，每孔250μl，每个浓度重复4孔，置于细胞培养箱中37℃，5％ co2培养48h；
[0093]
同时设立抗病毒阳性药物对照细胞孔(加病毒，加对照药物瑞德西韦1μm，加2％dmem)，病毒对照孔(不加药，加病毒，加2％dmem)和空白对照孔(不加病毒不加保妇康栓溶液，只加2％dmem)，每组有4个复孔；
[0094]
48h后取100μl培养上清液加入装有400μl trizol ls的旋盖样品管中混匀，然后取200μl混合液用病毒dna/rna提取试剂盒提取rna；
[0095]
将病毒rna先反转录为cdna,然后用荧光定量pcr反应检测样品中的病毒含量，按pcr半定量方法计算抑制率，再用统计学方法计算ic50值。
[0096]
数据统计
[0097]
数据以百分率％表示。统计学分析除病理学评分采用kruskal-wallis检验进行(其中组间比较采用dunn’s检验)，其它分析均应用方差分析进行(组间比较采用tukey或fisher’s lsd检验)。
[0098]
实验结果
[0099]
细胞毒检测结果
[0100]
如表4所示，作用48小时保妇康栓对于非洲绿猴肾细胞系(vero,vero-e6)未见明显的抑制作用，其cc50值为254.7μg/ml，提示保妇康栓对于非洲绿猴肾细胞无明显的抑制
作用。
[0101]
表4保妇康栓对于vero-e6的cc50值
[0102][0103]
sars-cov-2抗病毒实验
[0104]
如表5所示，作用48小时保妇康栓对于新冠病毒sars-cov-2有一定的抑制作用，其在160μg/ml及80μg/ml时，对于新冠病毒的抑制率大于50％；在第三次实验中，保妇康栓160μg/ml对于新冠病毒的抑制率为81％，提示保妇康栓对新冠病毒有一定的抑制作用。瑞德西韦在1μm时其对于新冠病毒的抑制率为100％。
[0105]
表5保妇康栓对于新冠病毒sars-cov-2感染的抑制作用
[0106][0107]
结论
[0108]
按照试验结果计算，保妇康栓在48h对非洲绿猴肾细胞的细胞毒性浓度cc50为254.7μg/ml；在160μg/ml及80μg/ml时，对于新冠病毒的抑制率大于50％；结果表明保妇康栓对于新冠病毒有一定的抑制作用。
[0109]
现有技术中虽然有报道保妇康栓有抗hpv(人乳头瘤病毒)的作用，但：(1)人乳头瘤病毒与新型冠状病毒是绝对不同的病毒，二者病毒感染后引发的疾病也不同。(2)在新型冠状病毒依然还在流行的现在，广大医药工作者依然在寻找能够抑制这种病毒的产品，包括但不限于现在已经上市的药物，这些药物虽然都具有抗不同的病毒的作用，但对于新型冠状病毒依然没有作用，这充分说明，对于抗新型冠状病毒的研究，需要进行充分研究。(3)上述抗新型冠状病毒研究，是在多次创造性研究的基础上，对于本技术做出的结论性试验研究，用以确定莪术油和冰片为活性成分的药物能够抑制新型冠状病毒，这种抗病毒的结论，不是本领域的技术人员能够简单的确定的，即上述试验是需要通过创造性的劳动才能够获得的。
[0110]
制备实施例
[0111]
实施例1
[0112]
药物活性原料包括：莪术油20g、冰片为920g。
[0113]
实施例2
[0114]
药物活性原料包括：莪术油1200g、冰片为1g。
[0115]
实施例3
[0116]
药物活性原料包括：莪术油20g、冰片为1g。
[0117]
实施例4
[0118]
药物活性原料包括：莪术油1200g、冰片为920g。
[0119]
实施例5
[0120]
药物活性原料包括：莪术油82g、冰片为75g。
[0121]
实施例6
[0122]
药物活性原料包括：莪术油25g、冰片为1.5g。
[0123]
实施例7
[0124]
药物活性原料包括：莪术油1180g、冰片为915g。
[0125]
实施例8
[0126]
药物活性原料包括：莪术油50g、冰片为905g。
[0127]
实施例9
[0128]
药物活性原料包括：莪术油1080g、冰片为50g。
[0129]
实施例10
[0130]
药物活性原料包括：莪术油185g、冰片为120g。
[0131]
实施例11
[0132]
药物活性原料包括：莪术油575g、冰片为690g。
[0133]
实施例12
[0134]
药物活性原料包括：莪术油1100g、冰片为890g。
[0135]
实施例13
[0136]
药物活性原料包括：莪术油1070g，冰片807g。
[0137]
实施例14
[0138]
药物活性原料包括：莪术油785g，冰片785g。
[0139]
实施例15
[0140]
药物活性原料包括：莪术油435g，冰片885g。
[0141]
上述药物活性原料可以制备成药物制剂。
[0142]
本发明所述的口服制剂包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂等；
[0143]
本发明所述的口服制剂包括但不限于缓释制剂：缓释片剂、缓释胶囊剂、缓释颗粒剂等等；
[0144]
本发明所述的呼吸道给药制剂包括但不限于：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。
[0145]
本发明所述的药物制剂还包括但不限于：漱口剂、含漱液或鼻喷剂；
[0146]
本发明所述的药物制剂还包括但不限于：皮肤给药剂型：如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等；
[0147]
本发明所述的药物制剂包括但不限于：粘膜给药剂型：如滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂等；
[0148]
本发明所述的药物制剂包括但不限于：腔道给药剂型：如栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂等，用于直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等；
[0149]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.含有莪术油和冰片的药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用。2.含有莪术油和冰片的药物组合物在制备治疗新型冠状病毒感染导致的人体器官产生疾病的药物中应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中莪术油和冰片为原料制备成药物制剂。4.根据权利要求3所述的应用，其中所述的药物制剂包括口服制剂或外用制剂。5.根据权利要求3所述的应用，其中所述的药物制剂包括呼吸道给药制剂。6.根据权利要求3所述的应用，其中所述的药物制剂包括：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、漱口剂、含漱液或鼻喷剂。7.根据权利要求3所述的应用，其中所述的药物制剂包括：散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。8.根据权利要求1或2所述的应用，其中莪术油和冰片的重量份为：莪术油20-1200重量份、冰片为1-920重量份。9.根据权利要求1或2所述的应用，其中莪术油与冰片的重量份为：莪术油82重量份，冰片75重量份。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及含有莪术油和冰片的药物组合物的用途，更进一步是含有莪术油和冰片的药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用；以及含有莪术油和冰片的药物组合物在制备治疗新型冠状病毒感染导致的人体器官产生疾病的药物中应用。药物中应用。


技术研发人员：徐朗 康晓飞
受保护的技术使用者：海南回元堂药业有限公司
技术研发日：2023.01.13
技术公布日：2023/7/26